Isolering av Funksjonelle Cardiac immunceller

Summary

Denne metoden for å isolere funksjonelle immunceller fra hjertet gir et alternativ til konvensjonelle metoder for collagenase fordøyelsen, noe som fører til uønskede immunceller aktivering, som resulterer i en redusert respons av disse cellene. Vår metode for isolering gir funksjonelle kardiale immune celler ved å unngå problemer knyttet til enzymatisk fordøyelse.

Abstract

Cardiac immunceller er økende interesse for rollene de spiller i den patologiske remodeling i mange hjertesykdommer ^1-5 Disse immunceller, som inkluderer mast celler, T-celler og makrofager;. Lagre og utgi en rekke biologisk aktive mediatorer inkludert cytokiner og proteaser som tryptase. ^6-8 Disse mediatorer har vist seg å være sentrale aktører i ekstracellulær matrix metabolismen ved å aktivere matrix metalloproteinaser eller forårsaker kollagen opphopning av modulating den kardiale fibroblaster "funksjon. ^9-11, men tilgjengelige teknikker for å isolere kardiale immunceller har vært problematisk fordi de bruker bakteriell collagenase å fordøye hjerteinfarkt vev. Denne teknikken fører til aktivering av immunceller og dermed tap av funksjon. For eksempel hjertestans mast celler blir betydelig mindre mottakelig for forbindelser som forårsaker degranulation. ¹² Derfor har vi utviklet en teknikk som gjør det mulig for than isolering av funksjonelle kardiale immunceller som ville føre til en bedre forståelse av hvilken rolle disse cellene i hjertesykdom. ^{13, 14}

Denne metoden krever en fortrolighet med den anatomiske plasseringen av rotte er xiphoid prosess, armhulen og falciform ligament, og perikard av hjertet. Disse landemerkene er viktig å øke suksessen av prosedyren og for å sikre en høyere avkastning av hjertestans immunceller. Disse isolerte hjertestans immunceller kan deretter brukes for karakterisering av funksjonalitet, phenotype, modenhet og co-kulturen eksperimenter med andre kardiale celler for å få en bedre forståelse av deres vekselvirkninger.

Protocol

1. Utarbeidelse av Hanks 'Balance Salt Solution (HBSS)

1. Autoclave 1 L glass beger, uteksaminert 1000 ml sylinder, og rør bar.
2. Rekonstituer HBSS pulveret løsningen i autoklaveres 1 L glass beger til 900 ml merket med dobbelt destillert vann.
3. Bland HBSS løsning med 3,4 g Hepes Na + salt og juster pH til en verdi mellom 7,35 til 7,41 ved hjelp av enten konsentrert HCl eller NaOH.
4. Når ønsket pH er nådd og forblir stabil, tilsett 5 g bovint serum albumin til løsningen ved romtemperatur til albumin er helt oppløst.
5. Tilsett 10 mL av antibiotika, antimyotic, til løsningen og dobbelt destillert vann til det totale volumet er på 1000 ml merket.
6. Rør løsningen godt.
7. Filtrere HBSS løsningen og skille det inn 50 ml Falcon rør for senere bruk. Ekstra rør kan fryses og brukes på et senere tidspunkt.

2. Animal Preparation - Innsetting av trakealtuben

1. Forbered et brett med nødvendige instrumenter og materiale for innsetting av en trakealtuben (dvs. tang, saks, trakealtuben, 3-0 sort flettet sutur, små dyr ventilator, etc.).
2. Når rotte er helt bedøvet med en ketamin / xylazin cocktail i forholdet mellom to ketamin til 1 xylazin, barbere magen, brystet og halsen av rotte. For å sikre at en dyp narkose tilstand er oppnådd, klemme rotte sin tå og sjekk pedal tilbaketrekking av lem. Kontroller at rotte er sterkt bedøvet før alle snitt.
3. Plasser rotte med hodet hevet på et skjærebrett som er tilbøyelig til en 30 ° vinkel
4. Lag en hud snitt fra midten av magen til under underkjeven. Dissekere bort musklene i fremre triangelet av nakken for å eksponere luftrøret.
5. Plasser en 3-0 sort flettet sutur under luftrøret.
6. Lag et snitt i luftrøret mellom cartilaginous ringene end sette inn trakealtuben. Bind sutur tett for å sikre trakealtuben til luftrøret.
7. Koble trakealtuben til et lite dyr ventilator.

