Summary
هذه الورقة يوضح طرق لتنقية والعزلة وكشف exosomes ، فضلا عن تقنيات لتحليل محتواها الجزيئية. هذه الأساليب قابلة للتكيف لعزل exosome من كل وسائل الإعلام والثقافة الخلية السوائل البيولوجية ، ويمكن أن يتجاوز تحليل المحتوى الجزيئية يكون من المفيد أيضا في الدراسات الفنية.
Abstract
ميدان البحوث exosome تتوسع بسرعة ، مع زيادة كبيرة في منشورات في السنوات الأخيرة. وكانت أول من اقترح هذه الحويصلات الصغيرة (3-10 نانومتر) من أصل التقامي لتعمل كوسيلة لالشبكيات للقضاء على مستقبلات ترانسفيرين حين نضج الكريات الحمراء في 1 ، وكان اسمه في وقت لاحق exosomes. تتشكل Exosomes بواسطة الناشئين في وقت متأخر من الداخل الإندوسومات وانتاج الهيئات عديد الحويصلات (MVBs) ، ويتم إطلاقها في البيئة من خلال الاندماج في MVBs مع غشاء البلازما 2. منذ اكتشاف أول exosomes ، وقد تبين أن مجموعة واسعة من الخلايا لإطلاق هذه الحويصلات. كما تم الكشف عن Exosomes في السوائل البيولوجية عدة ، بما في ذلك ، والبلازما اللعاب ، السائل غسل الأنف وحليب الثدي 3-6. وعلاوة على ذلك ، فقد ثبت أنه مضمون وظيفة exosomes يعتمد على خلية المنشأ والشروط التي يتم إنتاجها. كما تم تطبيق مجموعة من الوظائف الشياطينtrated لexosomes ، مثل تحريض ضد الحساسية 7،8 التسامح ، والقضاء على الأورام التي أنشئت في الفئران 9 ، وتثبيط وتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية 10-12 ، وتعزيز التمايز في الخلايا التنظيمية تي 13 ، وتحفيز تكاثر الخلايا T 14 و استحثاث موت الخلايا المبرمج خلية T 15. عام 2007 أثبتنا أن exosomes سراحهم من الخلايا البدينة تحتوي على الحمض النووي الريبي رسول (مرنا) وmicroRNA (ميرنا) ، والتي يمكن أن تنقل من الحمض النووي الريبي من خلية واحدة إلى أخرى عبر exosomes. في الخلايا المتلقية ، وكان يظهر من خلال زيارات مكوكية مرنا exosomes إلى أن تترجم إلى بروتين ، مما يشير إلى وظيفة تنظيمية لنقل الحمض النووي الريبي 16. علاوة على ذلك ، لقد أظهرنا أيضا أن exosomes المستمدة من الخلايا التي تزرع تحت الاكسدة يمكن أن تحدث المزيد من الضغوط ضد التسامح في الخلايا المتلقية ، وبالتالي تشير إلى الوظيفة البيولوجية للمكوك exosomal RNA 17. وسائل الإعلام والثقافة الخلية البيولوجية المشترك السوائلntain خليط من الحويصلات ويسفك شظايا. عزلة ذات جودة عالية طريقة لexosomes ، تليها توصيف وتحديد exosomes ومحتواها ، وبالتالي حاسما للتمييز exosomes من الحويصلات الأخرى ، والجسيمات. هنا ، نقدم طريقة لعزل الخلايا من كلا exosomes المتوسطة الثقافة وسوائل الجسم. ويستند هذا الأسلوب عزلة على الطرد المركزي وكرر خطوات الترشيح ، وتليها خطوة تنبيذ فائق النهائي الذي exosomes هي مكعبات. وأبرزت وسائل مهمة لتحديد وتوصيف exosomes مورفولوجية exosomal ومحتوى البروتين ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني ، والتدفق الخلوي لطخة غربية. وتستند عملية تنقية من الحمض النووي الريبي لexosomal اللوني الكامل على عمود الدوران ويتم تحليل الحمض النووي الريبي exosomal العائد وحجم التوزيع باستخدام Bioanalyzer.
Protocol
1. Exosome العزلة
- زراعة خلايا في المتوسط مع exosome خالية من المصل. وينبغي بالتالي المنضب ، أي مصل إضافة إلى الخلية المتوسطة ثقافة exosomes بواسطة تنبيذ فائق XG 000 في أكثر من 120 ليلة في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام.
