Summary
본 논문은 격리, 정화 및 exosomes의 감지,뿐만 아니라 분자의 콘텐츠 분석 기술에 대한 방법을 보여줍니다. 이러한 방법은 세포 배양 매체와 생물 학적 체액 모두에서 exosome 고립에 대한 적응력, 그리고 분자 내용의 분석을 넘어도 기능성 연구에 유용할 수 있습니다.
Abstract
exosome 연구 분야는 급속하게 최근 몇 년 동안 출판에 극적인 증가, 확장됩니다. endocytic 원산지 이러한 작은 vesicles (30-100 NM)는 첫번째 적혈구 한으로 자라고있는 동안 reticulocytes는 트랜스페린 수용체를 근절하기위한 방법으로 함수를 제안했고, 나중에 exosomes를 선정되었습니다. Exosomes는 multivesicular 기관 (MVBs)를 생산, endosomes 후반의 신진 안쪽에 의해 형성되며, 플라즈마 막 2 MVBs의 융합에 의해 환경에 발표됩니다. exosomes의 첫 발견 이래, 세포의 광범위한 이러한 vesicles 발표 보여왔다. Exosomes 또한 플라즈마, 코와 세척 유체, 타액과 모유 3-6 포함한 여러 생물 학적 체액에서 발견되었습니다. 또한, 그것은 exosomes의 내용과 기능은 원래 세포와 그들이 생산되는 아래의 조건에 따라 해당 증명되었습니다. 기능의 다양한 귀신을했습니다이러한 알레르기 항원 7,8, 마우스 9, T 세포 규제 13, T 세포 증식 14 자극으로 자연 킬러 세포의 억제 및 활성화 10-12, 분화 촉진 설립 종양의 근절에 대한 내성의 유도로 exosomes, 그리고 대한 trated 15 apoptosis T 세포의 유도. 2007 년 우리는 마스트 세포에서 발표 exosomes 메신저 RNA (mRNA)와 microRNA (miRNA)를 포함하고 RNA는 세포 하나에서 exosomes를 통해 다른 shuttled 수있다는 것을 보여주었다. 받는 사람 세포에서 exosomes로 shuttled mRNA는 RNA 양도 16 규제 기능을 제안, 단백질로 번역되는 표시했다. 또한, 우리는 또한 산화 스트레스가 성장 세포에서 파생된 exosomes받는 사람 세포에 대한 스트레스에 대한 내성을 유발하기 때문에 exosomal 셔틀 RNA 17 생물 학적 기능을 제안할 수 것으로 나타났습니다. 세포 배양 매체와 생물 학적 유체의 공동vesicles의 혼합물을 ntain과 조각을 창고. exosomes을위한 고품질의 절연 방식은, 특성화 및 exosomes과 콘텐츠의 식별 다음, 따라서 다른 vesicles과 입자의 exosomes를 구별하는 데있어 매우 중요합니다. 여기, 우리는 세포 배양 매체와 체액 모두에서 exosomes의 고립을위한 방법을 제시한다. 이 분리 방법은 exosomes이 pelleted하는 최종 ultracentrifugation 단계 다음 반복 원심 분리 및 여과 단계에 따라 달라집니다. exosomes를 식별하고 exosomal 형태 및 단백질 함량을 특성화하는 것이 중요합니다 방법은 전자 현미경, 유동세포계측법 및 서양 얼룩을 포함하여 강조 표시됩니다. 전체 exosomal RNA의 정화는 스핀 칼럼 크로마 토그래피에 기반하고 exosomal RNA 수율 및 크기 분포는 Bioanalyzer를 사용하여 분석합니다.
Protocol
1. Exosome 격리
- exosome 무료 혈청 매체 세포를 성장. 따라서, 모든 혈청은 세포 배양 매체에 추가이 4 박 120 000 XG에 ultracentrifugation에 의해 exosomes의 고갈되어야 ° C를 사용하기 전에.
- 원뿔 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 4 10 분 300 XG에 원심 분리기 ° 펠렛 셀 C.
- 초원 심 분리기 튜브를하고 그렇지 않으면 완전한 추가 PBS로 뜨는을 전송합니다.
- 4 20 분 동안 16 500 XG에서 샘플을 원심 ° C 추가 세포와 세포 파편을 제거합니다.
