Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Summary

Questo metodo per isolare le cellule immunitarie funzionale dal cuore offre un'alternativa ai metodi convenzionali di digestione collagenasi, che provoca indesiderati attivazione immunitaria delle cellule, con conseguente diminuzione di risposta di queste cellule. Il nostro metodo di isolamento rese funzionali cellule cardiache immunitario evitando problemi legati alla digestione enzimatica.

Abstract

Cardiaco cellule immunitarie stanno guadagnando interesse per i ruoli che svolgono nella rimodellamento patologico in molte malattie cardiache ^1-5 Queste cellule del sistema immunitario, che includono i mastociti, le cellule T ei macrofagi;. Immagazzinare e rilasciare una varietà di mediatori biologici attivi tra cui citochine e proteasi, quali triptasi. ^6-8 Questi mediatori hanno dimostrato di essere giocatori chiave nel metabolismo della matrice extracellulare, attivando metalloproteinasi della matrice o causare accumulo di collagene modulando il fibroblasti cardiaci 'funzione. ^9-11 Tuttavia, le tecniche disponibili per isolare le cellule immunitarie hanno cardiaca stato problematico perché usano collagenasi batterica per digerire il tessuto miocardico. Questa tecnica causa attivazione delle cellule immunitarie e di conseguenza una perdita di funzione. Per esempio, i mastociti cardiaci diventano significativamente meno sensibili ai composti che causano la degranulazione. ¹² Perciò, abbiamo sviluppato una tecnica che permette di tche l'isolamento di cellule cardiache funzionali del sistema immunitario che porterebbe ad una migliore comprensione del ruolo di queste cellule nelle malattie cardiache. ^{13, 14}

Questo metodo richiede una certa familiarità con la posizione anatomica del ratto processo xifoideo, ascella e legamento falciforme, pericardio e del cuore. Questi punti di riferimento sono importanti per aumentare il successo della procedura e per garantire una maggiore resa di cellule immunitarie cardiaco. Queste isolato cellule cardiache immunitarie possono quindi essere utilizzati per la caratterizzazione di funzionalità, fenotipo, la maturità e co-coltura con altri esperimenti cellule cardiache per ottenere una migliore comprensione delle loro interazioni.

Protocol

1. Preparazione della soluzione Balance Hanks 'Salt (HBSS)

1. Autoclave 1 bicchiere di vetro L, 1000 mL cilindro graduato, e mescolare bar.
2. Ricostituire la soluzione polvere HBSS in autoclave L 1 bicchiere di vetro per il marchio di 900 ml con acqua bidistillata.
3. Mescolare soluzione HBSS con 3,4 g di sale Hepes Na + e regolare il pH a un valore compreso tra 7,35-7,41 utilizzando concentrato HCL o NaOH.
4. Una volta che il pH desiderato è stato raggiunto e rimane stabile, aggiungere 5 g di BSA per la soluzione a temperatura ambiente fino a quando la albumina è completamente sciolto.
5. Aggiungere 10 ml di acqua antibiotico, antimyotic, alla soluzione e bidistillata fino a quando il volume totale è di 1000 ml marchio.
6. Mescolare bene la soluzione.
7. Filtrare la soluzione HBSS e separare in tubi Falcon da 50 ml per un uso successivo. Tubi aggiuntivi possono essere congelati e utilizzati in un secondo momento.

2. Animal PREPARAZIOn - Inserimento del tubo tracheale

1. Preparare un vassoio con strumenti e materiali necessari per l'inserimento di un tubo tracheale (ad esempio pinze, forbici, tubo tracheale, 3-0 sutura nera intrecciata, ventilatore per piccoli animali, ecc.)
2. Una volta che il ratto è completamente anestetizzato con un cocktail di ketamina / xylazina nel rapporto di 2 a 1 xylazina ketamina, radere l'addome, torace e gola del ratto. Per garantire che un profondo stato anestetico è stato raggiunto, pizzicare piedi del ratto e controllare per il ritiro pedale dell'arto. Assicurarsi che il ratto è profondamente anestetizzati prima di fare tutte le incisioni.
3. Posizionare il topo con la testa sollevata su un tagliere che è inclinato di 30 ° di inclinazione
4. Eseguire un'incisione cutanea a partire dalla metà dell'addome al di sotto della mandibola. Sezionare via i muscoli del triangolo anteriore del collo per esporre la trachea.
5. Posizionare un 3-0 sutura nero intrecciato con la trachea.
6. Fare un'incisione nella trachea tra gli anelli cartilaginei unod inserire il tubo tracheale. Legare saldamente la sutura per fissare il tubo tracheale per la trachea.
7. Collegare il tubo tracheale di un ventilatore piccolo animale.

