Summary
Diese Methode zur Isolierung von funktionellen Immunzellen aus dem Herzen stellt eine Alternative zu den herkömmlichen Methoden der Kollagenaseverdau, die unerwünschten Immun-Zell-Aktivierung verursacht, was zu einer verminderten Reaktionsfähigkeit dieser Zellen. Unsere Methode der Isolierung ergibt funktionelle Herz-Immunzellen durch die Vermeidung von Problemen mit enzymatische Verdauung.
Abstract
Cardiac Immunzellen gewinnen Interesse für die Rollen, die sie spielen in den pathologischen Umbau in vielen Herzerkrankungen 1-5 Diese Immunzellen, die Mastzellen, T-Zellen und Makrophagen gehören,. Speicherung und Freisetzung einer Vielzahl von biologisch aktiven Mediatoren einschließlich Zytokine und Proteasen wie Tryptase. 6-8 Diese Mediatoren haben gezeigt, dass wichtige Akteure in der extrazellulären Matrix Stoffwechsel werden durch die Aktivierung Matrixmetalloproteinasen oder was Kollagenakkumulation durch Modulation der kardialen Fibroblasten-Funktion. 9-11 Allerdings haben verfügbaren Techniken zur Isolierung von Herz-Immunzellen problematisch, weil sie bakterieller Kollagenase, um das Herzmuskelgewebe verdauen verwenden. Diese Technik bewirkt eine Aktivierung der Immunzellen und somit zu einem Verlust der Funktion. Zum Beispiel, kardiale Mastzellen deutlich weniger auf Verbindungen, die Degranulation führen werden. 12 Darum entwickelten wir eine Technik, die für t erlaubtEr Isolation von funktionellen Herz-Immunzellen, die zu einem besseren Verständnis der Rolle dieser Zellen bei Herzerkrankungen führen würde. 13, 14
Diese Methode erfordert eine gewisse Vertrautheit mit der anatomischen Lage der Ratte Xiphoidbasis, Achselhöhle und Lig. falciforme und Perikard des Herzens. Diese Landmarken sind wichtig für den Erfolg des Verfahrens zu erhöhen und eine höhere Ausbeute an Herz-Immunzellen zu gewährleisten. Diese isolierten kardialen Immunzellen können dann für die Charakterisierung der Funktionalität, Erscheinungsbild, Reife und Co-Kultur-Experimente mit anderen Herzzellen zu einem besseren Verständnis ihrer Wechselwirkungen zu gewinnen verwendet werden.
Protocol
1. Vorbereitung Hanks 'Balance Salt Solution (HBSS)
- Autoclave 1 L Becherglas, absolvierte 1000 ml Zylinder und Rührstab.
- Bereiten Sie die HBSS Pulver Lösung im Autoklaven 1 L Becherglas auf die 900 mL Marke mit doppelt destilliertem Wasser.
- Mix HBSS-Lösung mit 3,4 g Hepes Na + Salz-und pH-Wert auf einen Wert zwischen 7,35-7,41 entweder mit konzentrierter HCL oder NaOH.
- Sobald der gewünschte pH erreicht ist und bleibt stabil, 5 g Rinderserumalbumin, um die Lösung bei Raumtemperatur, bis die Albumin vollständig gelöst ist.
- Fügen Sie 10 ml des Antibiotikums, antimyotic, um die Lösung und doppelt destilliertem Wasser, bis das Gesamtvolumen auf 1000 mL-Marke.
- Rühren Sie die Lösung gründlich.
- Filtern Sie die HBSS-Lösung und teilen ihn in 50 mL Falcon-Röhrchen für die spätere Verwendung. Weitere Rohre können eingefroren und verwendet werden zu einem späteren Zeitpunkt.
2. Tierische VORBEREITUn - Einfügen von Trachealtubus
- Bereiten Sie ein Tablett mit den erforderlichen Instrumenten und Materialien für das Einführen eines Trachealtubus (dh Zangen, Scheren, Trachealtubus, 3-0 schwarz, geflochten, Kleintier-Lüfter, etc.).
- Sobald die Ratte ist völlig betäubt mit einer Ketamin / Xylazin-Cocktail in das Verhältnis von 2 zu 1 Ketamin Xylazin, rasieren den Bauch, Brust und Hals der Ratte. Um sicherzustellen, dass eine tiefe Narkose Zustand erreicht worden ist, eine Prise der Ratte Zehen-und Scheck-Pedal Rückzug der Extremität. Achten Sie darauf, die Ratte ist tief narkotisiert, bevor alle Schnitte.
- Legen Sie die Ratte mit dem Kopf auf ein Schneidebrett geäußert, dass bei einem Winkel von 30 ° geneigt ist
- Machen Sie einen Hautschnitt von der Mitte des Bauches unterhalb des Unterkiefers. Dissect entfernt die Muskeln der vorderen Dreieck des Halses an der Luftröhre aussetzen.
