Summary
Bu yöntem kalp fonksiyonel bağışıklık hücrelerini izole etmek için, bu hücrelerin azalmış yanıt ile sonuçlanan istenmeyen bağışıklık hücre aktivasyonuna neden olur kollajenaz sindirim, geleneksel yöntemlere alternatif sunuyor. Izolasyon yöntemi, enzimatik sindirim ile ilgili sorunlar kaçınarak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücreleri elde edilir.
Abstract
Kardiyak bağışıklık hücreleri, birçok kalp hastalıkları patolojik remodeling oynadıkları roller için faiz kazanıyor mast hücreleri, T hücreleri ve makrofajlar 1-5 Bu bağışıklık hücreleri, depo ve sitokinler ve dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak aktif mediatörlerin serbest triptaz olarak proteazlar 6-8 Bu aracılar, ekstraselüler matriks metabolizmasında anahtar oyuncular matriks metalloproteinazların aktive veya modüle kardiyak fibroblastlar 'fonksiyonu kollajen birikimi neden olduğu gösterilmiştir. 9-11 Bununla birlikte, kardiyak bağışıklık hücrelerini izole etmek için uygun teknikler var miyokard doku sindirimi bakteriyel kollajenaz kullanımı nedeniyle sorunlu olmuştur. Bu teknik, bağışıklık hücrelerinin aktivasyonu ve böylece fonksiyon kaybına neden olur. Örneğin, kalp mast hücrelerinin degranülasyonu neden olan bileşiklerin önemli ölçüde daha az duyarlı hale gelir. 12 Bu nedenle, biz t sağlayan bir teknik geliştirdikalp hastalığı bu hücrelerin rolü daha iyi anlaşılmasına yol açacak fonksiyonel kardiyak bağışıklık hücrelerinin izolasyonu 13, 14
Bu yöntem, kalbin anatomik sıçan kılıç şeklinde süreci, koltuk altı ve orak şeklinde ligaman konumu ve perikard ile bir aşinalık gerektirir. Bu simge prosedürün başarısını artırmak ve kalp bağışıklık hücrelerini daha yüksek bir verim sağlamak için önemlidir. Bu izole kardiyak bağışıklık hücrelerini sonra, fenotip, olgunluk, ve diğer kalp hücreleri ile ko-kültür deneyler, bunların karşılıklı etkileşimi daha iyi bir anlayış kazanmak için karakterizasyonu için kullanılabilir.
Protocol
1. Hanks 'Balance Tuz Çözeltisi Hazırlama (HBSS)
- Otoklav 1 L cam beher, 1000 mL dereceli silindir, ve bar karıştırın.
- Çift distile su ile 900 mL işaretine otoklavlanmış 1 L cam beher HBSS toz çözüm sulandırın.
- HBSS çözüm 3.4 g HEPES Na + tuz ile karıştırın ve 7,35-7,41 arasında bir değer ya da konsantre HCL veya NaOH kullanılarak pH ayarlamak.
- Istenilen pH elde ve sabit kalır sonra 5 g, albümin, tamamen eriyene kadar oda sıcaklığında çözüm sığır albümin serum ekleyin.
- Toplam hacmi 1000 ml işaretine kadar çözüm antimyotic, antibiyotik ve çift distile su 10 ml ekleyin.
- Çözümü iyice karıştırın.
- HBSS çözüm Filtre ve daha sonra kullanmak için 50 ml Falcon tüp içine ayrı. Ek tüpler dondurulmuş ve sonraki bir tarihte kullanılabilir.
2. Hayvan preparatlarn - Trakeal Tüp yerleştirilmesi
- (Yani forseps, makas, trakeal tüp, 3-0 siyah örgülü sütür, küçük hayvan vantilatör vb) bir trakeal tüp yerleştirilmesi için gerekli aletler ve malzeme ile bir tepsi hazırlayın.
- Sıçan oranı 1 ksilizin 2 ketamin ketamin / xylazine bir kokteyl ile tamamen uyuşturulduktan sonra, sıçan, karın, göğüs ve boğaz tıraş. Derin bir anestezi devleti elde edildiğine emin olmak için, farenin ayak tutam ve ekstremitenin pedal çekilmesi için kontrol edin. Sıçan bütün kesiler yapmadan önce derin anestezi olduğundan emin olun.
- 30 ° açıyla eğimli bir kesme tahtası üzerinde kaldırdı başını sıçan yerleştirin
- Orta-karın alt çene altına bir cilt insizyonu olun. Trakea ortaya çıkarmak için boynun ön üçgen kasları parçalara ayır.
