Isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca

Summary

Este método para isolar células do sistema imunológico funcional do coração fornece uma alternativa aos métodos convencionais de digestão da colagenase, que causa a ativação de células imunes indesejadas, resultando em uma capacidade de resposta diminuiu dessas células. Nosso método de isolamento de rendimentos funcional cardíaca células do sistema imunológico, evitando os problemas associados com a digestão enzimática.

Abstract

Cardíacas células do sistema imunológico estão ganhando interesse para os papéis que desempenham no remodelamento patológico em muitas doenças cardíacas ^05/01 Estas células do sistema imunológico, que incluem os mastócitos, células T e macrófagos;. Armazenar e liberar uma variedade de mediadores biologicamente ativos, incluindo citocinas e proteases, como triptase. ^6-8 Esses mediadores têm se mostrado os jogadores-chave no metabolismo da matriz extracelular pela ativação de metaloproteinases de matriz ou causando acúmulo de colágeno por função modular os fibroblastos cardíacos. ^9-11 No entanto, as técnicas disponíveis para isolar células do sistema imunológico têm cardíaca sido problemática, porque eles usam a colagenase bacteriana para digerir o tecido do miocárdio. Esta técnica faz com que a ativação das células imunes e, portanto, uma perda de função. Por exemplo, cardíaco mastócitos tornam-se significativamente menos sensíveis aos compostos que causam degranulação. ^{12 Por} isso, desenvolvemos uma técnica que permite a tele isolamento de células do sistema imunológico funcional cardíaca que levaria a uma melhor compreensão do papel destas células na doença cardíaca. ^{13, 14}

Este método requer uma familiaridade com a localização anatômica do rato processo xifóide axila, e ligamento falciforme, e pericárdio do coração. Estes marcos são importantes para aumentar o sucesso do procedimento e garantir uma maior produção de células do sistema imunológico cardíaca. Estes isolados cardíaca células do sistema imunológico podem então ser utilizados para a caracterização do fenótipo, funcionalidade, maturidade e co-cultura experiências com outras células cardíacas para obter uma melhor compreensão de suas interações.

Protocol

1. Preparação de sal de Hanks Balance Solution (HBSS)

1. Autoclave um copo de vidro L, 1000 mL proveta graduada, e mexa bar.
2. Reconstituir a solução HBSS pó no copo de vidro autoclavados 1 L para a marca de 900 mL com água destilada duas vezes.
3. Misturar a solução HBSS com 3,4 g de sal Hepes Na + e ajustar o pH para um valor entre 7,35-7,41 usando HCL concentrado ou NaOH.
4. Uma vez que o pH desejado foi atingido e permanece estável, adicionar 5 g de soro albumina bovina para a solução à temperatura ambiente até que a albumina é completamente dissolvido.
5. Adicionar 10 mL da água antibiótico, antimyotic, para a solução e duplamente destilada até o volume total é de 1000 marca mL.
6. Agitar a solução completamente.
7. Filtrar a solução HBSS e separá-lo em 50 mL tubos Falcon para uso posterior. Tubos adicionais podem ser congelados e utilizados em uma data posterior.

2. PREPARAÇÃO animaisn - Inserção de tubo traqueal

1. Prepare uma bandeja com instrumentos necessários e material para inserção de um tubo traqueal (fórceps ou seja, tesoura, tubo traqueal, 3-0 sutura trançada preta, ventilador de pequenos animais, etc.)
2. Quando o rato é completamente anestesiado com um cocktail de cetamina / xilazina na proporção de 2 para 1 quetamina xilazina, raspar o abdômen, tórax e garganta do rato. Para garantir que um estado anestésico profundo foi alcançado, pinch dedo do rato e verificar se há retirada pedal do membro. Certifique-se que o rato está profundamente anestesiados antes de fazer todas as incisões.
3. Coloque o rato com a cabeça levantada em uma placa de corte que é inclinada em um ângulo de 30 °
4. Faça uma incisão na pele a partir de meados do abdômen para abaixo do maxilar inferior. Dissecar longe os músculos do triângulo anterior do pescoço para expor a traquéia.
5. Coloque um 3-0 sutura trançada preta sob a traquéia.
6. Faça uma incisão na traquéia entre os anéis cartilaginosos umd inserir o tubo traqueal. Amarre o fio firmemente para proteger o tubo traqueal até a traquéia.
7. Conecte o tubo traqueal a um ventilador de pequenos animais.