- Legen Sie einen 3:0-schwarz geflochten und unter der Luftröhre.
- Machen Sie einen Schnitt in die Luftröhre zwischen den knorpeligen Ringe eined Legen Sie die Trachealtubus. Binden Sie die Naht fest mit dem Trachealtubus in die Luftröhre zu sichern.
- Verbinden Sie den Trachealtubus zu einem kleinen Tier Ventilator.
3. Instrumenten-Aufbereitung für Immunzellen Isolation
- Bereiten Sie ein Tablett mit den Instrumenten für die Immunzellen isoliert Verfahren (dh Zangen, Scheren, HBSS, beschnitten weiche Teflon 24 Gauge Baxter intravasalen über die Nadel schnell cath)
- Bereiten Sie zwei 10cc Spritzen, füllen Sie eine Spritze mit HBSS für die Einführung der Puffer in den Herzbeutel und behalten uns das andere für das Absaugen des HBSS enthaltenden Zellen.
3.2.1. Reduzieren Sie die Teflon Spitze des 24 Gauge Baxter intravasalen über die Nadel schnell cath (1,6 cm) mit 1 / 2 bis 3 / 4 seiner ursprünglichen Länge für die Isolierung Verfahren.
- Legen Sie alle Spritzen, Puffer und eine leere 15-ml-Falcon Tube (die extrahierten Flüssigkeit halten, sobald Vorgang abgeschlossen ist) auf Eis.
- Machen Sie einen Medianschnitt in der Bauchwand (entlang der Linea alba), bis Sie die Xiphoidbasis erreichen.
- Ab leicht seitlich an den Xiphoidbasis machen bilateralen Einschnitte durch den Brustkorb weiterhin in einem Winkel in Richtung Achselhöhle. Achten Sie darauf, nicht in die Lunge, Herz oder Perikard perforieren.
- Nachdem die Schnitte auf beiden Seiten des Brustbeins abgeschlossen sind, sezieren entfernt die Membran von der unteren Rippen, Schneiden lateral nach medial.
Hinweis: Seien Sie immer wissen, wo der Herzbeutel eine Verbindung mit dem Zwerchfell und Brustbein, um Schäden zu vermeiden. Verwenden Sie das Lig. falciforme als Wahrzeichen zu beachten, wo der Herzbeutel auf der gegenüberliegenden Seite der Membran angebracht ist. Auch, wenn das Perikard geschnitten wird, ist die Fähigkeit, Zellen zu isolieren verloren.
- Heben Sie die eine Seite des Brustkorbs mit der Brusthöhle und dem Herzen (immer noch von den Herzbeutel gekapselt) aussetzen.
- Nehmen Sie die HBSS gefüllte Spritze und finden Sie einen Punkt in den Herzbeutel etwa auf halbem Weg zwischen dem Brustbein und dem Herzen (vorzugsweise mehr rostral als caudal) und legen Sie die Teflon Spitze des verkürzten schnell cath durch beide Schichten des Herzbeutels.
- Sobald der Katheter an Stelle vorsichtig vorgehen füllen den Herzbeutel Raum mit 2 bis 3 ml HBSS-Puffer. Sie werden sofort wissen, ob der Katheter richtig platziert ist, wenn man den Herzbeutel Raum erweitert kündigen. Wenn keine Füllung ist Zeuge, zurückzutreten und die Position des Quick-kath.
- Wenn der Herzbeutel gefüllt ist, nehmen die anderen 10 ml-Spritze und setzen Sie die Spitze wieder in den Herzbeutel und beginnen Absaugen des Puffers. Der gleiche Eintrag Loch verwendet werden kann oder eine andere geschaffen werden kann. Sicherstellen, dass die Spitze nicht zu nahe kommen, um die Wände der Herzbeutel und gleichzeitig abgesaugt, besonders an der Unterseite des Herzens. Dies könnte zu Punktion des Herzbeutels und Verlust von Zellen enthaltende Zelle führens.
- Während das Absaugen des Puffers, kann die Katheterspitze um in den Herzbeutel bewegt werden, um so viel Puffer wie möglich zu sammeln.
Hinweis: Wenn dabei reißt ihr leicht den Herzbeutel und das Loch an der Spitze des Herzens größer als die ursprüngliche Loch, keine Panik. Solange der Herzbeutel noch umgibt genug des Herzens kann man noch durchführen anderen waschen über das Herz, wenn auch mit einer geringeren Menge an Puffer. Bei der Erhebung einer optimalen Menge an Zellen, sind drei Minuten vor vier zusätzliche Waschgänge nötig.