3. Instrument Forberedelse for Immune Cell Isolation

1. Forbered et brett med de instrumentene for immun celleisolasjon prosedyre (dvs. tang, saks, HBSS, trimmet myke Teflon 24 gauge Baxter intravaskulær løpet nålen hurtig-Cath)
2. Forbered to 10cc sprøyter, fylle en sprøyte med HBSS for iverksetting av buffer i perikard sac og reservere den andre for å aspirere til HBSS inneholder celler.

   3.2.1. Reduser Teflon spissen av 24 gauge Baxter intravaskulær løpet nålen hurtig-Cath (1,6 cm) med 1 / 2 til 3 / 4 av sin opprinnelige lengde for isolering prosedyren.

3. Plasser alle sprøyter, buffere, og en tom 15 ml Falcon Tube (for å holde ut væsken når prosedyren er ferdig) på is.

<p class = "jove_title"> 4. Immune celleisolasjon

1. Lag en midtlinjen snitt i bukveggen (langs linea alba) til du kommer til xiphoid prosessen.
2. Starte litt sideveis til xiphoid, foreta bilateral snitt gjennom brystkassen fortsatt i en vinkel mot armhulen. Vær forsiktig så du ikke perforere lungene, hjertet, eller hjerteposen.
3. Når snittene på begge sider av sternum er fullført, dissekere bort membranen fra den nederste ribbeina, cutting lateralt for mediale.

   Merk: Vær alltid oppmerksom på hvor hjerteposen kobles til membranen og sternum for å unngå skade. Bruk falciform ligament som et landemerke å merke hvor hjerteposen er festet på motsatt side av membranen. Også, hvis hjerteposen er kuttet, er evnen til å isolere cellene tapt.

4. Løft forsiktig den ene siden av brystkasse å avdekke brysthula og hjertet (fortsatt innkapslet av hjerteposen).
5. Ta HBSS sprøyten og finne et punkt i perikard sac omtrent halvveis mellom brystbenet og hjertet (helst mer rostral enn caudal) og sett Teflon spissen av den forkortede Quick-Cath gjennom begge lagene i hjerteposen.
6. Når kateteret er på plass, fortsetter forsiktig fylle perikard plass med 2 til 3 ml av HBBS buffer. Du vil vite umiddelbart hvis kateteret er riktig plassert når du merker at perikard plass ekspanderende. Hvis ingen fylling er vitne til, ta ut og flytte Quick-Cath.
7. Når perikard sac er fylt, ta den andre 10 cc sprøyte og sett spissen tilbake i hjerteposen og begynne å aspirere bufferen. Samme oppføring hullet kan brukes eller en annen kan opprettes. Pass på at spissen ikke kommer for nær veggene i perikard sac samtidig som det gir sug, spesielt på undersiden av hjertet. Dette kan føre til punktering av perikard sac og tap av celler som inneholder celles.
8. Mens aspirere bufferen, kan kateterspissen flyttes rundt inne i perikard sac for å samle så mye buffer som mulig.

Merk: Hvis du er i å gjøre det litt du rive hjerteposen og gjøre hullet på toppen av hjertet større enn den opprinnelige hullet, ikke få panikk. Så lenge hjerteposen omgir fortsatt nok av hjertet kan du fortsatt utføre en annen vaske over hjertet dog med en mindre mengde av buffer. For innsamling av en optimal mengde celler, er tre til fire ekstra vasker nødvendig.

