Isolering av Funktionell Cardiac immunceller

Summary

Denna metod för att isolera funktionella immunceller från hjärtat ger ett alternativ till konventionella metoder för kollagenas matsmältning, som orsakar oönskade immunceller aktiveras, vilket resulterar i en minskad lyhördhet av dessa celler. Vår metod för isolering ger funktionella hjärt immunceller genom att undvika problem i samband med enzymatisk spjälkning.

Abstract

Hjärtat immunceller vinner intresse för de roller de spelar i den patologiska remodeling i många hjärtsjukdomar ^1-5 Dessa immunceller, som omfattar mastceller, T-celler och makrofager,. Lagra och frigöra en mängd biologiskt aktiva mediatorer, inklusive cytokiner och proteaser som tryptas. ^6-8 Dessa mediatorer har visat sig vara viktiga aktörer i extracellulära matrix ämnesomsättningen genom att aktivera metalloproteinaser eller orsakar kollagen ackumulering genom att modulera hjärt fibroblaster "-funktionen. ^9-11 dock tillgängliga tekniker för att isolera hjärt immunceller har varit problematiskt eftersom de använder bakteriella kollagenas att smälta myocardial vävnad. Denna teknik medför aktivering av immunceller och därmed en förlust av funktion. Till exempel hjärt mastceller blir betydligt mindre känsliga för ämnen som orsakar degranulering. ¹² Därför har vi utvecklat en teknik som gör det möjligt för tHan isolering av funktionella hjärt immunceller som skulle leda till en bättre förståelse för vilken roll dessa celler i hjärtsjukdom. ^{13, 14}

Metoden kräver en förtrogenhet med anatomiska belägenhet råttans xiphoid process, armhålan och falciform ligament och hjärtsäcken i hjärtat. Dessa landmärken är viktigt att öka framgången för förfarandet och att säkerställa en högre avkastning på hjärt immunceller. Dessa isolerade hjärt immunceller kan sedan användas för karakterisering av funktionalitet, fenotyp, mognad, och co-kultur experiment med andra hjärt-celler för att få en bättre förståelse för deras interaktioner.

Protocol

1. Beredning av Hanks Balance Salt Solution (HBSS)

1. Autoklav 1 L glasbägare, tog examen 1000 ml cylinder och rör bar.
2. Rekonstituera HBSS pulvret lösningen i autoklaveras 1 L glasbägare på 900 ml märket med dubbeldestillerat vatten.
3. Blanda HBSS lösning med 3,4 g Hepes Na + salt och justera pH till ett värde mellan 7,35-7,41 med antingen koncentrerad HCl eller NaOH.
4. När det önskade pH-värdet har uppnåtts och förblir stabilt, tillsätt 5 g bovint serumalbumin till lösningen i rumstemperatur tills albumin är helt upplöst.
5. Tillsätt 10 ml av antibiotika, antimyotic till lösningen och dubbla destillerat vatten tills den totala volym är 1000 ml-märket.
6. Rör lösningen omsorgsfullt.
7. Filtrera HBSS lösningen och bryta ner den i 50 ml Falcon rör för senare användning. Ytterligare rören kan frysas och användas vid ett senare tillfälle.

2. Animal FÖRBEREDELn - Införande av trakealtub

1. Förbered en bricka med nödvändiga instrument och material för införandet av en trakealtub (dvs pincett, sax, trakealtub, 3-0 svart flätad sutur, litet djur fläkt, etc.).
2. När råttan är helt sövda med ketamin / xylazin cocktail i förhållandet 2 ketamin till 1 xylazin, raka buken, bröstet och halsen av råttan. För att säkerställa att en djup narkos state har uppnåtts, nyp råttans tå och kontrollera pedal tillbakadragande av lem. Se till att råttan är djupt sövd innan alla snitt.
3. Placera råttan med huvudet upp på en skärbräda som lutar i 30 graders vinkel
4. Gör en hud snitt från mitten av buken till under underkäken. Dissekera bort musklerna i främre triangeln i halsen att exponera luftstrupen.
5. Placera en 3-0 svart flätad sutur i luftstrupen.
6. Gör ett snitt i luftstrupen mellan brosk ringer ettd Sätt in trakealtub. Knyt sutur hårt för att säkra trakealtub till luftstrupen.
7. Anslut trakealtub att ett litet djur ventilator.