3. Preparazione dello strumento per l'isolamento delle cellule immunitarie

1. Preparare un vassoio con gli strumenti per la procedura di isolamento delle cellule immunitarie (ad esempio pinze, forbici, HBSS, tagliato morbido teflon 24 gauge Baxter intravascolare sopra l'ago rapido cath)
2. Preparare due siringhe 10cc, riempire una siringa con HBSS per introdurre il buffer nel sacco pericardico e prenotare l'altro per l'aspirazione delle celle contenenti HBSS.

   3.2.1. Ridurre la punta in Teflon del calibro 24 Baxter intravascolare nel corso del rapido-cath ago (1,6 cm) da 1 / 2 a 3 / 4 della sua lunghezza originale per la procedura di isolamento.

3. Mettere tutte le siringhe, tamponi, e un vuoto da 15 ml tubo Falcon (per tenere il liquido estratto, una volta procedura è terminata) su ghiaccio.

<p class = "jove_title"> 4. Cella di isolamento immunitario

1. Fai una incisione sulla linea mediana della parete addominale (lungo la linea alba) fino a raggiungere il processo xifoideo.
2. Partendo un po 'lateralmente al processo xifoideo, fare incisioni bilaterali attraverso la gabbia toracica continua con un angolo verso l'ascella. Fare attenzione a non forare i polmoni, il cuore o pericardio.
3. Una volta che le incisioni su entrambi i lati dello sterno sono completi, sezionare via la membrana dal costole inferiori, il taglio laterale a mediale.

   Nota: Siate sempre consapevoli di dove il pericardio si collega al diaframma e lo sterno per evitare danni. Utilizzare il legamento falciforme come punto di riferimento per notare dove il pericardio è attaccato sul lato opposto della membrana. Inoltre, se il pericardio è tagliato, la capacità di isolare le cellule si perde.

4. Sollevare delicatamente un lato della gabbia toracica per esporre la cavità toracica e il cuore (ancora incapsulato dal pericardio).
5. Prendere la siringa riempita HBSS e trovare un punto nel sacco pericardico circa a metà strada tra lo sterno e il cuore (preferibilmente più rostrale rispetto caudale) e inserire la punta del Teflon accorciato rapido cath attraverso entrambi gli strati del pericardio.
6. Una volta che il catetere è a posto, procedere con delicatezza riempire lo spazio pericardico con 2 o 3 ml di tampone HBBS. Saprete immediatamente se il catetere è posizionato correttamente quando si nota lo spazio pericardico espansione. Se nessun riempimento è testimoniata, prelevare e riposizionare il rapido-cath.
7. Quando il sacco pericardico è pieno, prendere l'altra siringa da 10 cc e posizionare la punta indietro nel pericardio e iniziare aspirare il tampone. Il foro di entrata lo stesso può essere usato o un altro possono essere creati. Assicurarsi che la punta non arrivare troppo a ridosso delle mura del sacco pericardico, fornendo aspirazione, soprattutto sul lato inferiore del cuore. Ciò potrebbe portare a pungere il pericardio e la perdita di cellule contenenti cellules.
8. Mentre aspirare il tampone, la punta del catetere può essere spostato all'interno del sacco pericardico al fine di raccogliere tampone quanto più possibile.

Nota: se nel farlo leggermente strappare il pericardio e fare il buco nella parte superiore del cuore più grande del foro originale, non fatevi prendere dal panico. Finché il pericardio circonda ancora abbastanza del cuore è ancora possibile eseguire un'altra lavata sopra il cuore anche se con una minore quantità di tampone. Per la raccolta di una quantità ottimale di cellule, 3-4 lavaggi sono necessari ulteriori.