- 200 NM보다 큰 입자를 제거하는 필터 0.2 μm의를 통해 뜨는을 필터링합니다.
- 새로운 초원 심 분리기 튜브에 필터링된 뜨는을 전송 4 70 분 120 000 XG에 초원 심 분리기 전에 튜브를 밀봉 ° C를 펠렛 exosomes 수 있습니다.
- 뜨는 폐기하십시오.
- 최대한 exosome 검색은 exosome을 풍부하게 resuspend적절한 버퍼의 작은 볼륨 (~ 3 X 50 μl)에 반복 에드 펠릿. 이 버퍼 exosome 절연 다음과 같은 계획 스트림 실험에 따라 달라집니다. 예를 들어, 용해 버퍼는 단백질과 RNA 분리에 사용되는, PBS는 전자 현미경과 유동세포계측법 및 기능 연구 매체가 선호하는 수에 사용됩니다.
참고; exosomes도 세포 배양 매체에 대한 동일한 절차를 사용하는 등 플라즈마와 같은 다른 체액, 격리 수 있습니다. 점성 유체에 대한 그것은 전에 원심 분리와 여과 단계로 PBS와 함께 샘플을 희석해야 할 수도 있습니다. 포인트 위의 5 원심 분리 속도와 관련하여, 그것은 29 500 XG로 증가 수 있으며, 포인트 7 ultracentrifugation은 90분 18 확장될 수 있습니다.
샘플 더 정화해야하는 경우 exosome 펠렛은 자당 기울기에 떠내려 수 있으며 exosomes는 분획 represe에서 주로 발견됩니다1.13-1.19 g / ML 2 밀도를 nting.
2. 전자 현미경에 의해 Exosome 식별
- 을 추가, 오염 단백질을 제거 4 70분 120 000 XG ° C로 다시 펠렛 exosomes에서 exosome 풍부한 PBS의 펠렛과 초원 심 분리기를 resuspend.
- 단백질 분리 및 총 단백질 측정을위한 시료의 작은 나누어지는를 가져가라. 샘플의 극히 일부는 단백질 측정 lysed 및 사용되었는지 확인하고 얼음에 별도의 또는 -80 ° C에서 추가 실험 PBS에서 해결 그대로 exosomes을, 유지.
- Parafilm에 드롭, PBS에 resuspended 그대로 exosomes의 exosomal 단백질의 약 10 μg을 넣으십시오. 그런 다음, 집게와 함께 부드럽게 30~60분 각 드롭 위에 formvar 탄소 코팅 니켈 격자 위치. 격자가 exosomes를 포함하는 드롭 직면하고 코팅 면을 위치입니다기만하면됩니다.
- t에 PBS 세 방울, 각 30 μl, 장소그는 Parafilm하고 순차적으로 PBS의 방울 상단에있는 격자를 위치하여 격자를 씻어, 그리고 사이에 흡수 종이를 사용합니다. 부드럽게 막 코팅 영역과 접촉하지 않고, 격자의 측면에 밀접하게 그것을 잡고하여 흡수 종이를 사용하십시오.
- 보증금으로 Parafilm에 2 % paraformaldehyde의 드롭을 예제를 수정하고 10 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 놓으십시오.
- 적절한 항체와 immunostaining 전에 포인트 4 세정 단계를 반복합니다. 일반적으로 사용되는 항체 안티 CD63 및 안티 MHC 클래스 II 수 있습니다. 전자 현미경은 또한 exosomes는 전적으로 크기와 형태에 따라 확인할 수 있습니다대로 immunostaining없이 수행할 수 있습니다. 그러나, 우리는 크기, 형태 및보다 확실한 검증을 위해 막 단백질의 존재를 평가하는 것이 좋습니다.
- 선택의 주요 항체의 30 μl 드롭으로 격자를 전송하고 40 분 알을 품다. 포인트 4를 반복하여 씻어지만, PB에서 알부민 0.1 % 소 혈청을 사용대신 PBS 혼자의 S.
- 포인트 7를 반복하지만, 10 nm의 - 골드 라벨 차 항체와 PBS로 세척 혼자와.
- Parafilm 2.5 %의 글루 타 알데히드의 드롭을 추가하여 샘플을 포스트 수정하고 10 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 품어. 포인트 4의 세척을 반복하지만, 탈이온수 다섯 방울 대신 PBS 세 방울을 사용합니다.