3. Instrument Förberedelse för immunceller Isolering

1. Förbered en bricka med instrumenten för immunceller isolering förfarande (dvs. pincett, sax, HBSS, putsats mjuk Teflon 24 gauge Baxter intravaskulär över nålen snabb-Cath)
2. Förbered två 10cc sprutor, fylla en spruta med HBSS för införandet av den bufferten in i hjärtsäcken och reservera den andra för aspirerande de HBSS innehåller celler.

   3.2.1. Minska Teflon spetsen på 24 gauge Baxter intravaskulär över nålen snabb-Cath (1,6 cm) med 1 / 2 till 3 / 4 av sin ursprungliga längd för isolering förfarande.

3. Placera alla sprutor, buffertar samt en tom 15 ml Falcon Tube (för det extraherade vätskan när proceduren är klar) på is.

<p class = "jove_title"> 4. Immunceller Isolering

1. Gör en mittlinjen snitt i bukväggen (längs linea alba) tills du når xiphoid processen.
2. Starta en aning i sidled till xiphoid processen, göra bilaterala snitt genom bröstkorgen fortsätter i en vinkel mot axill. Var noga med att inte perforera lungor, hjärta eller hjärtsäcken.
3. När snitt på båda sidor av bröstbenet är kompletta, dissekera bort membranet från de nedre revbenen, skär lateralt till medialt.

   Obs: Var alltid medveten om var hjärtsäcken ansluter till diafragman och bröstbenet för att undvika skador. Använd falciform ligament som ett landmärke att notera där hjärtsäcken sitter på motsatt sida av membranet. Dessutom, om hjärtsäcken skärs, är förmågan att isolera celler som har förlorats.

4. Lyft försiktigt upp ena sidan av bröstkorgen för att exponera brösthålan och hjärtat (fortfarande inkapslad i hjärtsäcken).
5. Ta HBSS fyllda sprutan och hitta en punkt i hjärtsäcken ungefär halvvägs mellan bröstbenet och hjärtat (helst mer rostralt än caudal) och sätt i Teflon spetsen av förkortade snabb-Cath genom båda lagren av hjärtsäck.
6. När katetern är på plats, gör försiktigt fylla perikardiell utrymmet med 2 till 3 ml HBBS buffert. Du kommer att veta omedelbart om katetern är korrekt placerad när du märker det perikardiell utrymmet expanderar. Om ingen fyllning är bevittnat, ta ut och flytta Quick-Cath.
7. När hjärtsäcken fylls, vidta de övriga 10 cc spruta och placera spetsen tillbaka i hjärtsäcken och börja aspirerande bufferten. Samma posten hål kan användas eller någon annan kan skapas. Se till att spetsen inte kommer för nära väggarna i hjärtsäcken samtidigt som det ger sug, särskilt på undersidan av hjärtat. Detta kan leda till punktering hjärtsäcken och förlust av celler som innehåller cellerS.
8. Medan aspirerande bufferten, kan kateterspetsen flyttas runt i hjärtsäcken för att samla in så mycket buffert som möjligt.

Observera: Om att göra så att du lätt riva hjärtsäck och gör hålet i toppen av hjärtat större än den ursprungliga hålet, inte panik. Så länge hjärtsäck omger fortfarande tillräckligt i hjärtat du kan fortfarande göra en annan tvätta över hjärtat än med en mindre mängd buffert. För insamling av en optimal mängd celler, är tre till fyra ytterligare tvättar behövs.

9. De extraherade bufferten i Falcon rör som placerades på is.
10. Ta hjärta, lungor och / eller annan vävnad om det behövs för vidare studier. Efter insamling av immunceller och andra vävnader, måste råttan vara snabbt och humant avlivas.
11. Centrifugera insamlade immunceller prover i 10 min på 200g vid 4 ° C. Håll alltid rören på isnär den inte används.
12. Avlägsna supernatanten och rekonstituera pelleten i 1 ml Hyclone buffert eller HBSS.

OBS: Det är viktigt att räkna antalet immunceller från varje hjärta efter immunceller isolering förfarande.

