Summary
마음에서 기능적 면역 세포를 분리를위한이 방법은 이러한 세포의 감소 반응의 결과로, 원치 않는 면역 세포 활성화의 원인이 collagenase의 소화의 종래의 방법에 대한 대안을 제공합니다. 격리 우리의 방법은 효소 소화와 관련된 문제를 피함으로써 기능 심장병 면역 세포를 산출.
Abstract
심장 면역 세포들은 많은 심장 질환의 병리 리모델링에서 재생 역할에 대한 관심을 쫒아오고 있습니다 마스트 세포, T - 세포 및 macrophages 포함 1-5 이들 면역 세포;. 저장하고 크린 시토킨 및 포함하여 생물학적으로 활성 중재자 다양한 릴리스 같은 tryptase 같은 프로 테아제. 6-8이 중재자는 매트릭스 metalloproteinases를 활성화하거나 modulating 심장 섬유아 세포 '기능에 의해 콜라겐 축적을 유발하여 세포외 기질 대사의 주요 선수로 표시되었습니다. 9-11하지만, 심장 면역 세포를 분리에 사용할 기술이있다 그들은 심근 조직을 소화 박테리아 collagenase을 사용하기 때문에 문제가되었습니다. 이 기술은 면역 세포의 활성화 및 따라서 기능의 손실을 초래합니다. 예를 들어, 심장 마스트 세포가 degranulation의 원인이 화합물에 훨씬 적은 반응이된다. 12 따라서, 우리는 t을 허용하는 기술을 개발그는 심장 질환에서 이러한 세포의 역할에 대한 이해로 이어질 것입니다 기능적 심장 면역 세포의 분리. 13, 14
이 방법은 심장의 해부 쥐의 검상 돌기 프로세스, 겨드랑이와 낫 모양의 제품 인대의 위치, 그리고 심낭과 친숙이 필요합니다. 이러한 랜드마크 프로 시저의 성공을 증가하고 심장 면역 세포의 높은 수율을 보장하기 위해 중요합니다. 이러한 격리 심장 면역 세포는 그 기능 표현형, 만기, 그리고 다른 심장 세포와 공동 배양 실험들은 상호 작용의 더 나은 이해를 얻을 수의 특성에 사용될 수 있습니다.
Protocol
1. 행크스 '잔액 소금 솔루션의 준비 (HBSS)
- 압력솥 1 L의 유리 비커는 1000 ML은 실린더 졸업하고, 바 저어.
- 두 번 증류수로 900 ML 표시에 autoclaved 1 L의 유리 비커에 HBSS 분말 솔루션 Reconstitute.
- Hepes 나 + 소금 3.4 g와 HBSS 용액을 혼합하고 집중 HCL 또는 NaOH을 사용 7.35-7.41 사이의 값을 산도를 조정합니다.
- 원하는 산도가 획득하고 안정적인 유지되면 알부민이 완전히 해소되기 전까지 실온에서 솔루션에 알부민 소 혈청 5g을 추가합니다.
- 전체 볼륨 1000 ML 표시에까지 솔루션, antimyotic, 항생제를 두 번 증류수 10 ML을 추가합니다.
- 철저하게 솔루션을 저어.
- HBSS 용액을 필터하고 나중에 사용하기 위해 50 ML 팔콘 튜브에 그것을 구분합니다. 추가 튜브는 냉동과 나중에 사용할 수 있습니다.
2. 동물 PreparatioN - Tracheal 튜브의 삽입
- 필요한 악기 및 tracheal 튜브 (즉, 포셉, 가위, tracheal 튜브 3-0 블랙 꼰의 봉합, 작은 동물 환풍기 등) 삽입에 대한 자료와 트레이를 준비합니다.
- 쥐 1 xylazine 2 케타민을의 비율에 케타민을 / xylazine 칵테일과 함께 완전히 anesthetized되면, 쥐의 복부, 가슴, 그리고 목구멍을 면도. 깊은 마취 상태가 달성되었는지 확인하려면, 쥐의 발가락을 꼬집어 및 사지의 페달 철회 있는지 확인하십시오. 쥐의 모든 incisions하기 전에 깊은 anesthetized 있는지 확인하십시오.
- 30 ° 각도로 경사하는 도마에 제기 머리와 쥐 장소
- 중반 복부에서 아래턱 아래로 피부 절개를합니다. 기관을 노출하기 위해 목 앞쪽에 삼각형의 근육을 멀리 해부하다.