9. Posizionare il tampone estratto nei tubi Falcon che sono stati immessi sul ghiaccio.
10. Rimuovere cuore, polmoni, e / o qualsiasi altro tessuto, se necessario, per ulteriori studi. Dopo la raccolta delle cellule immunitarie e di altri tessuti, il topo deve essere rapidamente e umanamente eutanasia.
11. Centrifugare i campioni raccolti cellule immunitarie per 10 min a 200 gr a 4 ° C. Tenere sempre i tubi in ghiaccioquando non in uso.
12. Rimuovere il surnatante e ricostituire il pellet in 1 ml di tampone Hyclone o HBSS.

Nota: è importante contare il numero di cellule immunitarie ottenute da ogni cuore dopo la procedura di isolamento delle cellule immunitarie.

5. Rappresentante dei risultati:

Un esempio di isolato mastociti cardiaci ottenuti con questa tecnica e colorati con blu di toluidina e safranina O / alcian blu sono presentati nelle figure 2A e 2B, rispettivamente. Come si può vedere in figura 3, L'albero cardiaco, hanno mantenuto la loro capacità di rilascio di istamina dopo il trattamento con attivatori noto come 48/80 composto e sostanza P, come descritto nella Morgan et al. ⁹ appezzamenti Rappresentante dispersione di citometria a flusso delle cellule CD4 + e cellule CD8 + sono presentati nelle figure 4 e 5, rispettivamente. I linfociti T sono ulteriormente identificati e fenotipizzati come una popolazione di cellule da questa tecnica.

Figura 1. Diagramma di flusso della procedura di isolamento delle cellule cardiache immunitario.

. Immagini rappresentative Figura 2 istologica dei mastociti cardiaci sono macchiati come segue: (A) con blu di toluidina e (B) sono safranina O / Alcian blu.

Figura 3. Studio funzionale dei mastociti cardiaci isolati dalla regione epicardico miocardico e stimolati con 48/80 composto (10μg/mL) e sostanza P (10μM).

Figura 4. Rappresentante trame citometria a flusso dispersione dei CD4 + isolate cellule marcate con sostanza P (1:100 dilutione).

Figura 5. Citometria a flusso rappresentante di isolate cellule CD8 + etichettati con Sostanza P (diluizione 1:100).

Discussion

Questo metodo di isolare le cellule immunitarie cardiaca permette l'analisi della loro funzione, fenotipo, e la maturità senza l'attivazione indesiderata che si verifica in genere nel corso di una tecnica tradizionale isolamento digestione enzimatica. Il numero medio totale di cellule ottenute con questa tecnica è di circa 400.000 per il cuore di ratto, e colorazione differenziale e l'analisi di citometria a flusso di queste cellule indica popolazione mista di linfociti T (~ 70%), i macrofagi (~ 12%) e mastociti con l'uso di questa tecnica. (~ 12%). ^{13, 14} Di conseguenza, i metodi di purificazione per ulteriore separazione di popolazioni di cellule immunitarie cardiaco sono necessari. Isolato cellule del sistema immunitario può essere utilizzato per diverse applicazioni, inclusi gli studi funzionali, citometria a flusso, immunofluroescence, e co-coltura esperimenti. Con ulteriore purificazione e la sperimentazione, queste cellule isolate fornire un utile strumento per comprendere il ruolo del sistema immunitario nel processo di rimodellamento cardiaco.

I ratti sono stati alloggiati in condizioni ambientali standard e mantenuto sul ratto chow commerciali e l'acqua del rubinetto ad libitum. Tutti gli studi conformi ai principi del National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono state approvate dalla University of South Carolina Animal Care Institution e del comitato Usa. Anestesia nel punto finale sperimentale è stata colpita da cocktail di ketamina / xylazina con un rapporto di 2 a 1 xylazina ketamina. Questa è una procedura contro sopravvivenza, che permette l'uso di strumenti non sterili. Dopo l'isolamento delle cellule immunitarie e altri tessuti desiderati, il ratto è stato rapidamente e umanamente eutanasia secondo l'American Veterinary Medical Association guida sull'eutanasia per i roditori (per esempio dissanguamento, dislocazione cervicale, overdose o anestetico).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma-Aldrich	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	GIBCO, by Life Technologies	15240-062
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermo Fisher Scientific, Inc.	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water
Table of Specific Equipment:
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Inc.	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter Internationl Inc.	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483