- Trakea altında 3-0 siyah örgülü sütür yerleştirin.
- Trakea kıkırdak halkaları arasında bir kesi olun.d trakeal tüp yerleştirin. Trakeal tüp trakea güvenli dikiş sıkıca bağlayın.
- Küçük bir hayvan ventilatöre trakeal tüp bağlayın.
3. Bağışıklık Hücre İzolasyon Aracı Hazırlama
- Bağışıklık hücre izolasyon işlemi için araçların (forseps, makas, HBSS, iğne hızlı cath üzerinde yumuşak teflon 24 gauge Baxter intravasküler kesilmiş) ile bir tepsi hazırlayın
- İki 10cc şırınga hazırlayın, HBSS içeren hücreleri aspire perikardiyal kese ve yedek diğeri içine tampon tanıtmak için bir şırınga HBSS doldurun.
3.2.1. Izolasyon prosedürü için orijinal uzunluğunun 1 / 2 3 / 4 iğne hızlı cath (1.6 cm) üzerinden 24 gauge Baxter intravasküler teflon ucu azaltın.
- Tüm şırıngalar, tamponlar ve boş bir 15 ml Falcon Tüp (prosedür tamamlandıktan sonra çıkarılan sıvı tutmak için) buz üzerinde yerleştirin.
- Kılıç şeklinde bir süreç ulaşana kadar orta hat karın duvarı linea alba boyunca bir kesi yapmak.
- Biraz yanal kılıç şeklinde bir süreç başlayarak, aksilla doğru bir açıyla devam eden göğüs kafesi ile ikili kesiler yapmak. Akciğerler, kalp, perikard ya da perfore için dikkatli olun.
- Sternumun her iki tarafta insizyon tamamlandıktan sonra, mediale yanal kesme, alt kaburga diyafram uzak teşrih.
Not: perikard diyafram ve zarar görmemesi için sternum bağlanır hiç farkında olun. Orak şeklinde ligaman perikard karşı tarafında diyaframın bağlı olduğu notu için bir dönüm noktası olarak kullanın. Ayrıca, perikard kesilir, hücreleri izole etme yeteneğini kaybetti.
- , Göğüs boşluğu ve kalp (hala perikard kapsüllenir) maruz göğüs kafesi bir tarafı hafifçe kaldırın.
- HBSS şırınga alın ve sternum ve kalp (tercihen daha fazla rostral kaudal daha) arasında yaklaşık yarım perikard kesesi içinde bir nokta bulmak ve teflon ucu takın perikard her iki katmanları ile hızlı cath kısaltılabilir.
- Kateter yerleştirildikten sonra, 2 ila 3 ml HBBS tampon ile perikard boşluğu doldurmak hafifçe geçin. Perikardiyal alanı genişleyen gördüğünüzde kateter yerleştirilir hemen bilecektir. Dolum tanık ise, çekilme ve hızlı cath yeniden konumlandırmak.
- Perikard kesesi dolu olduğunda, diğer 10 cc şırınga ve perikard ucu yerleştirin ve tampon aspire başlar. Aynı giriş deliği kullanılabilir ya da başka bir oluşturulabilir. Özellikle kalbin alt sağlarken, emme ucu perikardiyal kese duvarları çok yakın gelmiyor emin olun. Bu perikardiyal kese ve hücre içeren hücre kaybı delinmesiyle yol açabilirs
- Tampon aspire ederken, kateter ucu mümkün olduğunca tampon toplamak için perikardiyal kese içinde dolaştı olabilir.
Not: Bunu yaparken biraz perikard yırtılma ve orijinal bir delik daha büyük kalp üstündeki delik, panik yapmayın . Perikard sürece hala yeterince kalp çevreleyen tampon daha az miktarda da olsa kalp üzerinde hala başka bir yıkama gerçekleştirebilirsiniz. Optimal miktarda hücre toplama, 03:57 ek yıkar ihtiyaç vardır.
- Ayıklanan tampon buz üzerine yerleştirildi Falcon tüpler içine yerleştirin.
- Kalp, akciğerler ve / veya daha ileri çalışmalar için gerekli olan diğer doku varsa çıkarın. Bağışıklık hücreleri ve diğer dokulara toplandıktan sonra, sıçan, hızlı ve insanca ötenazi olmalıdır.
- 4 200g az 10 dakika ° C için toplanan bağışıklık hücre örnekleri Santrifüj Tüpler her zaman buz üzerinde tutmakKullanılmadığı zaman.
- Hyclone Tampon veya HBSS 1 mL supernatant ve sulandırmak pelet çıkarın.
