Summary
心臓から機能的な免疫細胞を単離するためのこの方法では、これらの細胞の反応性の低下、その結果、不要な免疫細胞の活性化を引き起こすコラゲナーゼ消化、の従来の方法に代わる方法が用意されています。分離の手法は、酵素消化に関連する問題を回避することによって機能的な心臓の免疫細胞が得られます。
Abstract
。心臓の免疫細胞は肥満細胞、T細胞およびマクロファージを含む1月5日 、これらの免疫細胞は、彼らは多くの心臓疾患の病理学的リモデリングにおいて果たす役割に関心を集めている、店舗やサイトカインを含む生物学的活性のメディエーターの様々を解放し、このようなトリプターゼとしてプロテアーゼ。6-8これらのメディエーターは、マトリックスメタロプロテアーゼの活性化や変調心臓線維芽細胞"機能により、コラーゲンの蓄積を引き起こすことにより細胞外マトリックスの代謝に重要なプレーヤーであることが示されている。9-11しかし、心臓の免疫細胞を単離するために利用できる技術は持っている彼らは心筋組織を消化する細菌性コラゲナーゼを使用するため、問題となって。この手法は、免疫細胞の活性化とそのための機能が失われます。例えば、心臓の肥満細胞が脱顆粒を引き起こす化合物を大幅に軽減応答になる。12だから、我々はtを可能にする技術を開発彼の心疾患におけるこれらの細胞の役割の理解につながる機能性心臓免疫細胞の分離。13、14
このメソッドは、解剖学的なラットの剣状突起、腋窩および鎌状靱帯の位置、および心臓の心膜に精通している必要があります。これらのランドマークは、プロシージャの成功を増加させると心臓の免疫細胞のより高い利回りを確保することが重要です。これらの孤立した心臓の免疫細胞は、機能性、表現型、成熟度、および他の心臓の細胞との共培養実験その相互作用の理解を得るための特性評価に使用することができます。
Protocol
1。ハンクスバランス塩溶液の調製（HBSS）
- オートクレーブ1Lのガラスビーカー、1000mLのはメスシリンダー、そしてバーをかき混ぜる。
- 再蒸留水で900mLのマークにオートクレーブ1リットルのガラス製ビーカーにHBSS粉のソリューションを再構築。
- ヘペスのNa +塩3.4 gをとりHBSS溶液を混和し、濃塩酸や水酸化ナトリウムのいずれかを使用して7.35から7.41の間の値にpHを調整する。
- 所望のpHが達成し、安定した状態でされると、アルブミンが完全に溶解するまで室温で溶液にウシ血清アルブミン5gを加える。
- 総量1000 mlのマークになるまでのソリューションに、antimyotic、抗生物質と蒸留水10 mLを加え。
- 徹底的に解決策をかき混ぜる。
- HBSS溶液をフィルタリングし、後で使用するために50mlのファルコンチューブに分離。追加のチューブが凍結し、後日使用することができます。
2。動物PreparatioN - 気管チューブの挿入
- 気管チューブ（すなわち、鉗子、はさみ、気管チューブは3-0の黒い編み糸、小動物の人工呼吸器、等）の挿入のために必要な機器や材料でトレイを準備します。
