בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Summary

שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים פונקציונלי מהלב מספק אלטרנטיבה בשיטות המקובלות של collagenase העיכול, מה שגורם לתא רצויות הפעלת המערכת החיסונית, וכתוצאה מכך תגובה לירידה של תאים אלה. השיטה שלנו של בידוד התשואות תפקודית תאים חיסוניים לב על ידי הימנעות בעיות הקשורות עיכול אנזימטי.

Abstract

תאים חיסוניים לב צוברים ריבית התפקידים שהם ממלאים שיפוץ הפתולוגי במחלות לב רבים ^1-5 אלו תאים חיסוניים, הכוללים תא הפיטום, T-תאים מקרופאגים;. לאחסן ולשחרר מגוון של מתווכים פעילים ביולוגית כולל ציטוקינים פרוטאזות כמו tryptase. ^6-8 מתווכים אלה הוכחו להיות שחקני מפתח מטבוליזם תאי מטריקס ידי הפעלת metalloproteinases מטריצה ​​או גרימת הצטברות קולגן על ידי פונקציית ויסות fibroblasts 'לב. ^9-11 עם זאת, הטכניקות הזמינות עבור לבודד תאים חיסוניים יש לב היה בעייתי כי הם משתמשים collagenase חיידקי לעכל את רקמת שריר הלב. טכניקה זו גורמת להפעלה של תאים חיסוניים, ולכן אובדן תפקוד. לדוגמה, תא הפיטום לב להיות קשוב באופן משמעותי פחות תרכובות הגורמות degranulation. ¹² לפיכך, אנו פיתחו שיטה המאפשרת tהבידוד של תפקודי לב תאים חיסוניים אשר יוביל להבנה טובה יותר של התפקיד של תאים אלה במחלת לב הוא. ^{13, 14}

שיטה זו מחייבת היכרות עם המיקום האנטומי של xiphoid השחי של החולדה תהליך, רצועה falciform, ואת קרום הלב של הלב. ציוני דרך אלו חשובים כדי להגדיל את ההצלחה של ההליך כדי להבטיח תשואה גבוהה יותר של תאים חיסוניים לב. תאים אלו מבודדים החיסונית הלב יכול לשמש לאפיון הפנוטיפ של פונקציונליות, בגרות, ושיתוף תרבות ניסויים בתאי לב אחרים כדי להשיג הבנה טובה יותר של האינטראקציות שלהם.

Protocol

1. הכנת פתרון "הנקס מאזן מלח (HBSS)

1. החיטוי 1 כוס כוס L, סיים את 1000 מ"ל גליל, ומערבבים בר.
2. מחדש את אבקת פתרון HBSS את כוס L autoclaved 1 כוס לציון 900 מ"ל עם מים מזוקקים כפול.
3. מערבבים פתרון HBSS עם 3.4 גרם של מלח Na + Hepes ולהתאים את ה-pH לערך בין 7.35-7.41 שימוש או HCL מרוכז או NaOH.
4. לאחר pH הרצוי שהושגה ונשאר יציב, להוסיף 5 גרם של אלבומין בסרום שור לפתרון בטמפרטורת החדר עד אלבומין הוא נמס לגמרי.
5. הוסף 10 מ"ל של מים מזוקקים אנטיביוטיקה, antimyotic, לפתרון כפולה עד הנפח הכולל עומד בסימן מ"ל 1000.
6. מערבבים היטב את הפתרון.
7. סנן הפתרון HBSS ולהפריד אותו לתוך צינורות 50 מ"ל פלקון לשימוש מאוחר יותר. צינורות נוספים אפשר להקפיא ולהשתמש בהם במועד מאוחר יותר.

2. בעלי חיים Preparation - החדרת צינורות לקנה הנשימה

1. להכין מגש עם מכשירים נדרש חומר החדרת צינור לקנה הנשימה (כלומר מלקחיים, מספריים, צינור לקנה הנשימה, 3-0 תפר שחור קלוע, הנשמה חיה קטנה, וכו ').
2. לאחר עכברוש הוא מורדם לחלוטין עם קוקטייל קטמין / xylazine ביחס של 2 ל קטמין xylazine 1, לגלח את הבטן, החזה, הגרון של החולדה. כדי להבטיח מדינה עמוק הרדמה הושגה, קמצוץ הבוהן של החולדה ולבדוק לנסיגה הדוושה של איבר. ודא עכברוש הוא הרדים עמוק לפני ביצוע כל החתכים.
3. מניחים את עכברוש עם ראש מורם על קרש חיתוך, כי הוא נוטה על 30 מעלות זווית
4. ביצוע חתך בעור מהבטן באמצע כדי מתחת ללסת התחתונה. משם לנתח את שרירי המשולש הקדמי של הצוואר כדי לחשוף את קנה הנשימה.
5. מניחים תפר 3-0 קלוע שחור מתחת לקנה הנשימה.
6. עושים חתך קנה הנשימה בין טבעות סחוסד להכניס את צינור לקנה הנשימה. עניבה תפר חזק כדי לאבטח את צינור לקנה הנשימה על קנה הנשימה.
7. חברו את צינור לקנה הנשימה כדי הנשמה חיה קטנה.