- نقل تعليق الخلية لأنابيب مخروطية.
- الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية لخلايا بيليه.
- طاف لنقل أنابيب نابذة فائقة السرعة وإذا لم يكن كاملا تماما PBS الإضافة.
- الطرد المركزي في العينة XG 500 16 لمدة 20 دقيقة عند 4 درجة مئوية لإزالة المزيد من الخلايا وبقايا الخلايا.
- تصفية طاف خلال 0.2 ميكرون فلتر لإزالة الجسيمات أكبر من 200 نانومتر.
- نقل طاف تصفيتها نابذة فائقة السرعة لأنابيب جديدة وختم الأنابيب قبل نابذة فائقة السرعة في XG 000 120 لمدة 70 دقيقة في 4 إلى exosomes الكرية درجة مئوية.
- تجاهل طاف.
- لاسترجاع exosome القصوى ، resuspend في إثراء exosomeإد بيليه مرارا وتكرارا في حجم صغير (~ 3 × 50 ميكرولتر) من وجود مخزن المناسبة. هذا المخزن المؤقت يعتمد على التجارب النهائية المقررة بعد العزلة exosome. على سبيل المثال ، يتم استخدام الفاصلة لتحلل البروتين والحمض النووي الريبي عزلة ، يتم استخدام برنامج تلفزيوني عن المجهر الإلكتروني والتدفق الخلوي وظيفية قد يكون من المفضل الدراسات المتوسطة.
علما ، ويمكن أيضا أن تكون معزولة exosomes من سوائل الجسم المختلفة ، مثل البلازما ، وذلك باستخدام نفس الإجراء لوسائل الإعلام ثقافة الخلية. لسوائل لزجة قد يكون من الضروري لتخفيف العينة مع برنامج تلفزيوني قبل الطرد المركزي وخطوة الترشيح. بالنسبة لسرعة الطرد المركزي لنقطة 5 أعلاه ، يمكن زيادتها إلى 500 29 XG ، ويمكن تمديد تنبيذ فائق في النقطة 7 إلى 90 دقيقة 18.
يمكن إذا كان نموذج يحتاج إلى مزيد من تنقية بضرورة تعويم بيليه exosome على السكروز ، وسوف تدرج في المقام الأول على exosomes يمكن العثور عليها في جزء representing كثافة 1،13-1،19 ز / 2 مل.
2. Exosome تحديد بواسطة المجهر الإلكتروني
- لمزيد من تلويث القضاء على البروتينات ، وresuspend exosome المخصب بيليه في برنامج تلفزيوني ونابذة فائقة السرعة في XG 000 120 لمدة 70 دقيقة في 4 درجات مئوية لإعادة بيليه في exosomes.
- اتخاذ قسامة صغيرة من العينة لعزل بروتين ومجموع قياس البروتين. تأكد من أن lysed جزءا صغيرا فقط من العينة ويستخدم لقياس البروتين والحفاظ على exosomes سليمة ، وحلها في برنامج تلفزيوني ، منفصلة على الجليد أو على -80 درجة مئوية لمزيد من التجارب.
- مكان هبوط ، ما يقرب من 10 ميكروغرام من البروتين exosomal من exosomes سليمة معلق في برنامج تلفزيوني ، على Parafilm. ثم ، مع ملقط ، والموقف بلطف الكربون formvar شبكة النيكل مغلفة على رأس كل قطرة ل30-60 دقيقة. أؤكد أن يتم وضع الشبكة مع الجانب طلاء تواجه انخفاض تحتوي exosomes.
- ثلاث قطرات مكان ، ولكل ميكرولتر 30 ، من برنامج تلفزيوني على رانه Parafilm وغسل الشبكة عن طريق وضع بالتسلسل الشبكة على أعلى قطرات من برنامج تلفزيوني ، واستخدام ورقة امتصاص بينهما. استخدام ورقة امتصاص فقط بلطف عن طريق إمساكه عن كثب إلى جانب الشبكة ، من دون اتصال مع منطقة المغلفة.
- الإصلاح العينة عن طريق ايداع قطرة من بارافورمالدهيد 2 ٪ على Parafilm ووضع الشبكة على أعلى من الانخفاض لمدة 10 دقيقة.
