Summary
दिल से कार्यात्मक प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस विधि collagenase पाचन, जो अवांछित प्रतिरक्षा सेल सक्रियण कारण बनता है, इन कोशिकाओं की एक कम प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप के पारंपरिक तरीकों के लिए एक विकल्प प्रदान करता है. हमारे अलगाव की विधि enzymatic पाचन के साथ जुड़ी समस्याओं से बचने के द्वारा कार्यात्मक हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं पैदावार.
Abstract
कार्डिएक प्रतिरक्षा कोशिकाओं भूमिकाएं वे कई हृदय रोगों में रोग remodeling में खेलने के लिए ब्याज प्राप्त कर रहे हैं 1-5 इन प्रतिरक्षा कोशिकाओं है, जो मस्तूल कोशिकाओं, टी कोशिकाओं और मैक्रोफेज शामिल हैं, साइटोकिन्स और सहित biologically सक्रिय मध्यस्थों की एक किस्म की दुकान और रिहाई . tryptase जैसे proteases 6-8 इन मध्यस्थों. मैट्रिक्स metalloproteinases को सक्रिय या modulating हृदय 'fibroblasts समारोह द्वारा कोलेजन संचय के कारण द्वारा बाह्य मैट्रिक्स चयापचय में महत्वपूर्ण खिलाड़ी हो दिखाया गया है 9-11 हालांकि, हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपलब्ध तकनीक है. समस्याग्रस्त किया गया क्योंकि वे बैक्टीरियल collagenase का उपयोग करने के लिए दौरे के ऊतकों को पचाने. इस तकनीक प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सक्रियण और इस प्रकार समारोह के नुकसान का कारण बनता है. उदाहरण के लिए, हृदय मस्तूल कोशिकाओं काफी कम यौगिकों कि degranulation के कारण के लिए उत्तरदायी बन जाते हैं 12. इसलिए, हम टी के लिए अनुमति देता है एक तकनीक है कि विकसितकार्यात्मक हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं जो हृदय रोग में इन कोशिकाओं की भूमिका का एक बेहतर समझ के लिए नेतृत्व करेंगे के अलगाव वह 13, 14
इस विधि चूहे असिरूप प्रक्रिया कांख, और दात्राकार बंधन के संरचनात्मक, स्थान, और दिल की pericardium के साथ एक परिचित की आवश्यकता है. इन स्थलों महत्वपूर्ण प्रक्रिया की सफलता को बढ़ाने के लिए और हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं के एक उच्च उपज सुनिश्चित. ये पृथक हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं तो कार्यक्षमता, phenotype, परिपक्वता, और अन्य हृदय कोशिकाओं के साथ सह संस्कृति प्रयोगों के लिए उनकी बातचीत का एक बेहतर समझ पाने के लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. 'हैंक्स बैलेंस नमक समाधान की तैयारी (HBSS)
- आटोक्लेव 1 एल कांच बीकर, 1000 एमएल सिलेंडर स्नातक की उपाधि प्राप्त की, और बार हलचल.
- Reconstitute autoclaved एल 1 गिलास 900 एमएल निशान दोहरा आसुत जल के साथ करने के लिए बीकर में HBSS पाउडर समाधान.
- Hepes ना + नमक के 3.4 जी के साथ HBSS समाधान मिक्स और 7.35-7.41 के बीच कोई मान या तो केंद्रित एचसीएल या NaOH का उपयोग करने के लिए पीएच समायोजित.
- एक बार वांछित पीएच प्राप्त किया गया है और स्थिर रहता है, गोजातीय कमरे के तापमान पर समाधान के लिए जब तक albumin पूरी तरह भंग है सीरम albumin के 5 ग्राम जोड़ें.
- एंटीबायोटिक, antimyotic, समाधान के लिए और डबल आसुत पानी के 10 एमएल जोड़ें तक कुल मात्रा 1000 एमएल निशान पर है.
- समाधान अच्छी तरह से हिलाओ.
- HBSS समाधान फ़िल्टर और 50 एमएल फाल्कन ट्यूबों में इसे बाद में उपयोग के लिए अलग. अतिरिक्त ट्यूब और जमे हुए किया जा सकता है एक बाद की तारीख पर इस्तेमाल किया.
