Summary
Este método para aislar células del sistema inmune funcional del corazón es una alternativa a los métodos convencionales de digestión de colagenasa, que provoca la activación de células inmunes no deseadas, lo que resulta en una disminución de la respuesta de estas células. Nuestro método de aislamiento de los rendimientos de las células inmunes funcional cardiaca, evitando los problemas asociados con la digestión enzimática.
Abstract
Cardiaco las células inmunes están ganando interés por el papel que desempeñan en el remodelado patológico de muchas enfermedades cardíacas 1-5 Estas células inmunes, que incluyen los mastocitos, las células T y los macrófagos,. Almacenar y liberar una variedad de mediadores biológicamente activos, incluyendo citoquinas y proteasas como la triptasa. 6-8 Estos mediadores han demostrado ser jugadores clave en el metabolismo de la matriz extracelular mediante la activación de metaloproteinasas de la matriz o causar la acumulación de colágeno mediante la modulación de la función de los fibroblastos cardíacos. 9-11 Sin embargo, las técnicas disponibles para el aislamiento de las células inmunes tienen cardiaca sido problemático debido a que utilizan la colagenasa bacteriana para digerir el tejido miocárdico. Esta técnica provoca la activación de las células del sistema inmune y por lo tanto una pérdida de la función. Por ejemplo, los mastocitos se cardiaca significativamente menos sensibles a los compuestos que causan la degranulación. 12 Por tanto, hemos desarrollado una técnica que permite taislamiento de las células cardiacas funcionales inmune que daría lugar a una mejor comprensión del papel de estas células en la enfermedad cardíaca que. 13, 14
Este método requiere una familiaridad con la localización anatómica de xifoides de la rata proceso, la axila y el ligamento falciforme, y el pericardio del corazón. Estas señales son importantes para aumentar el éxito del procedimiento y para asegurar un mayor rendimiento cardíaco de células inmunes. Estas células inmunes aisladas cardíaco puede ser utilizado para la caracterización de la funcionalidad, el fenotipo, la madurez y la cultura co-experimentos con otras células cardíacas para obtener una mejor comprensión de sus interacciones.
Protocol
1. Preparación de la solución de Hanks balance de sal (HBSS)
- Autoclave un vaso de vidrio L, 1000 ml cilindro graduado, y una barra de agitación.
- Reconstituir la solución en polvo HBSS en el autoclave un vaso de vidrio L hasta la marca de 900 ml con agua destilada.
- Mezcle la solución HBSS con 3,4 g de sal de Na + Hepes y ajustar el pH a un valor entre 7.35 a 7.41 utilizando HCl concentrado o NaOH.
- Una vez que el pH deseado se ha alcanzado y se mantiene estable, añadir 5 g de albúmina de suero bovino para la solución a temperatura ambiente hasta que la albúmina se disuelva por completo.
- Añadir 10 ml de agua destilada con antibióticos, antimyotic, a la solución y hasta que doble el volumen total es de 1000 ml de la marca.
- Mezcle bien la solución.
- Filtrar la solución HBSS y separarla en 50 ml tubos Falcon para su uso posterior. Tubos adicionales se pueden congelar y usar en una fecha posterior.
2. Animal PREPARACIÓn - La inserción del tubo traqueal
- Preparar una bandeja con los instrumentos necesarios y material para la inserción de un tubo traqueal (es decir, pinzas, tijeras, tubos traqueales, 3-0 negro sutura trenzada, ventilador de pequeños animales, etc.)
- Una vez que la rata está completamente anestesiado con un cóctel de ketamina / xilazina en la proporción de 2 a 1 la ketamina xilazina, afeitarse el abdomen, el pecho y la garganta de la rata. Para asegurarse de que un profundo estado anestésico que se ha logrado, una pizca pie de la rata y la verificación de la retirada del pedal de la extremidad. Asegúrese de que la rata está profundamente anestesiado antes de hacer las incisiones.
- Lugar a la rata con la cabeza erguida sobre una tabla de cortar que se inclina en un ángulo de 30 °
- Haga una incisión en la piel de la mitad del abdomen por debajo de la mandíbula inferior. Diseccionar los músculos del triángulo anterior del cuello para exponer la tráquea.