- كرر الخطوة الغسيل في النقطة 4 ، قبل immunostaining مع الأجسام المضادة المناسبة. الأجسام المضادة المستخدمة عادة لمكافحة CD63 ومكافحة MHC الدرجة الثانية. ويمكن أيضا أن يؤديها الإلكترون المجهري دون immunostaining كما يمكن التعرف على exosomes تستند فقط على حجم والتشكل. ومع ذلك ، فإننا نوصي لتقييم حجم والمورفولوجيا وجود بروتين الغشاء عن التحقق من صحة أكثر حسما.
- نقل الشبكة لإسقاط ميكرولتر 30 من الضد الرئيسي لاختيار واحتضان لمدة 40 دقيقة. يغسل بتكرار النقطة 4 ، ولكن استخدام المصل البقري بنسبة 0.1 ٪ في ألبومين PBS وحده بدلا من برنامج تلفزيوني.
- أكرر النقطة 7 ، ولكن مع الضد 10 نانومتر الذهب الثانوية وصفت وحدها تغسل مع برنامج تلفزيوني
- بعد إصلاح العينة بإضافة قطرة من غلوتارالدهيد 2.5 ٪ إلى Parafilm واحتضان الشبكة على أعلى من الانخفاض لمدة 10 دقيقة. تكرار الغسيل في النقطة 4 ، ولكن استخدام خمسة قطرات من الماء منزوع الأيونات بدلا من ثلاث قطرات من برنامج تلفزيوني.
- على النقيض من العينة عن طريق إضافة قطرة من خلات اليورانيل 2 ٪ إلى Parafilm واحتضان الشبكة على أعلى من الانخفاض لمدة 15 دقيقة.
- تضمين عينة عن طريق إضافة قطرة من السليلوز الميثيل 0.13 ٪ و 0.4 ٪ خلات اليورانيل إلى Parafilm واحتضان الشبكة على أعلى من الانخفاض لمدة 10 دقيقة.
- إزالة السائل الزائد باستخدام بلطف ورقة امتصاص قبل وضع الشبكة على ورقة مع الجانب المغلفة حتى والسماح لها الهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
- بحث التحضيرات مع مجهر الكتروني أو تخزين الشبكات في مربع الشبكة للعمل في المستقبل.
3.Exosome توصيف بواسطة التدفق الخلوي
كما exosomes صغيرة جدا بحيث لا يمكن الكشف عنها بواسطة أجهزة الخلوي تدفق الحالية ، فمن الضروري أولا لربط exosomes إلى الضد حبات مغلفة (الشكل 1). إما أن هذه الخرزات يمكن شراؤها كمنتج الجاهزة أو مصنوعة في المختبر مع الأجسام المضادة في الاختيار. اعتمادا على الأصل exosomal الخلوية ، يمكن أن يقترن أضداد مختلفة لالخرز التي يمكن أن تكون إما ذات طابع المغناطيسي أو اللاتكس. نستخدم حاليا لمكافحة MHC من الدرجة الثانية أو المضادة للCD63 حبات مغلفة لهذا التحليل.
- لاستخدام "محلية الصنع" حبات مغلفة الأضداد ، ونحن نستخدم 4 حبات اللاتكس ميكرومتر المغلفة مع الأجسام المضادة لمكافحة CD63. يغسل 25 ميكرولتر اللاتكس ميكرون 4 حبات (30 × 10 6 حبات) مرتين في 100 العازلة MES ميكروليتر (3) ، 000 x ج لمدة 15-20 دقيقة وredissolve لبيليه في 100 العازلة MES ميكرولتر. تحضير مزيج الأجسام المضادة التي تحتوي على كمية متساوية من الأضداد 12.5 ميكروغرام مع نفس الحجم من المخزن زارة التربية والعلم. إضافةالخرز إلى خليط الأضداد واحتضان تحت هياج طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. تغسل حبات مغلفة الضد ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني (000 3 x ج لمدة 20 دقيقة) وحل بيليه في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت التخزين (مع تركيز النهائي من الخرز 300 000 / ميكروليتر).
- لكل عينة (كل الضد) ، تواصل مع حجم يساوي ما لا يقل عن 30 ميكروغرام من البروتين exosomal (من exosomes سليمة حلها في برنامج تلفزيوني) في الضد ~ حبات 100 000 المغلفة.