- ラットは1キシラジン〜2ケタミンの割合でケタミン/キシラジンカクテルと完全に麻酔になると、ラットの腹部、胸部、そして喉を削る。深い麻酔状態が達成されていることを保証するために、ラットのつま先をつまむと四肢のペダルの撤退を確認してください。ラットは、すべての切開を行う前に、深く麻酔であることを確認します。
- 30 °の角度で傾斜したまな板の上上げ、その頭を持つネズミを配置
- 半ば腹部から下顎下に皮膚切開を行います。気管を露出させる前頸三角の筋を離れて解剖。
- 気管の下に3から0黒い編み糸を置きます。
- 軟骨環の間の気管の切開を加えますD気管チューブを挿入します。気管に気管チューブを固定するために緊密に縫合糸を結びます。
- 小動物の人工呼吸器に気管チューブを接続します。
3。免疫細胞分離のための計器の準備
- 免疫細胞の単離法のための機器（すなわち、鉗子、はさみ、HBSS、針クイックカテーテルを介してソフトテフロン24ゲージバクスター血管内をトリミング）してトレイを準備します。
- two 10ccの注射器を準備し、心膜嚢と予備のセルを含むHBSSを吸引するためのもう一つのバッファを導入するためのHBSSを使用すると、ワンシリンジを埋める。
3.2.1。分離の手続きのための元の長さの1 / 2〜3 / 4針クイックカテーテル（1.6センチ）以上の24ゲージバクスター血管内のテフロンチップを減らす。
- すべての注射器、バッファ、および空の15 mLのファルコンチューブ（手続きが終了後、抽出液を保持するため）氷の上に置きます。
- あなたが剣状突起に到達するまで腹壁（白線に沿って）に正中切開を加えます。
- 剣状突起にわずかに横方向の開始、腋窩に向かって斜めに継続的な胸郭を通じて二国間の切開を行います。肺、心臓、または心膜を穿孔しないように注意してください。
- 胸骨の両側の切開が完了したら、内側の側面切削、下部肋骨からダイアフラムを離れて解剖。
注意：心膜が損傷を避けるためにダイアフラムと胸骨に接続されている箇所の今まで注意してください。心膜はダイアフラムの反対側に接続されている場所に注意するランドマークとして、肝鎌状間膜を使用してください。心膜が切断された場合も、細胞を単離する能力は失われます。
- ゆっくりと胸腔と心を（まだ心膜でカプセル化された）公開する胸郭の片側を持ち上げて。
- HBSSにシリンジを取ると心膜嚢のポイントを見つける胸骨と心臓の間に約半分の方法を（好ましくは吻側尾側より）と心の両方の層を介し短縮クイックカテーテルのテフロンチップを挿入。
- カテーテルを設置したら、HBBSバッファの2〜3mlで心膜腔を埋める優しく進んでください。あなたが心膜腔が拡大して気づいたときにカテーテルが適切に配置されている場合は、すぐにわかります。ない充填が目撃されていない場合は、クイックカテーテルを撤回し、再配置。
- 心膜嚢がいっぱいになると、他の10 ccシリンジを取ると心に戻って先端を配置し、バッファーを吸引開始。同じエントリの穴を使用することができますまたは別のを作成することができます。特に心臓の下側に、吸引を提供しながら、先端は心膜嚢の壁に近すぎて来ていないことを確認してください。これは、細胞含有細胞の心膜嚢と損失を穿刺する可能性がありますS.