- Coloque un 3-0 sutura trenzada negro en la tráquea.
- Hacer una incisión en la tráquea entre los anillos cartilaginosos und insertar el tubo traqueal. Ate la sutura firmemente para asegurar el tubo traqueal en la tráquea.
- Conecte el tubo traqueal a un ventilador de pequeños animales.
3. Instrumento de preparación para el aislamiento de células inmunes
- Preparar una bandeja con los instrumentos para el procedimiento de celda de aislamiento inmunológico (es decir, pinzas, tijeras, HBSS, recortado blandas teflón calibre 24 Baxter intravascular sobre la aguja rápida-cath)
- Preparar dos jeringas de 10cc, llenar una jeringa con HBSS para introducir el tampón en el saco pericárdico y reservar el otro para aspirar las células HBSS que contiene.
3.2.1. Reducir la punta de teflón del calibre 24 Baxter intravascular sobre la aguja rápido cateterismo (1,6 cm) por 1 / 2 a 3 / 4 de su longitud original para el procedimiento de aislamiento.
- Coloque todas las jeringas, tampones, y un vacío de 15 ml tubo Falcon (para mantener el líquido extraído una vez haya finalizado el procedimiento) en el hielo.
- Haga una incisión en la pared abdominal (a lo largo de la línea alba) hasta llegar a la apófisis xifoides.
- A partir ligeramente lateral a la apófisis xifoides, hacer incisiones bilaterales a través de la caja torácica continua en un ángulo hacia la axila. Tenga cuidado de no perforar los pulmones, el corazón o pericardio.
- Una vez que las incisiones a ambos lados del esternón se completa, diseccionar el diafragma de las costillas inferiores, de corte lateral a medial.
Nota: Tenga siempre consciente de que el pericardio se conecta con el esternón y el diafragma para evitar daños. Utilice el ligamento falciforme como un hito tener en cuenta que el pericardio se adjunta en el lado opuesto del diafragma. Además, si el pericardio se corta, la capacidad de aislar las células se pierde.
- Con cuidado, levante un lado de la caja torácica para exponer la cavidad torácica y el corazón (encapsuladas por el pericardio).
- Tome la jeringa llena de HBSS y encontrar un punto en el saco pericárdico aproximadamente a medio camino entre el esternón y el corazón (de preferencia más rostral del caudal) e inserte la punta de teflón de la acorta rápido cateterismo a través de las dos capas del pericardio.
- Una vez que el catéter está en su lugar, proceder con cuidado llenar el espacio pericárdico con 2 a 3 ml de solución tampón HBBS. Usted sabrá de inmediato si el catéter está bien colocado cuando se observa el espacio pericárdico en expansión. Si no es testigo de relleno, retirar y volver a colocar el quick-cath.
- Cuando el saco pericárdico se llena, tome la jeringa de 10 cc demás y coloque la punta de nuevo en el pericardio y comenzar a aspirar el buffer. El orificio de entrada puede utilizar el mismo u otro puede ser creado. Asegúrese de que la punta no se acercan demasiado a las paredes del saco pericárdico, mientras que proporciona la succión, especialmente en la parte inferior del corazón. Esto podría conducir a la perforación del saco pericárdico y la pérdida de células que contienen célulass.
- Mientras se aspira el tampón, la punta del catéter se puede mover en el interior del saco pericárdico con el fin de recoger de amortiguación tanto como sea posible.
Nota: En caso de hacerlo, un poco romper el pericardio y haga un hoyo en la parte superior del corazón más grande que el agujero original, no se preocupe. Siempre y cuando el pericardio rodea todavía lo suficiente del corazón aún puede realizar otro lavado sobre el corazón, aunque con una menor cantidad de buffer. Para la recolección de una cantidad óptima de las células, de tres a cuatro lavados se necesitan.
- Coloque el buffer se extrae en los tubos Falcon que se colocaron en hielo.
- Quitar el corazón, los pulmones y / o cualquier otro tejido, si es necesario para estudios posteriores. Después de la recolección de células del sistema inmune y otros tejidos, la rata debe ser rápido y la eutanasia humanitaria.