- احتضان exosomes والخرز ، في الحجم الإجمالي من 300 برنامج تلفزيوني ميكرولتر ، أكثر من ليلة عند 4 درجة مئوية تحت الحركة لطيف.
- كتلة بإضافة 300 ميكروليتر من جليكاين 200 ملم واحتضان لمدة 30 دقيقة.
- غسل المجمعات exosome - حبة مرتين في غسل العازلة (1-3 ٪ في المصل PBS) ، 600 x ج لمدة 10 دقائق.
- احتضان المجمعات exosome - 50 حبة مع الأجسام المضادة مفتش ميكرولتر في 4 درجات مئوية. غسل المجمعات exosome - حبة مرتين في غسل العازلة كما هو موضح في الخطوة 5.
- إضافة 90 ميكرولتر العازلة يغسل وميكرولتر 10أجسام مضادة لاختيار (مثالي لمكافحة CD9 ، ومكافحة CD63 CD81 أو المضادة) للمجمعات exosome - حبة واحتضان لمدة 40 دقيقة تحت الحركة لطيف. غسل المجمعات exosome - حبة مرتين في غسل العازلة كما هو موضح في الخطوة 5.
- إضافة 300 العازلة غسل ميكرولتر والحصول على البيانات باستخدام التدفق الخلوي.
يمكن استخدامها على نحو ما نوقش أعلاه ، الخرز مختلفة ، مثل الخرز المطاط كما هو موضح في بروتوكول أو حبات مغناطيسية. إذا تم استخدام الخرز المغناطيسي بدلا من ذلك ، يرجى ملاحظة أن البروتوكول هو مختلف قليلا. غير مطلوب خطوة حجب (النقطة 4) ، ويتم تنفيذ يغسل عن طريق وضع أنبوب في موقف المغناطيسي بدلا من الطرد المركزي.
المخزن المؤقت التخزين المستخدمة ل "محلية الصنع" الخرز الضد المغلفة ، وتحتوي على 0.1 ٪ ، والجلايسين الصوديوم 0.1 ٪ azid في برنامج تلفزيوني ، مع درجة الحموضة من 7.2.
الأهم من ذلك ، تأكد من استخدام المصل exosome المنضب لغسل العازلة التدفق الخلوي (1-3 ٪ المصل في برنامج تلفزيوني) ، لتجنب أيمصل exosomes تلويث التحليل.
علما ، وعندما يؤدون توصيف exosome باستخدام الخرز جانب الضد من المهم أن نقر بأنها ليست سوى subpopulation معينة ومحددة لاستخدام الأجسام المضادة ، وهذا هو معزولة ، وتميزت.
4. Exosome الكشف عن طريق لطخة غربية
لطخة غربية هي طريقة راسخة ونحن لن ندخل في التفاصيل بشأن الأسلوب نفسه ، ولكن التركيز على أهمية وجود بروتين العزلة مناسبة قبل الغربية وصمة عار على الأجسام المضادة المختلفة المستخدمة.
- حل بيليه exosome في البروتين المخزن في الاختيار وتحلل بدقة pipetting ، تليها الخلط الدوامة. لمزيد من ليز exosomes ، يصوتن العينة في حمام مائي 3 × 5 دقائق مع الخلط دوامة بينهما. الطرد المركزي أخيرا العينة ، 13 000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وطاف لنقل أنبوب إيبندورف جديدة.
- Measuاعادة البروتين الكلي من خلال طريقة الاختيار والحمل 20-50 ميكروغرام من البروتين لكل بئر.
- منفصلة ونقل البروتينات التي الكهربي الهلامي وelectroblotting.
- كتلة ويغسل الغشاء قبل تنفيذ immunostaining ضد بروتينات المخصب في exosomes.
- الكشف عن بروتين معين ، وذلك لمعان كيميائي نظام التصوير الرقمي والبرمجيات التحليل.
كما لا توجد علامات exosome محددة ، والبروتينات التي يتم تخصيبها في exosomes ، من أصل جميع الخلوية المختلفة ، وتستخدم عادة للكشف عن exosome. هذه هي بروتينات مثل tetraspanins (مثل CD9 ، CD63 CD81 و) ، بروتين يرتبط الهيكل الخلوي (مثل ezrin) والبروتينات المشاركة في نشوء حيوي عديد الحويصلات (مثل Tsg101 وأليكس). البروتينات الأخرى التي هي أيضا عادة في الكشف عن exosomes هي Flotillin ، Hsc70 راب والبروتينات المختلفة وما إلى ذلك ، هناك أيضا بروتينات معينة موجودة في الخلايا exosomes مثل A33 (الخلايا الظهارية في الأمعاء) ، CD3(خلايا تي) وMHC من الدرجة الثانية (خلايا مقدمة للمستضد). وبالتالي ، قد يتوقف على ما من نوع من الخلايا يتم الإفراج عن exosomes من علامات لكشف تختلف.