3. כלי הכנה בידוד תא החיסון

1. להכין מגש עם מכשירים את ההליך תא החיסון בידוד (כלומר מלקחיים, מספריים, HBSS, גזוז רך טפלון 24 מד בקסטר intravascular מעל המחט מהיר קת')
2. הכן שני מזרקים 10cc, מילוי במזרק אחד עם HBSS מציגה החיץ לתוך שק קרום הלב ואת מילואים והשני עבור aspirating התאים המכילים HBSS.

   3.2.1. מנמיכים את קצה טפלון של 24 מד בקסטר intravascular על (1.6 ס"מ) מהירה קת' על ידי מחט 1 / 2 עד 3 / 4 אורך המקורי עבור ההליך בבידוד.

3. שמים את כל מזרקים, מאגרים, ואת ריקה 15 מ"ל Tube פלקון (להחזיק את נוזל חילוץ פעם ההליך הסתיים) על קרח.

<בכיתה p = "jove_title"> 4. תא החיסון בידוד

1. ביצוע חתך קו האמצע של דופן הבטן (לאורך linea alba) עד שתגיע תהליך xiphoid.
2. החל מעט רוחבית לתהליך xiphoid, לעשות חתכים דו צדדי דרך כלוב הצלעות המשך בזווית כלפי השחי. להיזהר לא לנקב את הריאות, הלב, או קרום הלב.
3. לאחר חתכים משני צדי החזה הושלמו, משם לנתח את הסרעפת מן הצלעות התחתונות, חיתוך לרוחב המדיאלי.

   הערה: שימו לב אי פעם של קרום הלב שבו מתחבר הסרעפת ועצם החזה כדי למנוע נזק. השתמש ברצועות falciform כציון דרך לציין היכן קרום הלב מחוברת בצד השני של הסרעפת. כמו כן, אם קרום הלב הוא חתך, היכולת לבודד תאים אבוד.

4. הרם בעדינות צד אחד של בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה והלב (במארז עדיין קרום הלב).
5. קח את המזרק מלא HBSS ולמצוא טעם שק קרום הלב בערך בחצי הדרך בין עצם החזה ואת הלב (רצוי יותר מקורי מאשר הזנב) והכנס את קצה טפלון של מקוצר מהיר קת' דרך שתי שכבות של קרום הלב.
6. לאחר קטטר נמצא במקום, המשך בעדינות למלא את החלל עם קרום הלב מ"ל 2-3 של החיץ HBBS. אתה יודע מיד אם את הקטטר ממוקם כראוי כאשר אתה מבחין החלל קרום הלב מתרחב. אם אין הוא ממלא עדים, לסגת למקם את מהיר קת'.
7. כאשר שק קרום הלב מתמלא, לקחת את המזרק השני 10 סמ"ק והמקום טיפ בחזרה קרום הלב ולהתחיל aspirating החיץ. חור הכניסה אותו ניתן להשתמש בו או אחרת ניתן ליצור. ודא קצה לא להתקרב יותר מדי אל קירות שק קרום הלב תוך מתן יניקה, בעיקר על החלק התחתון של הלב. זה יכול להוביל ניקוב שק אובדן קרום הלב ושל תא תא המכילs.
8. בעוד aspirating החיץ, קצה הצנתר ניתן להעביר מסביב על מנת לאסוף חיץ ככל האפשר בתוך שק קרום הלב.

הערה: אם בכך אתה קצת לקרוע את קרום הלב ולעשות את החור בחלק העליון של הלב גדול יותר מאשר חור המקורי, אין פאניקה. כל עוד קרום הלב עדיין מקיפה מספיק של הלב אתה עדיין יכול לבצע עוד לשטוף הלב אם כי עם כמות פחותה של המאגר. עבור אוסף של כמות אופטימלית של תאים, 03:57 רוחץ נוספים נדרשים.

