Summary
Этот метод выделения функциональных иммунных клеток из сердца представляет собой альтернативу обычным методам коллагеназы пищеварение, что приводит к нежелательной активации иммунной клетки, в результате чего снизилась чувствительность этих клеток. Наш метод изоляции дает функциональной сердечной клетки иммунной системы, избегая проблем, связанных с ферментативного пищеварения.
Abstract
Сердечные клетки иммунной системы приобретают интерес к роли, которую они играют в патологический ремоделирования во многих сердечных заболеваний 1-5 Эти клетки иммунной системы, в том числе тучные клетки, Т-клетки и макрофаги;. Хранение и различных биологически активных медиаторов, включая цитокины и протеазы, такие как триптазы. 6-8 Эти посредники было показано, что ключевую роль в метаболизме внеклеточной матрицы, активизируя матричных металлопротеиназ или причинение коллагена накопления модулирующей функции сердечных фибробластов. 9-11 Тем не менее, имеющиеся методы для выделения сердечной клетки иммунной системы имеют было проблематично, поскольку они используют бактериальные коллагеназы переваривать ткани миокарда. Этот метод вызывает активацию иммунных клеток и, следовательно, потеря функции. Например, сердечные тучные клетки становятся значительно менее чувствительны к соединениям, которые вызывают дегрануляцию 12. Поэтому мы разработали методику, которая позволяет тОн изоляции функциональных сердечных клеток иммунной которые привели бы к более глубокому пониманию роли этих клеток в сердечной болезни. 13, 14
Этот метод требует знакомства с анатомического расположения мечевидного отростка крысы, подмышечной впадины и серповидной связки, и перикарда сердца. Эти ориентиры важны для увеличения успеха процедуры и обеспечить более высокую доходность сердечных клеток иммунной системы. Эти изолированные иммунные клетки сердечной затем могут быть использованы для характеристики функциональности, фенотип, зрелость и совместное культуры эксперименты с другими сердечными клетками, чтобы получить лучшее понимание их взаимодействия.
Protocol
1. Подготовка баланса солевой раствор Хэнкса (HBSS)
- Автоклав 1 л стеклянный стакан, 1000 мл, мерный цилиндр, и движение бар.
- Развести HBSS решение порошка в автоклаве 1 л стеклянный стакан на 900 мл знаком с двойным дистиллированной воды.
- Смешайте HBSS решение с 3,4 г соли Hepes Na + и отрегулировать рН до значения между 7.35-7.41, используя либо концентрированной соляной кислоты или раствором NaOH.
- Как только желаемый рН достигнуто и остается стабильным, добавьте 5 г бычьего сывороточного альбумина в растворе при комнатной температуре до альбумина полностью не растворится.
- Добавить 10 мл антибиотика, antimyotic, к решению и дважды дистиллированной водой до общего объема в 1000 отмечать мл.
- Перемешать раствор тщательно.
- Фильтры HBSS решение и разделить его на 50 мл труб Сокола для дальнейшего использования. Дополнительные трубки могут быть заморожены и использованы на более поздний срок.
2. Животное Препаратыга - Введение интубационной трубки
- Подготовка лоток с необходимыми инструментами и материалом для вставки трахеи трубки (например, щипцы, ножницы, эндотрахеальная трубка, 3-0 черный плетеный шовный, небольшой вентилятор животных и т.д.).
- Как только крысы полностью анестезии с кетамином / ксилазина коктейль в соотношении 2 к 1 кетамин ксилазина, побрить живот, грудь и горло крыса. Чтобы убедиться, что состояние глубокого анестезии была достигнута, щепотка ног крысы и проверить его на педаль вывода конечности. Убедитесь, что крысы глубоко под наркозом, прежде чем все разрезы.
- Место крысы с поднятой головой на разделочную доску, которая наклонена под углом 30 °
- Сделайте разрез кожи от середины живота до уровня ниже нижней челюсти. Рассеките от мышц передней треугольник шеи, чтобы разоблачить трахеи.
- Место 3-0 черный плетеный шовный материал под трахеи.