كما المقصورات الأخرى من الخلية أيضا يمكن أن تنتج الحويصلات ، ويوصى كذلك لتحديد وجود هذه البروتينات من المقصورات مثل شبكية هيولي باطني (على سبيل المثال وcalnexin Grp78) وجهاز جولجي (مثل GM130). وبالتالي ، عدم وجود هذه البروتينات أو قليلا يدل على عدم تلوث الحويصلات من الغرف الأخرى في العينة التي شملتها الدراسة.
5. عزل الحمض النووي الريبي وتحليل الحمض النووي الريبي exosomal
- حل بيليه exosome في المنطقة العازلة تحلل الحمض النووي الريبي لاختيار وتنفيذ RNA الاستخراج. ويمكن استخدام مجموعات مختلفة تبعا لعزل الحمض النووي الريبي التجارب اللاحقة ، ولكن أساليب عمود أساس توفر العينات مع مجموعة أوسع من الحمض النووي الريبي. نحن نستخدم حاليا miRCURY كيت عزل الحمض النووي الريبي التي Exiqon ، ولكن مجموعات أخرى قد تكون مناسبة اعتمادا على الشوريientific مسألة في متناول اليد.
- عند تنفيذ RNA العزلة من المهم أن تعمل في بيئة خالية من ريبونوكلياز. بالتالي استخدام الحمض النووي وnuclease نصائح مجانية ماصة والقضاء على حد سواء مقاعد البدلاء والمعدات خالية من الملوثات وRNases.
- لعزل الحمض النووي الريبي ، وذلك باستخدام أدوات miRCURY عزل الحمض النووي الريبي ، ويحل exosome بيليه في 350 ميكروليتر من محلول تحلل وأداء دوامة - خلط لمدة 15 ثانية.
- إضافة 200 ميكروليتر من الايثانول 95 ٪ ودوامة - خلط لمدة 10 ثانية.
- وضع عمود في أنبوب جمع ونقل exosomes lysed إلى العمود والطرد المركزي 1 دقيقة في 14 X 000 جرام.
- يغسل ثلاث مرات وذلك بإضافة 400 ميكروليتر من محلول الغسيل إلى العمود الذي يحتوي على الحمض النووي الريبي وexosomal الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 14 X 000 جرام.
- العمود الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 14 XG 000 للتأكد من أن العمود الجاف ومكان العمود الجاف في أنبوب إيبندورف ريبونوكلياز خالية.
- إضافة 50 مخزن شطف ميكروليتر إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 في 200 دقيقة XG ، تليها 1 دقيقة في 14 ز س 000
- الاستمرار في عزل الحمض النووي الريبي أو تخزينه في -80 درجة مئوية.
لكشف وتحليل الحمض النووي الريبي المستخرج exosomal الكلي ، استخدام 2100 اجيلنت Bioanalyzer مع نانو 6000 رنا RNA أو طقم بيكو 6000. ويبين تحليل الحمض النووي الريبي exosomal العائد وحجم التوزيع.
6. ممثل النتائج
Exosomes هي صغيرة جدا بحيث لا يمكن الكشف عنها بواسطة الأساليب المتاحة التدفق الخلوي ، وبالتالي هي التي تعلق على جسم المغلفة الخرز قبل أن يتم تحليلها (الشكل 1). كما exosome - حبة المجمعات يمكن تجميع يمكن مبعثر مؤامرة تدفق الخلوي تحتوي على مجموعات مختلفة من الخرز ، واحد مرتين وثلاث مرات (الشكل 2A). السهم يشير إلى الخرز واحدة التي هي لمزيد من التحليل. ويرد CD63 الإيجابية واحد حبة exosome السكان مقارنة للسيطرة isotype في الشكل 2B.