Not: bağışıklık hücre izolasyon prosedürü sonra her kalp elde edilen bağışıklık hücrelerinin sayısını çok önemlidir.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Bu toluidin mavi ve safranin O / alcian mavi ve vitray tekniği ile elde edilen izole kardiyak mast hücreleri bir örnek, 2A ve 2B rakamlar sırasıyla sunulmuştur. Şekil 3, kalp direk görülebileceği gibi, Morgan ve ark açıklandığı gibi bileşik 48/80 ve P maddesi olarak bilinen aktivatörleri ile tedaviden sonra histamin salınımı yeteneğini sürdürdü. CD4 flow sitometri 9 Temsilcisi dağılım araziler + hücreleri ve sırasıyla Şekil 4 ve 5, CD8 + hücreleri sunulmaktadır. T-lenfositler daha da tanımlanır ve bu tekniğin bir hücre popülasyonu olarak phenotyped.
Kalp bağışıklık hücre izolasyon prosedürü Şekil 1. Akış şeması.
Şekil 2 kalp mast hücrelerinin histolojik temsilcisi görüntüleri aşağıdaki gibi lekeli: (A) (B) toluidin mavi ve safranin O / alcian mavi.
Şekil 3 epikardiyal miyokard bölgeden izole edilmiş ve bileşik 48/80 (10μg/mL) ve P maddesi (10μM) ile uyarılan kalp mast hücreleri fonksiyonel çalışma.
Şekil 4 izole CD4 + hücreler, P maddesi (1:100 dilut ile etiketlenen Temsilcisi flow sitometri dağılım arazileriyon).
Şekil 5, P maddesi (1:100 dilüsyon) ile etiketlenmiş izole CD8 + hücreleri Temsilcisi flow sitometri .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kardiyak bağışıklık hücrelerini izole Bu yöntem genellikle enzimatik sindirimi geleneksel bir izolasyon tekniği sırasında ortaya çıkan istenmeyen aktivasyon olmadan bunların fonksiyonları, fenotip ve olgunluk analizi sağlar. Bu tekniği ile elde edilen hücrelerin ortalama toplam sayısı sıçan kalbinde başına 400.000 civarındadır ve bu hücrelerin diferansiyel boyama ve flow sitometri analizi, T-lenfositler (~% 70), makrofajlar (~% 12) ve mast hücreleri ile karışık bir nüfus olduğunu gösterir Bu tekniğin kullanılması (~% 12) 13, 14 Bu nedenle, kalp bağışıklık hücre popülasyonlarının daha fazla ayırma saflaştırma yöntemleri ihtiyaç vardır . İzole bağışıklık hücrelerini, fonksiyonel çalışmalar, akış sitometri, immunofluroescence, ve ko-kültür deneyler de dahil olmak üzere birden fazla uygulama için kullanılabilir. Ileri arıtma ve deney ile, bu izole hücreler kardiyak remodeling sürecinde bağışıklık sisteminin rolünü anlamak için yararlı bir araç sağlar.
Sıçanlar standart çevre şartlarında muhafaza ve ticari yem ve musluk suyu ad libitum muhafaza edildi. Tüm çalışmalar, Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım için, Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri ilkelerine conformed ve Güney Carolina Kurum Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından kabul edildi. Anestezi, deneysel uç noktasında 2 ketamin 1 ksilizin oranında ketamin / xylazine kokteyl etkilendi. Bu unsterilized araçların kullanımına izin veren nonsurvival bir işlemdir. Bağışıklık hücreleri ve diğer istenen dokuya izolasyonu sonra, sıçan hızla ve insanca kemirgenler için Ötenazi (örneğin exsanguination, servikal dislokasyon, ya da anestezik doz aşımı) Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği Yönerge göre ötenazi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa etmek başka bir şey var.