- Centrifugar las muestras recogidas inmune celular durante 10 minutos a 200 gramos a 4 ° C. Siempre mantener los tubos en hielocuando no esté en uso.
- Eliminar el sobrenadante y reconstituir el precipitado en 1 ml de tampón de Hyclone o HBSS.
Nota: Es importante tener en cuenta el número de células del sistema inmune obtenidas de cada corazón después del procedimiento celda de aislamiento inmunológico.
5. Los resultados representativos:
Un ejemplo de los mastocitos aislados cardíaca obtenidos con esta técnica y se tiñeron con azul de toluidina y safranina O / azul alcián se presentan en las figuras 2A y 2B, respectivamente. Como se puede observar en la Figura 3, el mástil cardiaco, mantiene su capacidad de liberación de histamina después del tratamiento con activadores conocidos como compuesto 48/80 y la sustancia P como se describe en Morgan et al. 9 diagramas de dispersión Representante de la citometría de flujo de células CD4 + y las células CD8 + se presentan en las figuras 4 y 5, respectivamente. Los linfocitos T son más identificados y fenotipo en una población de células de esta técnica.
Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento cardíaco el aislamiento de células inmunes.
. Imágenes de la figura 2 histológico representante de los mastocitos cardiaca se tiñen de la siguiente manera: (A) con azul de toluidina y (B) son safranina O / azul Alcian.
Figura 3. Estudio funcional de las células cardiacas del mástil aislado de la región epicárdica del miocardio y estimuladas con compuesto 48/80 (10μg/mL) y la sustancia P (10μM).
Figura 4. Representante de flujo de citometría de diagramas de dispersión de las células CD4 + aisladas células marcadas con la sustancia P (1:100 dilution).
Figura 5. Citometría de flujo Representante de CD8 + aisladas células marcadas con la sustancia P (dilución 1:100).
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Discussion
Este método de aislamiento de las células inmunes cardíaco permite el análisis de su función, el fenotipo, y su vencimiento sin que la activación no deseada que se produce normalmente durante la tradicional técnica enzimática aislamiento digestión. La media del número total de células que se obtienen con esta técnica es de alrededor de 400.000 por el corazón de rata, y tinción diferencial y el análisis de citometría de flujo de estas células indica población mixta de linfocitos T (~ 70%), los macrófagos (~ 12%) y las células cebadas con el uso de esta técnica. (~ 12%). 13, 14 Por lo tanto, los métodos de purificación para la posterior separación de las poblaciones de células inmunes cardiaca se necesitan. Aisladas células del sistema inmune puede ser utilizado para múltiples aplicaciones, incluyendo los estudios funcionales, citometría de flujo, immunofluroescence, y los experimentos de co-cultivo. Con purificación adicional y la experimentación, estas células aisladas proporcionan una herramienta útil para la comprensión del papel del sistema inmunológico en el proceso de remodelado cardíaco.
Las ratas fueron alojadas en condiciones estándar de medio ambiente y se mantiene en la rata comerciales chow y el agua del grifo ad libitum. Todos los estudios se ajustaba a los principios de los Institutos Nacionales de la Salud Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por la Universidad de Cuidado de Animales de Carolina del Sur de la institución y el empleo. Anestesia en el punto final experimental se vio afectada por un cóctel de ketamina / xilazina en una proporción de 2 a 1 la ketamina xilazina. Este es un procedimiento no supervivencia, lo que permite el uso de instrumentos no esterilizados. Después de que el aislamiento de las células del sistema inmune y otros tejidos deseados, la rata fue rápida y humanamente sacrificados de acuerdo con la American Veterinary Medical Association Directrices sobre la eutanasia de roedores (por ejemplo, exanguinación, dislocación cervical, o una sobredosis de anestésico).
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por un UNCF-Merck Postgrado de Investigación en Ciencias de Becas Tesis (JLM), Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de subvenciones del Instituto SR1-HL-62228 (JSJ) y RO1 HL-073.990-(JSJ).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma-Aldrich | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water | |||
| Table of Specific Equipment: | |||
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 | |
References
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