- バッファーを吸引しながら、カテーテルの先端はできるだけ多くのバッファを収集するために、心膜の内部を移動することができます。
注：もしあなたが少し心を引き裂き、元の穴より大きい心臓の上部に穴を開けて、そうすることで、慌てる必要はありません。限り、心膜はまだ十分な心のを囲むようにあなたはまだバッファより少ない量ではあるが、心臓を経由して別の洗浄を行うことができます。細胞の最適な量のコレクションの場合、3〜4追加の洗浄が必要である。
- 氷の上に配置されたファルコンチューブに抽出されたバッファに置きます。
- さらなる研究のために必要な場合は心臓、肺、および/またはその他の組織を削除します。免疫細胞と他の組織の集まりの後、ラットは、迅速かつ人道的に安楽死でなければならない。
- 4で200グラム℃で10分間のために収集された免疫細胞のサンプルを遠心常に氷上でチューブを保持しないときは、使用中である。
- HycloneバッファまたはHBSSを1 mLの上清と再構成ペレットを取り外します。
注：免疫細胞の単離手順の後、各心臓から得られる免疫細胞の数をカウントすることが重要です。
5。代表的な結果：
トルイジンブルーおよびサフラニンO /アルシアンブルーで、この手法で染色を用いて得られた分離された心臓の肥満細胞の例はそれぞれ、図2Aおよび2Bに示されている。図3に、心臓のマストに見られるように、そのような化合物の80分の48とモーガンらに説明されているようにサブスタンスPとして知られている活性剤で処理した後にヒスタミンを放出する能力を維持した。CD4のフローサイトメトリーから9代表的な散布図+細胞はとCD8 +細胞は、それぞれ図4および図5で提示されています。 T -リンパ球は、さらにこの技術から細胞集団として同定と表現型されています。
心臓の免疫細胞の単離手順の図1。フローチャート。
トルイジン青（）と（B）サフラニンO /アルシアンブルーである： 図2心臓の肥満細胞の組織学的代表的なイメージは次のように染色されています。。
図3。心臓の肥満細胞の機能研究心外膜心筋部位から分離し、化合物80分の48（10μg/mL）およびサブスタンスP（10μM）で刺激した。
図4。分離されたCD4 +細胞のサブスタンスP（1:100 dilutで標識の代表的なフローサイトメトリーの散布図イオン）。
図5。サブスタンスP（1:100希釈）で標識単離したCD8 +細胞の代表的なフローサイトメトリー。
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Discussion
心臓の免疫細胞を単離するこのメソッドは通常、伝統的な酵素消化の単離技術の間に発生する不要な活性化することなく、機能、表現型、および成熟度の分析を可能にします。この手法で得られた細胞の平均合計数は、ラットの心臓あたり約40万であり、そしてこれらの細胞の差の染色とフローサイトメトリー分析は、T -リンパ球の混合集団（〜70％）、マクロファージ（〜12％）と肥満細胞とを示しているこの技術の使用。（〜12％）13、その14は 、心臓の免疫細胞集団のさらなる分離のための精製法が必要とされています。単離された免疫細胞は、機能の研究、フローサイトメトリー、immunofluroescence、および共培養実験を含む複数のアプリケーションに使用することができます。さらに精製すると実験で、これらの単離された細胞は、心臓リモデリングの過程における免疫システムの役割を理解するための便利なツールを提供しています。
ラットは標準的な環境条件下で飼育し、商業ラット固形飼料および水道水を自由に維持した。すべての研究は、実験動物の管理と利用のための健康ガイドの国立研究所の原則に準拠し、サウスカロライナ州機関の動物実験委員会の大学により承認された。実験的なエンドポイントでの麻酔は2ケタミン1〜キシラジンの割合でケタミン/キシラジンカクテルの影響を受けました。これは、非不胎化の楽器の使用を許可nonsurvival手順、です。免疫細胞と他の所望の組織を単離した後、ラットは急速であり、人道的にげっ歯類（例えば瀉血、頸椎脱臼、または麻酔薬過剰投与）のための安楽死についてアメリカ獣医学協会のガイドラインによると安楽死。
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Disclosures
我々は、開示することは何もない。
Acknowledgments
この作品は、UNCF -メルク大学院科学研究論文フェローシップ（JLM）、国立心臓、肺、血液研究所の助成金RO1 - HL - 62228（JSJ）とRO1 - HL - 073990（JSJ）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma-Aldrich | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water | |||
| Table of Specific Equipment: | |||
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 | |
References
- Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).
- Brower, G. L., Janicki, J. S. Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats. Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).
- Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).
- Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).
- Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat. Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).
- Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure. Cytokine. 34, 284-290 (2006).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis. Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).
- Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure. Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).
- Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats. Circulation. 97, 1382-1391 (1998).
- Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion. Circulation. 98, 699-710 (1998).
- Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).
- Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells. Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).
- Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart. Hypertension. 55, 270-276 (2010).
- Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. A novel technique for isolating functional mast cells from the heart. Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).