9. Plasser ut buffer i Falcon rør som ble plassert på is.
10. Fjern hjerte, lunger, og / eller andre vev dersom det er nødvendig for videre studier. Etter samlingen av immunceller og andre vev, må rotte være raskt og humant avlives.
11. Sentrifuger de innsamlede immune celleprøver for 10 min på 200g ved 4 ° C. Alltid holde rørene på isnår den ikke er i bruk.
12. Fjern supernatanten og rekonstituere pelleten i 1 mL Hyclone buffer eller HBSS.

Merk: Det er viktig å telle antallet immunceller hentet fra hver hjerte etter immunceller isolasjon prosedyre.

5. Representant Resultater:

Et eksempel på isolerte hjertestans mastceller oppnådd med denne teknikken og farget med toluidin blå og safranin O / Alcian blå er presentert i figurene 2A og 2B, henholdsvis. Som man kan se i Figur 3, The hjertestans mast, vedlikeholdt deres evne til å frigjøre histamin etter behandling med kjente aktivatorer som compound 48/80 og substans P som beskrevet i Morgan et al. ^Ni representant spredningsplott fra flowcytometri av CD4 + celler og CD8 + celler er presentert i figurene 4 og 5, henholdsvis. T-lymfocytter er nærmere identifisert og phenotyped som en celle befolkning fra denne teknikken.

Figur 1. Flow diagram av kardiale immunceller isolasjon prosedyre.

. Figur 2 Histologiske representative bilder av hjertestans mast celler er farget som følger: (A) med toluidin blå og (B) er safranin O / Alcian blå.

Figur 3. Funksjonell studie av hjertestans mast celler isolert fra epikardiale hjerteinfarkt regionen og stimulert med sammensatte 48/80 (10μg/mL) og substans P (10μM).

Figur 4. Representative flowcytometri spredningsplott av isolerte CD4 + celler merket med Substans P (1:100 dilution).

Figur 5. Representative flowcytometri av isolerte CD8 + celler merket med Substans P (1:100 fortynning).

Discussion

Denne metoden for å isolere hjertestans immunceller muliggjør analyse av deres funksjon, phenotype, og modenhet uten uønskede aktivering som vanligvis oppstår under en tradisjonell enzymatisk fordøyelse isolasjon teknikk. Den gjennomsnittlige totale antall celler oppnådd med denne teknikken er rundt 400 000 per rotte hjerte, og differensial flekker og flowcytometri analyse av disse cellene indikerer blandet populasjon av T-lymfocytter (~ 70%), makrofager (~ 12%) og mast celler med bruken av denne teknikken. (~ 12%). ^{13, 14} Derfor er rensemetoder for videre separasjon av hjerte immunceller populasjoner nødvendig. Isolerte immunceller kan brukes for flere bruksområder, inkludert funksjonelle studier, flowcytometri, immunofluroescence, og co-kulturen eksperimenter. Med ytterligere rensing og eksperimentering, disse isolerte celler gir et nyttig verktøy for å forstå rollen av immunsystemet i ferd med hjertestans remodeling.

Rotter var plassert under standard miljøforhold og vedlikeholdes på kommersielle rotte Chow og springvann ad libitum. Alle studier likedannet prinsippene i National Institutes of Health Guide for Pleie og bruk av forsøksdyr, og ble godkjent av University of South Carolina institusjonens Animal Care og bruk komité. Anestesi ved eksperimentelle endepunkt var påvirket av ketamin / xylazin cocktail i forholdet 2 ketamin til 1 xylazin. Dette er en nonsurvival prosedyre, som tillater bruk av unsterilized instrumenter. Etter isolering av immunceller og andre ønskede vev, var rotten raskt og humant avlives ifølge American Veterinary Medical Association retningslinje om Avlivning for gnagere (f.eks exsanguination, cervical forvridning eller bedøvende overdose).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma-Aldrich	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	GIBCO, by Life Technologies	15240-062
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermo Fisher Scientific, Inc.	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water
Table of Specific Equipment:
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Inc.	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter Internationl Inc.	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483