e_content "> ونظرا لصغر حجم exosomes ، فإنها يمكن أن تكون إلا تصور مباشرة مع المجهر الإلكتروني ، وليس من خلال المجهر الضوئي. الخصائص المورفولوجية نموذجي من exosomes تتشكل المستديرة و30-100 نانومتر غشاء الحويصلات الحجم. وفي (3) ، الشكل المجهري الإلكترون تظهر الصور exosomes immunostained (A) مع الذهب المسمى الضد لCD63 (يشار إليه السهم) وغير immunostained exosomes (B).لتحديد أن حويصلات معزولة هي في الواقع exosomes وتميز مزيد من البروتينات exosomal ، ويشيع استخدام لطخة غربية. ويبين الشكل 4 عدم وجود calnexin ، علامة شبكية هيولي باطني. هذا يشير إلى القليل من تلوث الحويصلات من شبكية هيولي باطني. علاوة على ذلك ، ويبين الشكل 4 من الوجود في exosomes CD81 ، وهو tetraspanin المخصب عادة في exosomes.
الخليوي RNA تحتوي أساساق الحمض النووي الريبي الريباسي (الرنا الريباسي) ، كما شوهد اثنان من ابرز القمم ل18S 28S الرنا الريباسي والمفارز في تحليل Bioanalyzer (الشكل 5A). ومع ذلك ، RNA exosomal تختلف في التشكيل على النحو exosomes تفتقر إلى ذروتين الرنا الريباسي (18S 28S و) والمخصب في الحمض النووي الريبي قصيرة مثل مرنا وميرنا (الشكل 5B).
الشكل 1. نظرا لصغر حجم exosomes (30-100 نانومتر) ، فإنها لا تستطيع أن تميز من الضوضاء والخلفية عند تحليلها مع التدفق الخلوي. لذلك ، فإنه من الضروري إرفاقها حبات مغلفة الضد قبل تحليل exosomes التي ثم يمكن تصور بواسطة الليزر.
الشكل 2. حبات exosome المعقدة يمكن تجميع مع بعضها البعض وتشكل حبات المزدوج والثلاثي (A). السهم هو واحد مما يدل على حبة EXO بعض السكان التي هي بوابات واستخدامها لمزيد من التحليل. سيكون هذه الفئة من السكان مقارنة مباشرة إلى عنصر تحكم isotype (الرمادية تملأ الذروة) لتحديد وجود جزيئات الغشاء من exosomes. وترد CD63 exosomes الايجابية (ذروة مفتوحة الأسود) في الشكل باء.
الشكل 3. micrographs الإلكترون من exosomes مع التشكل نموذجية وحجم (40-80 نانومتر) (A و B). السهم في الشكل ألف يشير إلى الجسيمات الذهبي للأجسام المضادة الثانوية ، والتحقق من أن هذا قد exosome CD63 على سطح غشاء لها.
الشكل 4. لطخة غربية تظهر نتائج لغياب بروتين calnexin شبكية هيولي باطني ولكن وجود هذا البروتين المخصب عادة في exosomes ، tetraspanin CD81.
الشكل 5. عرض النتائج Bioanalyzer جود الحمض النووي الريبي في الخلايا (A) وexosomes (B). الأسهم تشير إلى و18S 28S الرنا الريباسي مفارز موجودة في الخلايا. كما تحتوي على رجولي exosomal RNA RNA الصغيرة لم يتم تحديد الرنا الريباسي أو قليلا في exosomes.
Discussion
عند دراسة محتوى الجزيئية و / أو وظيفة exosomes ، لا بد من استخدام أسلوب العزل عالية الجودة التي توفر العائد المناسب ودرجة ادنى حد ممكن من التلوث. المنهجية المبينة في هذه الورقة هو نهج راسخ لعزل exosomes ودراستهم RNA المحتوى والوظيفة البيولوجية. علاوة على ذلك ، سلط الضوء على أهمية توصيف exosomes معزولة ، عن طريق مزيج من أساليب مختلفة ، بما في ذلك المجهر الإلكتروني ، التدفق الخلوي ، وصمة عار الغربية.