- Legen Sie die extrahierten Puffer in den Falcon-Röhrchen auf Eis gelegt wurden.
- Nehmen Sie Herz, Lunge und / oder andere Gewebe, wenn für weitere Studien erforderlich. Nach der Sammlung von Immunzellen und anderen Geweben, muss die Ratte schnell und human eingeschläfert werden.
- Centrifuge die gesammelten Immunzellen Proben für 10 min bei 200 g bei 4 ° C. Halten Sie das Röhrchen auf Eiswenn nicht in Gebrauch.
- Entfernen Sie den Überstand und rekonstruieren das Pellet in 1 ml Hyclone Buffer oder HBSS.
Hinweis: Es ist wichtig, um die Anzahl der Immunzellen aus jedem Herzen nach der Immunzellen isoliert Verfahren erhalten zählen.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Beispiel von isolierten kardialen Mastzellen mit dieser Technik und gefärbt mit Toluidinblau und Safranin O / Alcianblau erzielten Ergebnisse sind in Abbildung 2a und 2b dargestellt, jeweils. Wie in Abbildung 3, die Herz-Mast zu sehen ist, behielten ihre Fähigkeit, Histamin nach der Behandlung mit bekannten Aktivatoren wie Verbindung 48/80 und Substanz P als in Morgan et al Release. 9 Vertreter Streudiagramme aus der Durchflußzytometrie der CD4 + Zellen und CD8 + Zellen sind in den Abbildungen 4 und 5, bzw. präsentiert. T-Lymphozyten sind weitere identifiziert und phänotypisiert als einer Zellpopulation von dieser Technik.
Abbildung 1. Flussdiagramm der kardialen Immunzellen isoliert Verfahren.
. Abbildung 2 Histologische repräsentative Bilder der kardialen Mastzellen sind wie folgt gefärbt: (A) mit Toluidinblau und (B) sind Safranin O / Alcianblau.
Abbildung 3. Functional Studie der kardialen Mastzellen aus der epikardialen Myokard-Region isoliert und stimuliert mit Verbindung 48/80 (10μg/mL) und Substanz P (10 um).
Abbildung 4. Representative Durchflusszytometrie Streudiagramme von isolierten CD4 +-Zellen mit Substanz P (1:100 dilut beschriftetion).
Abbildung 5. Representative Durchflusszytometrie von isolierten CD8 + Zellen mit Substanz P (1:100 Verdünnung) gekennzeichnet.
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Discussion
Dieses Verfahren zur Isolierung von Herz-Immunzellen ermöglicht die Analyse ihrer Funktion, Phänotyp und Reife, ohne die ungewollte Aktivierung, die typischerweise während einer traditionellen enzymatische Verdauung Isolation Technik. Die durchschnittliche Gesamtzahl der Zellen mit dieser Technik erhält man rund 400.000 pro Ratte Herz und Differential-Färbung und Durchflusszytometrie-Analyse dieser Zellen zeigt gemischte Population von T-Lymphozyten (~ 70%), Makrophagen (~ 12%) und Mastzellen mit die Verwendung dieser Technik. (~ 12%). 13, 14 sind daher Reinigungsverfahren für weitere Trennung von Herz Immunsystem Zellpopulationen benötigt. Isolierte Immunzellen kann für mehrere Anwendungen, darunter funktionelle Studien, Durchflusszytometrie, immunofluroescence und Co-Kultur-Experimente genutzt werden. Mit weiteren Reinigung und Experimentieren bieten diese isolierten Zellen ein nützliches Werkzeug für das Verständnis der Rolle des Immunsystems in den Prozess der kardialen Remodeling.
Die Ratten wurden unter Standard-Umgebungsbedingungen untergebracht und gepflegt auf kommerzielle Rattenfutter und Leitungswasser ad libitum. Alle Studien zu den Prinzipien des National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren angepasst und wurden von der University of South Carolina Institution Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Anästhesie bei der experimentellen Endpunkt wurde von Ketamin / Xylazin-Cocktail bei einem Verhältnis von 2 zu 1 Ketamin Xylazin betroffen. Dies ist ein nonsurvival Verfahren, das die Verwendung von nicht sterilisierten Instrumente ermöglicht. Nach der Isolierung von Immunzellen und anderen gewünschten Gewebe wurde die Ratte schnell und human nach dem American Veterinary Medical Association Guideline zur Euthanasie für Nager (zB Ausbluten, Genickbruch oder Betäubung Überdosierung) eingeschläfert.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein UNCF-Merck Graduate Science Research Dissertation Fellowship (JLM), National Heart, Lung, and Blood Institute gewährt RO1-HL-62228 (JSJ) und RO1-HL-073990 (JSJ) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma-Aldrich | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water | |||
| Table of Specific Equipment: | |||
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 | |
References
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