2. पशु Preparatioपता - सांस की नली ट्यूब के घुसाव
- एक सांस की नली ट्यूब (यानी संदंश, कैंची, सांस की नली ट्यूब, 3-0 काला लट सीवन, छोटे जानवर वेंटीलेटर, आदि) के सम्मिलन के लिए आवश्यक उपकरणों और सामग्री के साथ एक ट्रे तैयार.
- एक बार चूहा पूरी तरह से 2 1 xylazine के लिए ketamine के अनुपात में एक ketamine / xylazine कॉकटेल के साथ anesthetized है, चूहे के पेट, छाती और गले दाढ़ी. सुनिश्चित करें कि एक गहरी संवेदनाहारी राज्य हासिल किया गया है, चूहे पैर के अंगूठे चुटकी और अंग के पेडल वापसी के लिए जाँच करें. सुनिश्चित करें कि चूहे गहरा सभी चीरों बनाने से पहले anesthetized है.
- उसके सिर के साथ चूहे एक काटने बोर्ड पर उठाया है कि एक 30 डिग्री कोण पर झुका है प्लेस
- मध्य पेट से निचले जबड़े के नीचे एक त्वचा चीरा करें. दूर ट्रेकिआ बेनकाब करने के लिए गर्दन के पूर्वकाल त्रिकोण की मांसपेशियों को काटना.
- ट्रेकिआ के तहत एक 3-0 काली लट सीवन रखें.
- कार्टिलेजीनस के छल्ले के बीच ट्रेकिआ में एक चीराघ सांस की नली ट्यूब डालने. सीवन कसकर बाँध ट्रेकिआ सांस की नली ट्यूब सुरक्षित.
- एक छोटे जानवर वेंटीलेटर पर सांस की नली ट्यूब कनेक्ट.
3. इम्यून सेल अलगाव के लिए साधन तैयार
- प्रतिरक्षा सेल अलगाव प्रक्रिया के लिए उपकरणों के साथ (यानी संदंश, कैंची, HBSS, जल्दी से कैथ सुई से अधिक नरम Teflon 24 गेज बैक्सटर intravascular छंटनी) एक ट्रे तैयार
- दो 10cc सीरिंज को तैयार करने के लिए, HBSS के साथ pericardial थैली और आरक्षित एक दूसरे में HBSS युक्त कोशिकाओं aspirating के लिए बफर शुरू करने के लिए एक सिरिंज को भरने.
3.2.1 24 गेज बैक्सटर intravascular जल्दी कैथ सुई (1.6 सेमी) से अधिक Teflon टिप 1 / अपने अलगाव की प्रक्रिया के लिए मूल लंबाई के 3 / 4 2 द्वारा कम.
- सभी सीरिंज, buffers, और एक खाली 15 एमएल फाल्कन (निकाले तरल पदार्थ पकड़ एक बार प्रक्रिया समाप्त हो गया है) ट्यूब बर्फ पर रखें.
- पेट की दीवार (linea अल्बा के साथ) में एक midline चीरा बनाओ जब तक आप असिरूप प्रक्रिया तक पहुँचने के लिए.
- असिरूप प्रक्रिया को थोड़ा laterally शुरू, रिब पिंजरे के माध्यम से बगल की ओर एक कोण पर जारी द्विपक्षीय चीरों बनाते हैं. सावधान रहो, फेफड़े, हृदय, या pericardium नहीं छेदना.
- एक बार उरोस्थि के दोनों पक्षों पर चीरों को पूरा कर रहे हैं, कम पसलियों से दूर डायाफ्राम टुकड़े करना, औसत दर्जे के लिए पार्श्व काटने.
नोट: कभी जहां pericardium डायाफ्राम और क्षति से बचने के उरोस्थि के लिए जोड़ता है जागरूक बनो. एक मील का पत्थर के रूप में दात्राकार बंधन का उपयोग करने के लिए ध्यान दें जहां pericardium के डायाफ्राम के विपरीत पक्ष पर संलग्न है. इसके अलावा, अगर pericardium काट रहा है, कोशिकाओं को अलग करने की क्षमता खो दिया है.
- धीरे ribcage के एक तरफ लिफ्ट वक्ष गुहा और दिल (अभी भी pericardium द्वारा समझाया) को बेनकाब.