عندما عزل exosomes ، يتم استخدام الطرد المركزي الخطوة الأولى (300 x ج) إلى خلايا الكريات التي قد تكون موجودة في تعليق خلية أو السائل درس البيولوجية. والثانية في 16 الطرد المركزي يحتاج XG 500 إلى أن تكون قوية بما فيه الكفاية لخلايا ميتة بيليه ، وأكبر من الحطام ، والعضيات أفكارك الهيئات الأخرى. بعد هذا الطرد المركزي ، وبعض البروتوكولات تتضمن الخطوة نانو الترشيح ، ولكن بعض الجرداستبعدت estigators هذه الخطوة. ومع ذلك ، فإننا نؤكد على أهمية القضاء على شظايا والحويصلات أكبر من 200 نانومتر ، ولذا نوصي بشدة بما في ذلك خطوة الترشيح. إذا كان هناك حاجة إلى عزل أكثر صرامة ، ويمكن استخدام مرشحات نانومتر 100 ، لكن لاحظ أنه إذا تم استخدام سوائل لزجة ، ويمكن بسهولة أن تصبح هذه المرشحات المسدودة وفقدان المواد exosomal. أيضا ، قد يكون الترشيح 100 نانومتر تؤثر على مورفولوجية exosomes وعلاوة على ذلك إذا exosomes هي على نطاق واسع قد يكون خسر. وبالتالي ، فإن المرشحات 200 نانومتر تبدو مناسبة لعزل exosome. بعد الترشيح ، ويتم استخدام تنبيذ فائق إلزامية في XG 120000 لexosomes الكرية. يمكن أن يكون كذلك مع غسلها exosomes PBS ، منضما إلى الضد حبات مغلفة وغسلها ، أو وضعها على التدرج السكروز لإزالة التلوث البروتينات. ومع ذلك ، وهذا يمكن أن يكون عملية الموارد طويلا جدا القول بأننا لا يكون ضروريا ، وخاصة إذا كان حجم العينة بدءا صغيرة و / أو محتوى س RNAو في exosomes منخفضة ، باعتبارها خطوات إضافية سيقلل بدرجة كبيرة من مواد أخرى. ومع ذلك ، مرة أخرى ، ينبغي أن يثبت طبيعة حويصلات معزولة عن وجود وعدم وجود بروتينات معينة.
حتى الآن ، لم يتم التعرف على البروتين علامة فريدة من نوعها على الاطلاق لexosomes للتحقق من أن العينة تحتوي على exosomes ولا شيء آخر. ونتيجة لذلك ، يطلب من مزيج من الأساليب لتوصيف exosomes ، بما في ذلك تحديد حجم ومورفولوجية exosomes بواسطة المجهر الإلكتروني. أيضا ، يمكن تحديد نقاء العينة المجهر الإلكتروني ، لأن هذا الأسلوب يمكن أن تقدم لمحة عامة عن مستوى التلوث في العينة ، على سبيل المثال مع الحويصلات أكبر ، مثل المجهرية الدقيقة ، والهيئات أفكارك أو الحطام الخلية. وعلاوة على ذلك ، يمكن تحديد محتوى البروتين من exosomes بواسطة التدفق الخلوي وصمة عار الغربية ، والجمع بين هذه النتائج طريقتين في تحليل الغشاء ملزمة على السواء (على سبيل المثال وCD63CD81) والمنضوية البروتينات (مثل Tsg101 وأليكس) من exosomes. الكشف عن البروتينات في exosomes المخصب ، مثل Tsg101 ، CD63 وأليكس ، وعدم وجود البروتينات مثل بروتين calnexin شبكية هيولي باطني ، هو إشارة إلى أن بيليه exosome المخصب هو في الواقع وليس الحويصلات exosomes تلويث من المقصورات الأخرى في الخلية.
ملف من الحمض النووي الريبي التي يتم الكشف عنها في exosomes يختلف اختلافا جذريا لتلك التي وجدت في الحمض النووي الريبي خلايا سليمة. وهكذا ، RNA exosomal تحليلها بواسطة Bioanalyzer أو في جل النهج المستندة إلى تحليل الحمض النووي الريبي تفتقر إلى قمم اثنان ل18S 28S الرنا الريباسي والمفارز ، والتي هي بارزة في تحليل الحمض النووي الريبي الخلوية. ولذلك فإننا نقول للكشف عن أي كميات كبيرة من الرنا الريباسي في عينة تشير إلى أن الحمض النووي الريبي مجموع المستخرج من أصل غير exosomal وحدها ، وبالتالي أن الأسلوب العزلة بحاجة إلى تحسين نوعية ومضمون.
