Summary
Cette méthode pour isoler les cellules immunitaires fonctionnelles du cœur offre une alternative aux méthodes classiques de digestion à la collagénase, ce qui provoque l'activation des cellules immunitaires indésirables, résultant en une diminution de la réactivité de ces cellules. Notre méthode d'isolement des rendements fonctionnelle cardiaque des cellules immunitaires en évitant les problèmes liés à la digestion enzymatique.
Abstract
Cardiaque des cellules immunitaires sont de plus d'intérêt pour les rôles qu'ils jouent dans le remodelage pathologique dans de nombreuses maladies cardiaques 1-5 Ces cellules immunitaires, qui comprennent les mastocytes, les cellules T et les macrophages;. Stocker et libérer une variété de médiateurs biologiquement actifs incluant des cytokines et des protéases telles que la tryptase 6-8. Ces médiateurs ont été montré à être des acteurs clé dans le métabolisme de la matrice extracellulaire par l'activation de métalloprotéases matricielles ou de causer une accumulation de collagène par les fibroblastes de moduler la fonction cardiaque ". 9-11 Cependant, les techniques disponibles pour isoler les cellules immunitaires ont cardiaques été problématique, car ils utilisent la collagénase bactérienne à digérer le tissu myocardique. Cette technique provoque une activation des cellules immunitaires et donc une perte de fonction. Par exemple, les mastocytes cardiaques deviennent beaucoup moins sensibles aux composés qui causent la dégranulation. 12 C'est pourquoi, nous avons développé une technique qui permet de tIl isolement des cellules immunitaires fonctionnelles cardiaques qui conduirait à une meilleure compréhension du rôle de ces cellules dans la maladie cardiaque. 13, 14
Cette méthode requiert une certaine familiarité avec la localisation anatomique de la xiphoïde du rat processus, l'aisselle et ligament falciforme, et le péricarde du cœur. Ces repères sont importants pour accroître la réussite de la procédure et d'assurer un rendement plus élevé de cellules immunitaires cardiaques. Ces cellules immunitaires isolés cardiaques peuvent alors être utilisées pour la caractérisation de fonctionnalité, de phénotype, de maturité et de co-culture des expériences avec d'autres cellules cardiaques d'acquérir une meilleure compréhension de leurs interactions.
Protocol
1. Préparation de la solution de Hanks équilibre salin (HBSS)
- Autoclave 1 bécher L, 1000 ml graduée, et remuez-bar.
- Reconstituer la solution en poudre dans l'autoclave HBSS 1 bécher en verre L pour la marque 900 ml d'eau bidistillée.
- Mélanger une solution HBSS avec 3,4 g de Hepes Na + sel et ajuster le pH à une valeur comprise entre 7,35 à 7,41 en utilisant soit concentrée HCl ou NaOH.
- Une fois le pH souhaité a été atteint et reste stable, ajouter 5 g de sérum albumine bovine à la solution à température ambiante jusqu'à ce que l'albumine soit complètement dissoute.
- Ajouter 10 ml de l'eau aux antibiotiques, antimyotic, à la solution et une double distillation jusqu'à ce que le volume total est de 1000 marque ml.
- Remuez bien la solution.
- Filtrer la solution HBSS et le séparer en tubes de 50 ml Falcon pour une utilisation ultérieure. Tubes supplémentaires peuvent être congelés et utilisés à une date ultérieure.
2. Animaux PRÉPARATIOn - Insertion de sonde trachéale
- Préparer un plateau avec des instruments et du matériel nécessaire pour l'insertion d'un tube trachéal (forceps à savoir, des ciseaux, un tube trachéal, 3-0 suture tressé noir, ventilateur de petits animaux, etc.)
- Une fois que le rat est totalement anesthésié avec un cocktail kétamine / xylazine dans le ratio de 2 à 1 kétamine xylazine, raser l'abdomen, la poitrine et la gorge du rat. Afin de s'assurer que un état de profonde anesthésie a été réalisée, pincement de l'orteil du rat et de vérifier le retrait d'un membre de pédale. Assurez-vous que le rat est profondément anesthésié avant de prendre toutes les incisions.