5. Representativa resultat:

Ett exempel på isolerade hjärt mastceller som erhålls med denna teknik och färgas med toluidinblått och safranin O / alcian blå presenteras i siffror 2A och 2B, respektive. Som framgår av Figur 3, Den kardiella masten, bibehållit sin förmåga att frigöra histamin efter behandling med kända aktivatorer som förening 48/80 och substans P som beskrivs i Morgan et al. ⁹ representant scatter tomter från flödescytometri av CD4 + celler och CD8 + celler presenteras i siffror 4 och 5, respektive. T-lymfocyter är ytterligare identifieras och phenotyped som en cell befolkningen från denna teknik.

Figur 1. Flödesschema för hjärt immunceller isolering förfarande.

. Figur 2 Histologisk representativa bilder av hjärt mastceller färgas enligt följande: (A) med toluidinblått och (B) är safranin O / alcian blå.

Figur 3. Funktionella studier av hjärt mastceller isolerad från epicardial hjärtinfarkt regionen och stimuleras med sammansatta 48/80 (10μg/mL) och substans P (10μM).

Figur 4. Representant flödescytometri skingra tomter av isolerade CD4 + celler märkta med substans P (1:100 dilution).

Figur 5. Representant flödescytometri av isolerade CD8 + celler märkta med substans P (1:100 utspädning).

Discussion

Denna metod för att isolera hjärt immunceller möjliggör analys av deras funktion, fenotyp, och mognad utan oönskade aktivering som normalt sker under en traditionell enzymatisk spjälkning isolering teknik. Det genomsnittliga totala antalet celler erhålls med denna teknik är ca 400 tusen per råtta hjärta och differentierad färgning och flödescytometri analys av dessa celler visar blandad population av T-lymfocyter (~ 70%), makrofager (~ 12%) och mastceller med användningen av denna teknik. (~ 12%). ^{13, 14} Därför reningsmetoder för ytterligare separering av hjärt immunceller populationer behövs. Isolerade immunceller kan användas för flera tillämpningar, inklusive funktionella studier, flödescytometri, immunofluroescence, och co-kultur experiment. Med ytterligare rening och experiment, dessa isolerade celler ger ett användbart verktyg för att förstå den roll som immunsystemet i processen för hjärt ombyggnad.

Råttor inrymt under normala miljöförhållanden och upprätthålls på kommersiell råtta chow och kranvatten ad lib. Alla studier överensstämde med principerna i National Institutes of Health Guide för vård och användning av försöksdjur och godkändes av University of South Carolina institutionens Djurvård och användning kommittén. Anestesi vid experimentella slutpunkt påverkas av ketamin / xylazin cocktail i förhållandet 2 ketamin till 1 xylazin. Detta är en nonsurvival förfarande, som tillåter användning av osteriliserade instrument. Efter isolering av immunceller och andra önskade vävnad var råttan snabbt och humant avlivas enligt American Veterinary Medical Association riktlinje om dödshjälp för gnagare (t.ex. exsanguination, halsdislokation eller bedövningsmedel överdos).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ Balanced Salt	Sigma-Aldrich	H4891	One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure.
Antibiotic- Antimyotic	GIBCO, by Life Technologies	15240-062
HEPES	Sigma-Aldrich	H3784
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A3912
250 mL Nalogene Filter Bottle	Thermo Fisher Scientific, Inc.	157-0020
12 N HCL	Fisher Scientific	CAS 7647-01-0	For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water.
10 N NaOH	Fisher Scientific	SC267	For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water.
Double Distilled Water
Table of Specific Equipment:
3-O Suture Silk Braided	Ethicon Inc.	SA64H
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	SAR-830	Set breathing rate to 40.5 breaths per min.
Bevel 18 gauge needle	BD Biosciences	305199	Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube.
Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter	Baxter Internationl Inc.	2N111	Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4.
10 cc syringe	Fisher Scientific	14-823-16B
15 mL Falcon Tubes	BD Biosciences	352097
Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge	Fisher Scientific	75-004-377	Remember to pre-cool and keep at 4°C.
Hyclone	Thermo Fisher Scientific, Inc.	S300030.02
Hemocytometer	Hausser Scientific	HS-LB-1483