- Сделайте надрез в трахее между хрящевых колецг вставить трахеи трубки. Tie шва плотно для обеспечения трахеи трубки в трахею.
- Подключите трахеи трубки небольшого вентилятора животного.
3. Инструмент Подготовка к иммунной изолятор
- Подготовка лоток с инструментами для иммунной процедуры изолятор (например, щипцы, ножницы, HBSS, отделанные мягкой тефлоновой калибра 24 Бакстер внутрисосудистого на иглу быстро катода)
- Приготовьте два 10cc шприца, заполнить один шприц для введения HBSS буфера в перикард и резервный другой для аспирационных HBSS, содержащих клетки.
3.2.1. Уменьшить кончик тефлон из калибра 24 Бакстер внутрисосудистого на иглу быстро катод (1,6 см) на 1 / 2 до 3 / 4 своей первоначальной длины для выделения.
- Поместите все шприцы, буферы, и пустой 15 мл Сокол Тюбе (провести извлечения жидкости однажды процедура закончена) на льду.
- Сделайте срединный разрез в брюшной стенке (по белой линии) пока не дойдете до мечевидного отростка.
- Начиная чуть сбоку от мечевидного отростка заключать двусторонние разрезы через грудную клетку продолжается под углом к подмышечной впадине. Будьте осторожны, чтобы не перфорировать легкие, сердце, или перикарда.
- После разреза по обе стороны грудины являются полными, рассекают от диафрагмы от нижних ребер, резка сбоку от медиального.
Примечание: все знают, где перикарда соединяется с диафрагмой и грудины, чтобы избежать повреждений. Используйте серповидной связки в качестве ориентира, чтобы отметить, где перикарда крепится на противоположную сторону диафрагмы. Кроме того, если перикарда режется, способность изолировать клетки теряется.
- Аккуратно поднимите одну сторону грудной клетки, чтобы разоблачить грудной полости и сердца (еще инкапсулируется перикарда).
- Возьмите HBSS заполненный шприц и найти точку в перикард примерно на полпути между грудиной и сердцем (желательно больше, чем ростральной хвостового) и вставьте наконечник тефлоновым укороченного быстрого катода через оба слоя перикарда.
- Как только катетер находится в месте, идти осторожно заполнить перикарда пространство с 2 до 3 мл буфера HBBS. Вы будете знать сразу же, если катетер правильно установлен, когда вы заметите перикарда пространство расширяется. Если ни один наполнение свидетелем, снимать и перемещать быстрого катода.
- Когда перикард заполнен, принять другие 10 мл шприц и поместите наконечник обратно в перикард и начала аспирационной буфера. Же отверстие, запись может быть использована или другой может быть создан. Убедитесь, что совет не слишком близко к стенам перикард, обеспечивая всасывание, особенно в нижней части сердца. Это может привести к прокалывание перикард и потеря клеточных-содержащих клеточныхs.
- Хотя аспирационных буфера, катетера могут быть перемещены внутри перикард для того, чтобы собрать как можно больше буфера, насколько возможно.
Примечание: Если при этом вы чуть слезу перикарда и сделать отверстие в верхней части сердца больше, чем оригинальный дыру, не паникуйте. Пока перикарда по-прежнему окружает достаточно сердца вы все еще можете совершать другие переливаться через сердце хотя и с меньшим количеством буфера. Для сбора оптимального количества клеток, три-четыре дополнительных моет необходимы.
- Место извлечения буфера в трубах Сокола, которые были размещены на льду.
- Удалить сердце, легкие, и / или любой другой ткани, если это необходимо для дальнейших исследований. После сбора клеток иммунной системы и других тканей, крысы должны быть быстро и гуманно усыпляют.
- Центрифуга собраны образцы иммунная клетка в течение 10 мин при 200 г при температуре 4 ° C. Всегда держите труб на льдукогда он не используется.
- Удалить супернатант и восстановить гранул в 1 мл буфера Hyclone или HBSS.
Примечание: Очень важно для подсчета количества иммунных клеток, полученных из каждого сердца после процедуры иммунной изоляторе.