- Placez le rat avec sa tête a grandi sur une planche à découper qui est incliné à un angle de 30 °
- Faire une incision cutanée de la milieu de l'abdomen au-dessous de la mâchoire inférieure. Disséquer l'écart des muscles du triangle antérieure du cou pour exposer la trachée.
- Placer une suture 3-0 tressé noir dans la trachée.
- Faire une incision dans la trachée entre les anneaux cartilagineux uned insérer le tube trachéal. Attachez solidement le fil de suture pour sécuriser le tube trachéal à la trachée.
- Connecter le tube trachéal à un ventilateur de petits animaux.
3. Préparation instrument d'isolement des cellules immunitaires
- Préparer un plateau avec les instruments de la procédure d'isolement des cellules immunitaires (ie pince, ciseaux, HBSS, parés douce Téflon de calibre 24 Baxter intravasculaire sur l'aiguille rapidement-cath)
- Préparer deux seringues 10cc, remplir une seringue avec HBSS pour l'introduction du tampon dans le péricarde et la réserve l'autre pour aspirer les cellules HBSS contenant.
3.2.1. Réduire la pointe en Teflon de l'calibre 24 Baxter intravasculaire sur l'aiguille rapidement-cath (1,6 cm) par 1 / 2-3 / 4 de sa longueur initiale de la procédure d'isolement.
- Placez toutes les seringues, les tampons, et un vide 15 ml Falcon tube (pour maintenir le liquide extrait une fois la procédure est terminée) sur la glace.
- Faire une incision médiane de la paroi abdominale (le long de la ligne blanche) jusqu'à la pointe du sternum.
- Démarrage légèrement latéralement au processus xiphoïde, faire des incisions bilatérales à travers la cage thoracique poursuit à un angle vers l'aisselle. Soyez prudent de ne pas perforer les poumons, le cœur, ou du péricarde.
- Une fois que les incisions des deux côtés du sternum sont complets, disséquer l'écart du diaphragme du bas des côtes, découpe dehors en dedans.
Note: Soyez toujours conscients de l'endroit où le péricarde se connecte à la membrane et le sternum afin d'éviter des dommages. Utilisez le ligament falciforme comme un repère de noter où le péricarde est attaché sur le côté opposé de la membrane. Aussi, si le péricarde est coupé, la capacité à isoler les cellules sont perdues.
- Soulevez doucement d'un côté de la cage thoracique pour exposer la cavité thoracique et le cœur (toujours encapsulée par le péricarde).
- Prenez la seringue HBSS rempli et trouver un point dans le sac péricardique environ à mi-chemin entre le sternum et le cœur (de préférence plus rostrale que caudale) et insérez la pointe en Teflon de l'raccourcie rapide de cathétérisme à travers les deux couches du péricarde.
- Une fois le cathéter en place, procéder en douceur remplir l'espace péricardique avec 2 à 3 ml de tampon HBBS. Vous saurez immédiatement si le cathéter est bien placé quand vous remarquez l'espace péricardique expansion. Si aucun témoin de remplissage est, retirer et repositionner le quick-cath.
- Lorsque le sac péricardique est remplie, prenez l'autre seringue de 10 cc et placer la pointe de retour dans le péricarde et commencer l'aspiration de la mémoire tampon. Le trou d'entrée peut être utilisé même ou une autre peut être créé. Assurez-vous que la pointe ne viennent pas trop près de la parois du sac péricardique tout en offrant d'aspiration, en particulier sur la partie inférieure du cœur. Cela pourrait conduire à la perforation de la membrane péricardique et la perte de cellules contenant des celluless.
- Alors que l'aspiration de la mémoire tampon, l'extrémité du cathéter peut être déplacé à l'intérieur du sac péricardique afin de collecter des tampons autant que possible.
Remarque: Si, ce faisant, vous avez peu déchirer le péricarde et faire le trou au sommet du cœur plus grand que le trou d'origine, ne paniquez pas. Tant que le péricarde entoure encore assez de cœur, vous pouvez toujours effectuer un autre lavage sur le cœur mais avec une moindre quantité de mémoire tampon. Pour la collecte d'une quantité optimale de cellules, de trois à quatre lavages supplémentaires sont nécessaires.
- Placer le tampon extraites dans les tubes Falcon qui ont été placés sur la glace.