Disclosures
JL هو شريك في ملكية براءة الاختراع ذات الصلة لاستخدام exosomes وناقلات لنقل الحمض النووي الريبي إلى الخلايا.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذه الدراسة من قبل مجلس الأبحاث السويدي (K2008 - 57X - 20 676-01-3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 65670 | |
| Quick-seal ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776) | |
| Quick-Seal Cordless Tube Topper kit | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Filtropur Syringe Filter, 0.20μm | Sarstedt Ltd | 83.1826.001 | For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600). |
| Formvar/carbon coated nickel grids | Ted Pella, Inc. | 1GN200 | |
| Mouse-anti-human CD63 | BD Biosciences | 556019 | Final conc: 0.05μg/μl |
| Isotype control; IgG1κ (MOPC 21) | Sigma-Aldrich | M9269 | Final conc: 0.05μg/μl |
| Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm | Sigma-Aldrich | G7777 | Final conc: 1% |
| LEO 912AB Omega Electron microscope | Carl Zeiss, Inc. | Or equivalent equipment. | |
| 4μm aldehyd/sulphate latex beads | Interfacial Dynamics | 12-4000 | |
| Antibody for coating of the latex beads | For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019) | ||
| Intelli-Mixer RM-2L | ELMI | Or equivalent equipment. | |
| IgG from human serum | Sigma-Aldrich | I4506 | |
| Antibodies for detection | BD Biosciences | For example: PE anti-CD63 (556020)PE anti-CD9 (555372)PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749) | |
| BD FACSAria | BD Biosciences | ||
| Transsonic T 490 DH | ELMA | Or equivalent equipment. | |
| miRCURY RNA Isolation Kit | Exiqon A/S | 300110 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939A |
References
- Pan, B. -T., Johnstone, R. M. Fate of the transferrin receptor during maturation of sheep reticulocytes in vitro: Selective externalization of the receptor. Cell. 33, 967-978 (1983).
- Chaput, N., Thery, C. Exosomes: immune properties and potential clinical implementations. Semin. Immunopathol. , 10-1007 (2010).
- Lässer, C. RNA-containing exosomes in human nasal secretions. Am. J. Rhinol. Allergy. 25, 89-93 (2011).
- Caby, M. -P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int. Immunol. 17, 879-887 (2005).
- Palanisamy, V. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5, e8577-e8577 (2010).
- Admyre, C. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J. Immunol. 179, 1969-1978 (2007).
- Almqvist, N., Lönnqvist, A., Hultkrantz, S., Rask, C., Telemo, E. Serum-derived exosomes from antigen-fed mice prevent allergic sensitization in a model of allergic asthma. Immunology. 125, 21-27 (2008).
- Prado, N. Exosomes from Bronchoalveolar Fluid of Tolerized Mice Prevent Allergic Reaction. J. Immunol. 181, 1519-1525 (2008).
- Zitvogel, L. Eradication of established murine tumors using a novel cell-free vaccine: dendritic cell-derived exosomes. Nature. Medicine. 4, 594-600 (1998).
- Ashiru, O. Natural Killer Cell Cytotoxicity Is Suppressed by Exposure to the Human NKG2D Ligand MICA*008 That Is Shed by Tumor Cells in Exosomes. Cancer. Research. 70, 481-489 (2010).
- Liu, C. Murine Mammary Carcinoma Exosomes Promote Tumor Growth by Suppression of NK Cell Function. The Journal of Immunology. 176, 1375-1385 (2006).
- Viaud, S. Dendritic Cell-Derived Exosomes Promote Natural Killer Cell Activation and Proliferation: A Role for NKG2D Ligands and IL-15Rα. PLoS ONE. 4, e4942-e4942 (2009).
- Szajnik, M., Czystowska, M., Szczepanski, M. J., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Tumor-Derived Microvesicles Induce, Expand and Up-Regulate Biological Activities of Human Regulatory T Cells (Treg). PLoS ONE. 5, e11469-e11469 (2010).
- Raposo, G. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. J. Exp. Med. 183, 1161-1172 (1996).
- Abusamra, A. J. Tumor exosomes expressing Fas ligand mediate CD8+ T-cell apoptosis. Blood Cells, Molecules, and Diseases. 35, 169-173 (2005).
- Valadi, H. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Eldh, M. Exosomes communicate protective messages during oxidative stress; possible role of exosomal shuttle RNA. PLoS One. 5, e15353-e15353 (2010).
- Lässer, C. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. J. Transl. Med. 9, 9-9 (2011).