3. Preparação instrumento para isolamento de células imunes

1. Prepare uma bandeja com os instrumentos para o processo imunológico cela de isolamento (fórceps ou seja, tesouras, HBSS, aparados macio Teflon calibre 24 Baxter intravascular sobre a agulha quick-cath)
2. Prepare duas seringas 10cc, encha uma seringa com HBSS para a introdução do tampão dentro do saco pericárdio e reservar a outra para aspirar as células contendo HBSS.

   3.2.1. Reduzir a ponta de teflon do calibre 24 Baxter intravascular sobre a agulha quick-cath (1,6 cm) por 1 / 2 a 3 / 4 de sua extensão original para o procedimento de isolamento.

3. Coloque todas as seringas, buffers, e um vazio 15 mL do tubo Falcon (para conter o fluido extraído uma vez o procedimento esteja concluído) no gelo.

<class = p "jove_title"> 4. Isolamento de células imunes

1. Faça uma incisão mediana na parede abdominal (ao longo da linha alba) até chegar ao apêndice xifóide.
2. Começando um pouco lateralmente ao processo xifóide, fazer incisões bilaterais através da caixa torácica contínua em um ângulo em direção à axila. Tenha cuidado para não perfurar o pulmão, coração ou pericárdio.
3. Uma vez que as incisões em ambos os lados do esterno são completos, dissecar afastado do diafragma das costelas inferiores, o corte lateral para medial.

   Nota: Esteja sempre ciente de onde o pericárdio se conecta ao diafragma e esterno para evitar danos. Use o ligamento falciforme como um marco para observar onde o pericárdio é anexado no lado oposto do diafragma. Além disso, se o pericárdio é cortado, a capacidade de isolar as células é perdido.

4. Levantar delicadamente um dos lados da caixa torácica para expor a cavidade torácica e do coração (ainda encapsulados pelo pericárdio).
5. Pegue na seringa preenchida e HBSS encontrar um ponto no saco pericárdico, aproximadamente a meio caminho entre o esterno eo coração (de preferência mais rostral do caudal) e insira a ponta de teflon da encurtado quick-cath através das duas camadas do pericárdio.
6. Uma vez que o cateter está em vigor, proceder gentilmente preencher o espaço pericárdico com 2 a 3 ml de tampão HBBS. Você saberá imediatamente se o cateter é colocado corretamente quando você percebe o espaço pericárdico em expansão. Se não houver preenchimento é testemunhado, retirar e reposicionar o quick-cath.
7. Quando o saco pericárdico é preenchido, tirar a seringa outros 10 cc e colocar a ponta de volta no pericárdio e começar a aspiração do buffer. O buraco mesma entrada pode ser usado ou de outra pode ser criada. Certifique-se que a ponta não vem muito perto das paredes do saco pericárdico, proporcionando sucção, especialmente na parte de baixo do coração. Isto poderia levar a punção do saco pericárdico e perda de células contendo célulass.
8. Enquanto aspiração do buffer, a ponta do cateter pode ser movido dentro do saco pericárdico, a fim de coletar tampão, tanto quanto possível.

Nota: Se ao fazê-lo um pouco rasgar o pericárdio e fazer o furo na parte superior do coração maior que o buraco original, não entre em pânico. Enquanto o pericárdio ainda cerca o suficiente do coração, você ainda pode realizar outra lavagem sobre o coração, embora com uma menor quantidade de buffer. Para a coleta de uma quantidade ideal de células, 3-4 lavagens adicionais são necessários.