- Retirez le cœur, les poumons et / ou tout autre tissu si nécessaire pour poursuivre des études. Après la collecte de cellules immunitaires et d'autres tissus, le rat doit être rapidement et euthanasiés.
- Centrifuger les échantillons prélevés des cellules immunitaires pendant 10 min à 200g à 4 ° C. Toujours garder les tubes sur la glacelorsqu'il n'est pas utilisé.
- Enlever le surnageant et reconstituer le culot dans 1 mL de tampon ou de Hyclone HBSS.
Remarque: Il est important de compter le nombre de cellules immunitaires provenant de chaque coeur, après la procédure d'isolement des cellules immunitaires.
5. Les résultats représentatifs:
Un exemple de mastocytes cardiaques isolés obtenus avec cette technique et colorées avec du bleu de toluidine et la safranine O / bleu alcian sont présentées dans les figures 2A et 2B, respectivement. Comme on peut le voir dans la figure 3, le mât cardiaque, ont maintenu leur capacité à la libération d'histamine après traitement avec des activateurs connus comme composé 48/80 et la substance P comme décrit dans Morgan et al. 9 diagrammes de dispersion représentant de la cytométrie de flux des cellules CD4 + et Les cellules CD8 + sont présentés dans les figures 4 et 5, respectivement. Les lymphocytes T sont encore identifiées et phénotypés comme une population de cellules de cette technique.
Figure tableau de flux 1. De la procédure cardiaques de cellules immunitaires isolement.
. Figure 2 images représentant histologique des mastocytes cardiaques sont colorés comme suit: (A) avec le bleu de toluidine et (B) sont safranine O / bleu alcian.
Figure 3. L'étude fonctionnelle de mastocytes cardiaques isolées de la région épicardique du myocarde et stimulées avec composé 48/80 (10μg/mL) et la substance P (10 uM).
Figure 4. Représentant parcelles de cytométrie en flux de dispersion des cellules CD4 + isolés des cellules marquées avec la substance P (1:100 dilution).
Figure 5. Cytométrie de flux représentant des isolés CD8 + étiquetés avec la substance P (dilution 1:100).
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Discussion
Cette méthode d'isolement de cellules immunitaires cardiaques permet l'analyse de leur fonction, le phénotype et la maturité sans l'activation non désirée qui se produit généralement lors d'une technique traditionnelle digestion enzymatique isolement. Le nombre total moyen de cellules obtenues avec cette technique est d'environ 400.000 par cœur de rat, et une coloration différentielle et d'analyse de cytométrie en flux de ces cellules indique population mixte de lymphocytes T (~ 70%), les macrophages (~ 12%) et des mastocytes avec l'utilisation de cette technique. (~ 12%). 13, 14 Par conséquent, les méthodes de purification pour une nouvelle séparation des cardiaques populations de cellules immunitaires sont nécessaires. Isolé des cellules immunitaires peuvent être utilisés pour des applications multiples, y compris les études fonctionnelles, la cytométrie en flux, immunofluroescence, et des expériences de co-culture. Avec purification et d'expérimentation, ces cellules isolées de fournir un outil utile pour la compréhension du rôle du système immunitaire dans le processus de remodelage cardiaque.
Les rats ont été logés dans des conditions standard de l'environnement et maintenu sur le rat chow et commerciales du robinet ad libitum de l'eau. Toutes les études étaient conformes aux principes de la National Institutes of Health Guide pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par l'Université de Caroline du Sud, Animal Care Institution et le Comité d'utilisation. L'anesthésie au point final d'expérimentation a été touchée par un cocktail kétamine / xylazine à un ratio de 2 à 1 kétamine xylazine. Ceci est une procédure non-survie, qui permet l'utilisation d'instruments non stérilisés. Après l'isolement de cellules immunitaires et d'autres tissus désiré, le rat a été rapidement et euthanasiés selon l'American Veterinary Medical Association directrice sur l'euthanasie pour les rongeurs (par exemple exsanguination, luxation du rachis cervical, ou anesthésique surdosage).
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Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une bourse UNCF-Merck diplômé en sciences mémoire de recherche (JLM), National Heart, Lung, and Blood Institute subventions RO1-HL-62228 (JSJ) et RO1-HL-073990 (JSJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma-Aldrich | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water | |||
| Table of Specific Equipment: | |||
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 | |
References
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