- Parafilm에 2 % uranyl 아세트산의 드롭을 추가하고 15 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 부화하여 명암 샘플을.
- Parafilm에 0.13 %의 메틸 셀룰로오스의 방울 및 0.4 %의 uranyl 아세트산을 추가하여 샘플을 포함하고 10 분 동안 드롭의 상단에있는 격자를 품어.
- 최대 코팅된 면을 종이에 격자를 위치하기 전에, 부드럽게 흡수 종이를 사용하여 여분의 액체를 제거하고 공기를 5 분 건조하자.
- 전자 현미경으로 준비를 검사하거나 향후 작업에 대한 격자 상자에 그리드를 저장합니다.
3.유동세포계측법에 의해 Exosome 특성화
exosomes 현재 유동세포계측법 장치에 의해 감지가 너무 작아 있으므로, 먼저 항체 코팅 비즈 (그림 1)로 exosomes를 바인딩하는 것이 필요합니다. 이 구슬은 어느 준비가 만들어진 제품으로 구입하거나 선택의 항체와 실험실에서 만들 수 있습니다. exosomal 세포 기원에 따라, 서로 다른 항체가 자기 또는 라텍스 문자 중 하나가 될 수 있습니다 구슬에 결합하실 수 있습니다. 우리는 현재이 분석을 위해 안티 MHC 클래스 II 또는 방지 CD63 코팅 구슬을 사용합니다.
- "수제"항체 코팅 구슬의 사용을 위해, 우리는 안티 CD63 항체로 코팅된 4 μm의 라텍스 구슬을 사용합니다. 두번 100 μl MES 버퍼에 25 μl 4 μm의의 라텍스 비즈 (30 X 10 6 구슬) 15-20분 3 000 XG 씻으 100 μl MES 버퍼의 펠렛을 redissolve. MES 버퍼의 동일한 볼륨 12.5 μg 항체 동등한 볼륨을 포함하는 항체 혼합물을 준비합니다. 추가항체 혼합물과 실온에서 하룻밤 동안 교반에 따라 부화 구슬. PBS (20 분 3 000 XG)와 항체 코팅된 비즈 세 번이나 씻고 (300 000 구슬 / μl의 최종 농도)를 저장 버퍼의 100 μl의 펠렛을 디졸브.
- 각 샘플에 대한 (각 항체) ~ 100 000 항체 코팅 비즈 당 exosomal 단백질 30 μg의 최소 (PBS에서 해결 그대로 exosomes의)에 동일한 볼륨을 계속합니다.
- 4 박 이상, 300 μl PBS의 총 볼륨에 exosomes와 구슬을 품어 ° C 부드러운 움직임에 따라.
- 30 분 200 MM 글리신과 부화 300 μl를 추가하여 차단합니다.
- 두 번 씻어 버퍼에있는 exosome - 구슬 단지 (PBS에서 1-3% 혈청), 10 분 동안 600 XG 씻으십시오.
- 4시 50 μl IgG 항체와 exosome - 비드 단지 ° C.를 품어 5 단계에서 설명한대로 세척 버퍼에 두 exosome - 비드 단지 씻으십시오.
- 90 μl 세척 버퍼와 10 μl를 추가부드러운 움직임에 따라 40 분 exosome - 비드 단지와 부화 선택의 항체 (이상적으로, 안티 - 안티 - CD9 CD63 또는 항 CD81). 로 5 단계에서 설명한 세척 버퍼에있는 exosome - 비드 단지 두 번 씻으십시오.
- 300 μl 세척 버퍼를 추가하고 유동세포계측법을 사용하여 데이터를 취득.
설명한대로 위에서 다른 구슬들은 다음과 같은 프로토콜이나 자기 구슬에 설명된 라텍스 구슬로 사용할 수 있습니다. 자석 구슬 대신 사용하는 경우 프로토콜이 약간 다르다는 것을,주의하시기 바랍니다. 차단 단계 (4 점)가 필요되지 않고 세척 대신 원심 분리의 자기 스탠드에 튜브를 삽입하여 수행됩니다.
"수제"항체 코팅 비즈에 사용되는 저장 버퍼는 0.1 % 글리신 및 7.2의 산도와 PBS에 azid 0.1 %의 나트륨이 포함되어 있습니다.