9. Coloque o tampão extraído em tubos de Falcon que foram colocados no gelo.
10. Remover coração, pulmões, e / ou qualquer outro tecido, se necessário para estudos posteriores. Após a coleta de células do sistema imunológico e outros tecidos, o rato deve ser rápida e humanitariamente sacrificados.
11. Centrifugar a coletaram amostras de células imunes por 10 minutos a 200g a 4 ° C. Mantenha sempre os tubos no geloquando não em uso.
12. Remover o sobrenadante e reconstituir o sedimento em 1 mL de tampão ou Hyclone HBSS.

Nota: É importante contar o número de células imunes obtidos em cada coração após o procedimento imunológico cela de isolamento.

5. Resultados representativos:

Um exemplo isolado mastócitos cardíacos obtidos com esta técnica e corados com azul de toluidina e safranina O / alcian blue são apresentados nas figuras 2A e 2B, respectivamente. Como pode ser visto na Figura 3, O mastro cardíaca, mantiveram a sua capacidade de liberação de histamina após o tratamento com ativadores conhecidos, como composto 48/80 e substância P, conforme descrito no Morgan et al. ⁹ parcelas Representante dispersão de citometria de fluxo de células CD4 + e CD8 + são apresentados nas figuras 4 e 5, respectivamente. Os linfócitos T são ainda identificadas e fenotipadas como uma população de células a partir dessa técnica.

Figura Fluxograma 1. Procedimento de isolamento das células imunes cardíaca.

. Figura 2 imagens representativas histológica de mastócitos cardíacos estão manchadas como se segue: (A) com azul de toluidina e (B) são safranina O / alcian blue.

Figura 3. Estudo funcional de mastócitos cardíacos isolados da região epicárdica do miocárdio e estimulados com composto 48/80 (10μg/mL) e substância P (10μM).

Figura 4. Representante fluxo parcelas citometria de dispersão de CD4 + isoladas células marcadas com Substância P (1:100 diluindoion).

Figura 5. Citometria de fluxo Representante do isolado CD8 + células marcadas com Substância P (1:100).

Discussion

Este método de isolamento de células do sistema imunológico cardíaca permite a análise de sua função, o fenótipo, e maturidade, sem a ativação indesejados que normalmente ocorre durante a técnica de isolamento enzimático de digestão tradicional. O número médio total de células obtidas com esta técnica é de cerca de 400.000 por coração de rato, e coloração diferencial e análise de citometria de fluxo destas células indica população mista de linfócitos T (~ 70%), macrófagos (~ 12%) e mastócitos com o uso desta técnica. (~ 12%). ^{13, 14} Portanto, métodos de purificação de uma maior separação de populações de células imunes cardíacas são necessários. Isoladas células do sistema imunológico pode ser usado para várias aplicações, incluindo estudos funcionais, citometria de fluxo, immunofluroescence, e co-cultura experimentos. Com maior purificação e experimentação, estas células isoladas fornecer uma ferramenta útil para a compreensão do papel do sistema imunológico no processo de remodelação cardíaca.

Os ratos foram alojados em condições padrão ambiental e mantidos em ração comercial ad libitum e água da torneira. Todos os estudos conformados com os princípios do National Institutes of Health Guide para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pela Universidade de Carolina do Sul Cuidados Instituição Animal e Comitê Use. Anestesia no ponto final experimental foi afetado pelo cocktail ketamina / xilazina na proporção de 2 para 1 quetamina xilazina. Este é um procedimento não-sobrevivência, que permite a utilização de instrumentos não esterilizados. Após o isolamento das células do sistema imunológico e tecido desejado, o rato foi rápido e humanitariamente sacrificados de acordo com a American Veterinary Medical Association Orientação sobre a eutanásia para roedores (por exemplo, exsanguinação luxação, cervical, ou anestésico overdose).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma-Aldrich	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	GIBCO, by Life Technologies	15240-062
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermo Fisher Scientific, Inc.	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water
Table of Specific Equipment:
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Inc.	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter Internationl Inc.	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483