- HBSS भर सिरिंज ले लो और pericardial थैली में एक बिंदु उरोस्थि और दिल (लांगुलिय की तुलना में बेहतर विजय - स्तम्भ) के बीच लगभग आधे रास्ते खोजने और Teflon की नोक सम्मिलित pericardium के दोनों परतों के माध्यम से छोटा जल्दी कैथ.
- एक बार कैथेटर जगह में है, धीरे आगे बढ़ना HBBS बफर के 2 से 3 मिलीलीटर के साथ pericardial स्थान को भरने. तुम तुरंत पता है अगर कैथेटर ठीक से रखा जाता है जब आप pericardial अंतरिक्ष विस्तार नोटिस जाएगा. यदि नहीं भरने देखा है, वापस लेने, और जल्दी - कैथ reposition.
- जब pericardial थैली भर जाता है, अन्य 10 सीसी सिरिंज ले और टिप pericardium में वापस जगह और बफर aspirating शुरू. एक ही प्रविष्टि छेद या इस्तेमाल किया जा सकता है एक और बनाया जा सकता है. सुनिश्चित करें कि टिप करीब pericardial थैली की दीवारों को भी नहीं आया है जबकि चूषण दिल की underside पर विशेष रूप से प्रदान करें. यह pericardial और सेल युक्त सेल की थैली नुकसान puncturing के लिए नेतृत्व कर सकता हैएस
- जबकि बफर aspirating, कैथेटर टिप pericardial थैली के अंदर चारों ओर स्थानांतरित कर सकते हैं क्रम में जितना संभव हो उतना बफर इकट्ठा.
नोट: यदि आप ऐसा करने में थोड़ा pericardium आंसू और मूल छेद से भी बड़ा दिल के शीर्ष पर छेद कर, घबराओ मत. के रूप में लंबे समय के रूप pericardium अभी भी दिल की पर्याप्त चारों ओर आप अभी भी यद्यपि बफर की एक कम राशि के साथ दिल पर एक धोने प्रदर्शन कर सकते हैं. कक्षों की एक इष्टतम राशि के संग्रह के लिए, तीन से चार अतिरिक्त washes की जरूरत है.
- फाल्कन ट्यूबों कि बर्फ पर रखा गया था में निकाले बफर रखें.
- हृदय, फेफड़े, और / या किसी भी अन्य ऊतकों अगर आगे के अध्ययन के लिए आवश्यक निकालें. प्रतिरक्षा कोशिकाओं और अन्य ऊतकों के संग्रह के बाद, चूहे तेजी से और humanely euthanized किया जाना चाहिए.
- 4 में 200g पर 10 मिनट ° सी. के लिए प्रतिरक्षा सेल के नमूने एकत्र अपकेंद्रित्र हमेशा बर्फ पर रखने ट्यूबोंजब उपयोग में नहीं है.
- सतह पर तैरनेवाला और Hyclone बफर या HBSS 1 एमएल में गोली reconstitute निकालें.
नोट: यह प्रतिरक्षा प्रतिरक्षा सेल अलगाव की प्रक्रिया के बाद हर दिल से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या गिनती करने के लिए महत्वपूर्ण है.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
पृथक हृदय मस्तूल कोशिकाओं का एक उदाहरण इस toluidine नीले और सैफरैनीन हे / alcian नीले रंग के साथ तकनीक और दाग के साथ प्राप्त आंकड़े 2A और 2B में प्रस्तुत कर रहे हैं, क्रमशः. चित्रा 3, कार्डियक मस्तूल में देखा जा सकता है है, उनकी यौगिक 48/80 और पदार्थ पी मॉर्गन एट अल के रूप में वर्णित के रूप में जाना जाता activators के साथ उपचार के बाद histamine की रिहाई की क्षमता को बनाए रखा CD4 के प्रवाह cytometry से 9 प्रतिनिधि स्कैटर भूखंडों + कोशिकाओं और CD8 + कोशिकाओं 4 और 5 के आंकड़े, क्रमशः में प्रस्तुत कर रहे हैं. टी लिम्फोसाइटों आगे की पहचान कर रहे हैं और इस तकनीक से एक सेल की आबादी के रूप में phenotyped.