9. מניחים את החיץ חילוץ לתוך צינורות פלקון שהונחו על קרח.
10. הסר את הלב, הריאות, ו / או כל רקמה אחרת במידת הצורך למחקרים נוספים. לאחר איסוף של תאים חיסוניים ורקמות אחרות, החולדה צריכה להיות במהירות המתת חסד הומנית.
11. צנטריפוגה את הדוגמאות שנאספו תא החיסון במשך 10 דקות ב 200 גרם ב 4 ° C. שמור תמיד את הצינורות על הקרח כאשר אינו בשימוש.
12. הסר את supernatant ו מחדש את גלולה ב 1 מ"ל של הצפת Hyclone או HBSS.

הערה: חשוב לספור את מספר תאים חיסוניים המתקבל לב לאחר כל הליך תא החיסון בבידוד.

5. נציג תוצאות:

דוגמה מבודדים תאים התורן הלב שהושגו עם הטכניקה הזו מוכתמת toluidine כחול safranin O / alcian כחול מוצגות דמויות 2 א ו -2, בהתאמה. כפי שניתן לראות באיור 3, התורן לב, שמרו על יכולתם שחרור היסטמין לאחר טיפול activators ידוע כגון 48/80 המתחם חומר P כמתואר מורגן et al. ⁹ פיזור נציג מגרשים מתוך cytometry הזרימה של תאים מסוג CD4 + CD8 + תאים מוצגים נתוני 4 ו -5, בהתאמה. לימפוציטים מסוג T מזוהים נוספים phenotyped כאוכלוסייה התא טכניקה זו.

ss = "jove_content">
באיור 1. תרשים זרימה של תהליך הבידוד לב החיסונית התא.

. באיור 2 תמונות נציג היסטולוגית של תא הפיטום לב מוכתמות כדלקמן: (א) עם toluidine כחול (B) הם safranin O / alcian כחול.

באיור 3. מחקר פונקציונלית של תא הפיטום לב מבודד באזור שריר הלב epicardial ועורר עם 48/80 מתחם (10μg/mL) ו חומר P (10μM).

איור 4. הנציג cytometry זרימה פיזור חלקות CD4 + תאים מבודדים שכותרתו עם חומר P (1:100 dilutיון).

איור 5. Cytometry זרימה נציג בודד CD8 + תאים עם חומר הנקרא P (1:100 דילול).

Discussion

שיטה זו של בידוד תאים חיסוניים לב מאפשר ניתוח של תפקידם, פנוטיפ, ובגרות ללא הפעלה לא רצויה, כי בדרך כלל מתרחשת במהלך טכניקה הבידוד המסורתי האנזימטית העיכול. המספר הכולל הממוצע של תאים שהושגו עם טכניקה זו היא בסביבות 400,000 דולר הלב העכברוש, מכתים דיפרנציאלי cytometry ניתוח תזרים של תאים אלה מציין אוכלוסייה מעורבת של לימפוציטים מסוג T (~ 70%), מקרופאגים (~ 12%) עם תא הפיטום השימוש בטכניקה זו. (~ 12%). ^{13, 14} לכן, שיטות טיהור להפרדה נוספת של לב אוכלוסיות תאים חיסוניים יש צורך. תאים חיסוניים מבודד יכול לשמש מספר יישומים, כולל מחקרים פונקציונלי, cytometry זרימה, immunofluroescence, ושיתוף תרבות ניסויים. עם טיהור ניסויים נוספים, תאים אלו מבודדים לספק כלי שימושי להבנת תפקידה של המערכת החיסונית בתהליך של שיפוץ לב.

התחת = "jove_step"> בטיחות בעלי חיים:

חולדות שוכנו בתנאים סביבתיים תקן ומתוחזק על עכברוש האוכל המסחרי מודעה ברז מים כרצונך. כל המחקרים תאמו את העקרונות של המכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי האוניברסיטה של ​​דרום קרוליינה טיפול בבעלי חיים של מוסד ועדת שימוש. הרדמה בנקודת סיום הניסוי היה מושפע קוקטייל קטמין / xylazine ביחס של קטמין 2-1 xylazine. זהו הליך nonsurvival, המתירה את השימוש במכשירים unsterilized. אחרי בידוד של תאים חיסוניים אחרים רקמות הרצוי, העכברוש היה במהירות מורדמים אנושי על פי הנחיה וטרינרית האגודה האמריקאית לרפואה על המתת חסד עבור מכרסמים (למשל, exsanguination נקע בצוואר הרחם, או ממנת יתר של חומר הרדמה).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma-Aldrich	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	GIBCO, by Life Technologies	15240-062
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermo Fisher Scientific, Inc.	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water
Table of Specific Equipment:
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Inc.	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter Internationl Inc.	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483