Acknowledgments
Bu çalışma bir UNCF-Merck Lisansüstü Bilim Araştırma Tezi Bursu (JLM), Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü hibe RO1-HL-62.228 (JSJ) ve RO1-HL-073.990 (JSJ) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ Balanced Salt | Sigma-Aldrich | H4891 | One bottle makes 1 L of Hanks’ Balance Salt Solution. Reconstitute Hanks’ Balance Salt Solution as a part of the procedure. |
| Antibiotic- Antimyotic | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3784 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| 250 mL Nalogene Filter Bottle | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 157-0020 | |
| 12 N HCL | Fisher Scientific | CAS 7647-01-0 | For 6 N, add equal volumes of HCL to deionized water. |
| 10 N NaOH | Fisher Scientific | SC267 | For 5 N, add equal volumes of NaOH to deionized water. |
| Double Distilled Water | |||
| Table of Specific Equipment: | |||
| 3-O Suture Silk Braided | Ethicon Inc. | SA64H | |
| Small Animal Ventilator | CWE, Inc. | SAR-830 | Set breathing rate to 40.5 breaths per min. |
| Bevel 18 gauge needle | BD Biosciences | 305199 | Trim needle by 1/2 to 3/4 of its original length for use as a tracheal tube. |
| Teflon Tip (with needle removed) of 24-gauge Baxter quick-cath catheter | Baxter Internationl Inc. | 2N111 | Reduce the Teflon Tip length by 1/2 to 3/4. |
| 10 cc syringe | Fisher Scientific | 14-823-16B | |
| 15 mL Falcon Tubes | BD Biosciences | 352097 | |
| Sorvall RT6000B Refrigerated Centrifuge | Fisher Scientific | 75-004-377 | Remember to pre-cool and keep at 4°C. |
| Hyclone | Thermo Fisher Scientific, Inc. | S300030.02 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | HS-LB-1483 | |
References
- Brower, G. L., Chancey, A. L., Thanigaraj, S., Matsubara, B. B., Janicki, J. S. Cause and effect relationship between myocardial mast cell number and matrix metalloproteinase activity. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 283, H518-H525 (2002).
- Brower, G. L., Janicki, J. S. Pharmacologic inhibition of mast cell degranulation prevents left ventricular remodeling induced by chronic volume overload in rats. Journal of Cardiac Failure. 11, 548-556 (2005).
- Chancey, A. L., Brower, G. L., Janicki, J. S. Cardiac mast cell-mediated activation of gelatinase and alteration of ventricular diastolic function. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 282, H2152-H2158 (2002).
- Levick, S. P., Gardner, J. D., Holland, M., Hauer-Jensen, M., Janicki, J. S., Brower, G. L. Protection from adverse myocardial remodeling secondary to chronic volume overload in mast cell deficient rats. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 43, 56-61 (2008).
- Levick, S. P., McLarty, J. L., Murray, D. B., Freeman, R. M., Carver, W. E., Brower, G. L. Cardiac Mast Cells Mediate Left Ventricular Fibrosis in the Hypertensive Rat. Hypertension. 53, 1041-1047 (2009).
- Batista, M. L., Santos, R. V., Cunha, L. M., Mattos, K., Oliveira, E. M., Seelander, M. C. Changes in the pro-inflammatory cytokine production and peritoneal macrophage function in rats with chronic heart failure. Cytokine. 34, 284-290 (2006).
- Galli, S. J., Tsai, M. Mast Cells: Versatile regulator of inflammation, tissue remodeling, host defense and homeostasis. Journal of Dermatological Science. 49, 7-19 (2008).
- Yndestad, A., Holm, A. M., Muller, F., Simonsen, S., Froland, S. S., Gullested, L. Enhanced expression of inflammatory cytokines and activation markers in T-cells from patients with chronic heart failure. Cardiovasc. Res. 60, 141-146 (2003).
- Bozkurt, B., Kribbs, S. B., Clubb, F. J., Michael, L. H., Didenko, V. V., Hornsby, P. J. Pathophysiologically Relevant Concentrations of Tumor Necrosis Factor-ɑ Promote Progressive Left Ventricular Dysfunction and Remodeling in Rats. Circulation. 97, 1382-1391 (1998).
- Frangogiannis, N. G., Lindsey, M. L., Michael, L. H., Youker, K. A., Bressler, R. B., Mendoza, L. H. Resident Cardiac Mast Cells Degranulate and Release Preformed TNF-ɑ, Initiating the Cytokine Cascade in Experimental Canine Myocardial Ischemia/Reperfusion. Circulation. 98, 699-710 (1998).
- Jobe, L. J., Melendez, G. C., Levick, S. P., Du, Y., Brower, G. L., Janicki, J. S. TNF-α inhibition attenuates adverse myocardial remodeling in a rat model of volume overload. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 297, H1462-H1468 (2009).
- Forman, M. F., Brower, G. L., Janicki, J. S. Spontaneous histamine secretion during isolation of rat cardiac mast cells. Inflammation Research. 53, 453-457 (2004).
- Levick, S. P., Murray, D. B., Janicki, J. S., Brower, G. L. Sympathetic nervous system modulation of inflammation and remodeling in the hypertensive heart. Hypertension. 55, 270-276 (2010).
- Morgan, L., Levick, S., Voloshenyuk, T., Murray, D., Forman, M., Brower, G. A novel technique for isolating functional mast cells from the heart. Inflammation Research. 57, 241-246 (2008).