चित्रा 1. हृदय प्रतिरक्षा सेल अलगाव प्रक्रिया के प्रवाह चार्ट.
. चित्रा 2 हृदय मस्तूल कोशिकाओं के histological प्रतिनिधि छवियों के रूप में दाग हैं: (ए) (बी) toluidine नीले और के साथ सैफरैनीन हे / alcian नीले हैं.
चित्रा 3 epicardial myocardial क्षेत्र से अलग - थलग और यौगिक (10μg/mL) 48/80 और पदार्थ पी (10μM) के साथ उत्तेजित हृदय मस्तूल कोशिकाओं के कार्यात्मक अध्ययन .
चित्रा 4 प्रतिनिधि पृथक सीडी 4 + कोशिकाओं मादक (1:100 dilut पी के साथ लेबल के प्रवाह cytometry स्कैटर भूखंडों .आयन).
चित्रा 5 पृथक सीडी 8 + मादक पी (1:100 कमजोर पड़ने) के साथ लेबल की कोशिकाओं के प्रतिनिधि प्रवाह cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हृदय प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने का यह तरीका अवांछित सक्रियण है कि आमतौर पर एक पारंपरिक enzymatic पाचन अलगाव तकनीक के दौरान होता है के बिना उनके कार्य, phenotype, और परिपक्वता के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. कक्षों की औसत कुल संख्या इस तकनीक के साथ प्राप्त चूहा दिल प्रति 400.000 के आसपास है, और अंतर धुंधला हो जाना और इन कोशिकाओं के प्रवाह cytometry विश्लेषण टी लिम्फोसाइटों के मिश्रित आबादी के साथ (% ~ 70) (~ 12%) मैक्रोफेज और मस्तूल कोशिकाओं को इंगित करता है इस तकनीक का उपयोग (~ 12%). 13, 14 इसलिए, हृदय प्रतिरक्षा सेल आबादी के विभाजन के लिए शुद्धि तरीकों की जरूरत है . पृथक प्रतिरक्षा कोशिकाओं कार्यात्मक अध्ययन, प्रवाह cytometry, immunofluroescence, और सह - संस्कृति प्रयोगों सहित कई अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. आगे शोधन और प्रयोग के साथ, इन अलग कक्षों हृदय remodeling के प्रक्रिया में प्रतिरक्षा प्रणाली की भूमिका को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करते हैं.
चूहे मानक पर्यावरण शर्तों के तहत रखे थे और वाणिज्यिक चूहे चाउ और नल का पानी यथेच्छ पर बनाए रखा . सभी अध्ययन प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के सिद्धांतों को conformed थे और दक्षिण कैरोलिना इंस्टीट्यूशन पशु देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित है. प्रयोगात्मक अंत बिंदु पर संज्ञाहरण ketamine / xylazine कॉकटेल से 2 ketamine के लिए एक xylazine के अनुपात में प्रभावित किया गया था. यह एक nonsurvival प्रक्रिया है, जो unsterilized उपकरणों का उपयोग परमिट है. प्रतिरक्षा कोशिकाओं और अन्य वांछित ऊतक के अलगाव के बाद, चूहे तेजी से किया गया था और humanely कृन्तकों (जैसे exsanguination, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था, या संवेदनाहारी अधिक मात्रा) के लिए इच्छामृत्यु पर पशु चिकित्सा अमेरिकन मेडिकल एसोसिएशन दिशानिर्देश के अनुसार euthanized.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम UNCF - मर्क स्नातक विज्ञान अनुसंधान निबंध (JLM) फैलोशिप, राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान RO1 HL 62,228 अनुदान (JSJ) और RO1-HL-073,990 (JSJ) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma-Aldrich | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water | |||
| Table of Specific Equipment: | |||
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 | |
References
- Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).
- Brower, G. L., Janicki, J. S. Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats. Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).
- Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).
- Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).
- Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat. Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).
- Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure. Cytokine. 34, 284-290 (2006).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis. Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).
- Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure. Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).
- Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats. Circulation. 97, 1382-1391 (1998).
- Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion. Circulation. 98, 699-710 (1998).
- Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).
- Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells. Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).
- Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart. Hypertension. 55, 270-276 (2010).
- Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. A novel technique for isolating functional mast cells from the heart. Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).