5. Представитель Результаты:
Примере изолированных клеток сердца мачты, полученные с этой техникой и окрашенных толуидиновым синим и сафранина O / Альциановый голубой представлены на рис 2А и 2В, соответственно. Как видно на рисунке 3, сердечной мачты, сохранили свою способность гистамина после лечения с известными активаторы, такие как соединение 48/80 и субстанция Р, как описано в Morgan и др. 9. Представителю разброс участков из проточной цитометрии клеток CD4 + и CD8 + клеток, представлены на рисунках 4 и 5, соответственно. Т-лимфоциты более четкого определения и phenotyped как клеточную популяцию от этой техники.
Рисунок 1. Блок-схема процедуры сердечной иммунной изоляторе.
. Рисунок 2 Гистологическое изображений представитель сердечной тучных клеток окрашиваются следующим образом: () толуидиновым синим и (Б) сафранина O / Альциановый синий.
Рисунок 3. Функциональное исследование сердечной тучных клеток изолирован от эпикарда инфаркта региона и стимулировали соединения 48/80 (10μg/mL) и субстанция Р (10 мкм).
Рисунок 4. Представителю проточной цитометрии графиков разброса изолированных клеток CD4 + помечены Вещество Р (1:100 dilutион).
Рисунок 5. Представителю проточной цитометрии изолированных CD8 + клеток, меченных Вещество Р (1:100 разведение).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот метод выделения сердечной клетки иммунной системы дает возможность анализа их функции, фенотип, и зрелость без нежелательных активации, который обычно происходит во время традиционного ферментативную технику изоляции пищеварения. Среднее общее число клеток, полученных с помощью этой техники составляет около 400 тысяч в сердце крысы, и окрашивание дифференциальных и анализа проточной цитометрии этих клеток указывает смешанной популяции Т-лимфоцитов (~ 70%), макрофаги (~ 12%) и тучных клеток с Использование этой техники. (~ 12%). 13, 14 Таким образом, методы очистки для дальнейшего разделения сердечных иммунных клеточных популяций необходимы. Изолированные клетки иммунной системы могут быть использованы для различных приложений, включая функциональные исследования, проточная цитометрия, immunofluroescence, и со-культуры экспериментов. С дальнейшей очистки и экспериментов, эти изолированные клетки обеспечивают полезный инструмент для понимания роли иммунной системы в процессе ремоделирования сердца.
Крысы были размещены в стандартных условиях окружающей среды и поддерживается на коммерческой крысы чау и водопроводной воды вволю. Все исследования соответствовали принципам Национального института здоровья Руководство по уходу и использованию лабораторных животных и были одобрены университетом Animal Care Южная Каролина Учреждения и использование комитета. Анестезия при экспериментальной точки конце повлияло кетамин / ксилазина коктейль в соотношении 2 к 1 кетамин ксилазина. Это nonsurvival процедура, которая позволяет использовать нестерильных инструментов. После выделения клеток иммунной системы и другие требуемые ткани, крысы быстро и гуманно усыпляют по данным Американской Ветеринарной Медицинской Ассоциации Руководство об эвтаназии для грызунов (например, кровотечения, рак шейки дислокации, или анестезии передозировки).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана UNCF-Мерк Высшей научно-исследовательский диссертации стипендий (JLM), Национальный институт сердца, легких и крови институт грантов RO1-HL-62228 (JSJ) и RO1-HL-073 990 (JSJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma-Aldrich | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water | |||
| Table of Specific Equipment: | |||
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 | |
References
- Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).
- Brower, G. L., Janicki, J. S. Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats. Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).
- Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).
- Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).
- Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat. Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).
- Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure. Cytokine. 34, 284-290 (2006).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis. Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).
- Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure. Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).
- Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats. Circulation. 97, 1382-1391 (1998).
- Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion. Circulation. 98, 699-710 (1998).
- Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).
- Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells. Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).
- Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart. Hypertension. 55, 270-276 (2010).
- Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. A novel technique for isolating functional mast cells from the heart. Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).