- 기관에 따라 3-0 검은 꼰 치료를 놓습니다.
- 연골 고리 사이의 기관에 절개를합니다D tracheal 튜브를 삽입합니다. 기관에 tracheal 튜브를 확보하기 위해 단단히 봉합을 묶어.
- 작은 동물의 호흡에 tracheal 튜브를 연결합니다.
3. 면역 세포의 격리를위한 악기 준비
- 면역 세포 격리 절차에 대한 인 스트 루먼트 (즉, 포셉, 가위, HBSS, 바늘 빠른 선배를 통해 소프트 테플론 24 게이지 박스터 intravascular을 다듬은 사람)와 트레이를 준비
- 이 10cc 주사기를 준비, HBSS가 들어있는 세포를 aspirating위한 pericardial SAC 및 보유, 다른 하나에 버퍼를 소개하는 HBSS 한 주사기를 입력하십시오.
3.2.1. 격리 절차 원래 길이의 1 / 2 4분의 3으로 바늘 빠른 선배 (1.6 ㎝) 이상 24 게이지 박스터 intravascular의 테플론 팁을 줄이십시오.
- 모든 주사기, 버퍼, 그리고 빈 15 ML 팔콘 튜브 (절차가 완료되면 압축을 푼 유체를 잡아) 얼음에 놓으십시오.
- 당신은 칼 모양의 프로세스를 도달할 때까지 복부 벽 (linea 알바 따라)에 중간선 절개를합니다.
- 약간 옆으로 칼 모양의 프로세스 시작, 겨드랑이쪽으로 각도로 계속 갈빗대를 통해 양국 incisions합니다. 폐, 심장, 또는 심낭을 구멍하지 않도록주의하십시오.
- 흉골 양쪽에 incisions가 완료되면, 중간에 가로 절단, 낮은 갈비에서 다이어프램 멀리 해부하다.
참고 : 심낭의 다이어프램과 손상을 방지하려면 흉골에 연결하여 어디까지 인식한다. 심낭은 횡경막의 반대편에 연결되어있는 곳을 참고하는 랜드마크로 낫 모양의의 인대를 사용합니다. 심낭을 절단하는 경우 또한, 세포를 분리하는 기능이 손실됩니다.
- 부드럽게 흉강과 마음을 (여전히 심낭에 의해 캡슐) 노출 ribcage 한쪽 리프트.
- HBSS 채워진 주사기를 가지고 흉골과 심장 (선호 더 주동이의 꼬리 이상) 사이의 약 절반 방법 pericardial SAC의 지점을 찾아의 테플론 팁을 삽입 심낭의 두 층을 통해 신속 - 캐서린 단축.
- 카테 테르가 자리에되면, HBBS 버퍼 2 ~ 3 ML과 pericardial 공간을 채우기 부드럽게 진행합니다. 당신은 pericardial 공간이 확장 통보시 카테 테르가 올바르게 위치하면 즉시 알 수 있습니다. 더 충전이 목격되지 않으면 철회하고 빠른 선배를 재조 정할.
- pericardial SAC가 채워진 경우, 다른 10 CC에 주사기를 가지고 심낭에 다시 팁을 장소와 버퍼를 aspirating 시작합니다. 동일한 항목 구멍 사용할 수 있습니다 또는 다른가 만들 수 있습니다. 특히 심장의 아래쪽에 흡입을 제공하면서 끝이 pericardial SAC의 벽에 너무 가까이 오지 않는 있는지 확인하십시오. 이것은 세포가 포함된 세포의 pericardial SAC와 손실을 펑쳐링으로 이어질 수S.
- 버퍼 aspirating 동안 카테 테르 팁은 가능한 한 많은 버퍼를 수집하기 위해 pericardial SAC 내부 주위를 이동할 수 있습니다.
참고 : 이렇게 여러분이 약간 심장막 찢어하고 원래 구멍보다 큰 가슴의 상단에있는 구멍을 만들어 않아도 당황하지 마십시오. 한 심장막 아직 충분히 마음을 주변으로 당신은 여전히 버퍼의 낮은 양의 불구하고 가슴에 또 다른 씻고을 수행할 수 있습니다. 세포의 최적의 금액 수집, 3-4 추가적인 세척이 필요합니다.
- 얼음에 놓여 있던 팔콘 튜브로 추출 버퍼를 놓습니다.
- 심장이나 폐, 및 / 또는 추가 연구를 위해 필요한 경우 다른 조직을 제거합니다. 면역 세포 및 기타 조직의 수집 후, 쥐 신속하게 그리고 편안하게 euthanized해야합니다.
- 4 200g에서 10 분 ° C.에 대한 수집 면역 세포 샘플을 원심 분리기 항상 얼음에 튜브를 유지사용하지 않을 때 인치
- Hyclone 버퍼 또는 HBSS 1 ML에 뜨는와 reconstitute 펠렛을 제거합니다.
참고 : 면역 세포 격리 절차 후 각 마음에서 얻은 면역 세포의 수를 계산하는 것이 중요합니다.
5. 대표 결과 :
toluidine 파란색과 safranin O / alcian 파란이 기술과 스테인드로 얻은 고립 심장 마스트 세포의 예제는 각각 2A 및 2B 수치로 표시됩니다. 그림 3, 심장 마스트에서 볼 수 있듯이, 같은 화합물 80분의 48과 모건 외에서 설명한대로 물질 P로 알려진 activators와 치료 후 히스타민을 풀어 자신의 능력을 유지. CD4의 유동세포계측법에서 9 대표 분산형 플롯 + 세포와 CD8 + 세포는 각각 그림 4와 5에 제공됩니다. T - lymphocytes는 더욱 식별이 기술에서 세포 인구로 phenotyped 있습니다.
심장 면역 세포 격리 절차의 그림 1. 플로우 차트.
. 심장 마스트 세포의 그림 2 Histological 대표 이미지는 다음과 같이 스테인드 있습니다 : (A) toluidine 청색과 함께 (B) safranin O / alcian 파란색입니다.
그림 3. epicardial 심근 지역에서 분리된 화합물 80분의 48 (10μg/mL)와 물질 P (10μM)로 자극을 심장 마스트 세포의 기능 연구.
그림 4. 격리 CD4 + 세포 물질 P (1:100 dilut으로 표시 대표 유동세포계측법의 분산형 플롯이온).
그림 5. 물질 P (1:100 희석)로 표시 격리 CD8 + 세포의 대표 유동세포계측법.
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Discussion
심장 면역 세포를 분리 이러한 방법은 일반적으로 전통적인 효소 소화 절연 기술 중에 발생하는 원치 않는 작동하지 않고 자신의 기능, 표현형, 그리고 성숙의 분석을 수 있습니다. 이 기술을 얻은 세포의 평균 총수는 쥐 심장 당 400,000 주위되며, 이러한 세포의 차동 얼룩 및 유동세포계측법 분석 T - lymphocytes의 혼합 인구 (~ 70 %), macrophages (~ 12 %)와 마스트 세포와를 나타냅니다 이 기법의 사용. (~ 12 %). 13, 따라서 14, 심장 면역 세포 인구의 자세한 분리 정제 방법이 필요합니다. 절연 면역 세포 기능 연구, 유동세포계측법, immunofluroescence 및 공동 문화 실험을 포함하여 여러 어플 리케이션에 사용할 수 있습니다. 더 정화 및 실험을 통해 이러한 고립된 전지 심장 리모델링의 과정에서 면역 체계의 역할을 이해하는 유용한 도구를 제공합니다.
쥐 표준 환경 조건 하에서 보관되어과 상업 쥐 차우와 수돗물 광고 libitum에 유지했다. 모든 연구는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 건강 가이드의 국립 연구소의 원칙에 맞췄나와 사우스 캐롤라이나 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. 실험 종료 시점에서 마취 2 케타민을 1 xylazine의 비율로 케타민을 / xylazine 칵테일에 의해 영향을했다. 이것은 unsterilized 악기의 사용을 허용 nonsurvival 절차입니다. 면역 세포와 다른 원하는 조직의 분리 후, 생쥐가 급속하게되었고 편안하게 설치류 (예 : 과다, 자궁 전위, 또는 마취 과다 복용)에 안락사에 대한 미국 수의학 의료 협회 가이드라인에 따라 euthanized.
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Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 UNCF - 머크 대학원 과학 연구 논문 장학생 (JLM), 국립 심장, 폐, 및 혈액 연구소 부여 RO1 - HL - 62228 (JSJ)와 RO1 - HL - 073990 (JSJ)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma-Aldrich | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water | |||
| Table of Specific Equipment: | |||
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 | |
References
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