중요한 것은 어떤을 피하기 위해, 유동세포계측법 세척 버퍼 (PBS에 혈청 1-3%)에 대한 exosome 고갈 혈청을 사용해야합니다분석을 오염 혈청 exosomes.
참고; 항체 결합 구슬을 사용하여 exosome 특성화를 수행할 때 그것은 격리 및 특징입니다 사용되는 항체에 대한 구체적인 특정 subpopulation,임을 인정하는 것이 중요합니다.
4. 서양 얼룩으로 Exosome 검출
서양 얼룩은 물론 기존의 방법이며 우리는 그 방법 자체에 관한 세부 사항에 들어가지만, 서양 얼룩 및 사용 다른 항체 전에 적당한 단백질 분리의 중요성에 초점을하지 않습니다.
- 선택의 단백질 용해 버퍼에 exosome 펠렛을 해산하고 와동 - 믹싱 다음, 철저 pipetting. 더욱 exosomes을 lyse하려면 물 목욕 3 샘플을 sonicate 사이에 와동 - 믹싱과 X 5 분 거리에 있습니다. 마지막으로 상온에서 5 분, 13 000 XG를 샘플을 원심, 새로운 eppendorf 튜브에 뜨는을 전송.
- 현 대 적 인선택의 방법에 의해 총 단백질을 다시하고 당 잘 단백질의 20-50 μg을로드합니다.
- 별도의 겔 전기 영동과 electroblotting하여 단백질을 전송합니다.
- 블록과 exosomes에 풍부한 단백질에 대한 immunostaining를 수행하기 전에 막을 씻으십시오.
- chemiluminescence, 디지털 이미징 시스템 및 분석 소프트웨어에 의해 특정 단백질을 감지합니다.
모든 다른 세포 기원부터 exosome 특정 마커, exosomes에 풍부한 아르 단백질은 없습니다로서, 일반적으로 exosome 감지에 사용됩니다. 이들은 같은 tetraspanins (예 : CD9, CD63과 CD81), cytoskeleton 연결 단백질 (예 : ezrin) 및 multivesicular biogenesis (예 : Tsg101 및 alix)에 관여 단백질로 단백질입니다. 또한 일반적으로 exosomes에서 검색된 다른 단백질이 Flotillin, Hsc70 및 다른 rab 단백질 등을하는 것은 그러나, A33 (창자 상피 세포)로 exosomes에서 발견 세포 특정 단백질, 인 경우에는 3 번 CD도 있습니다(T 세포)와 MHC 클래스 II (항원 제시 세포). 따라서 exosomes이 검출을위한 마커에서 출시된 어떤 휴대폰 종류에 따라 달라질 수 있습니다.
세포의 다른 구획도 vesicles를 생산 수 있듯이, 그것은 더 이상 이러한 endoplasmic reticulum (예 : calnexin 및 Grp78)와 잠돌군 Zz 장치 (예 : GM130) 이러한 구획에서 단백질의 존재를 확인하는 것이 좋습니다. 따라서, 이러한 단백질 부족은 연구 샘플에있는 다른 구획의 vesicles 전혀 또는 거의 오염을 나타냅니다 없습니다.
5. exosomal RNA 및 RNA 분석의 분리
- 선택의 RNA의 용해 버퍼에 exosome 펠렛을 분해 및 RNA 추출을 수행합니다. 다른 RNA 분리 키트는 하류 실험에 따라 사용하지만, 컬럼 기반의 방법은 RNA의 넓은 스펙트럼과 샘플을 제공하실 수 있습니다. 현재 Exiqon로 miRCURY RNA 격리 키트를 사용하고 있지만, 다른 키트는 SC에 따라 적절한 수 있습니다손을 ientific 질문입니다.
- RNA 분리를 수행할 때 그것은 RNase가없는 환경에서 작업하는 것이 중요합니다. 따라서 핵산과 nuclease 무료 피펫 팁을 사용하여 오염 물질과 RNases에서 무료로 벤치와 장비 모두를 닦으십시오.
- RNA 분리에 대한, miRCURY RNA 격리 키트를 사용하여 용해 용액 350 μl의 exosome 펠렛을 해산하고 15 초 동안 와동 - 혼합을 수행합니다.
- 95 %의 에탄올과 10 초 와동 - 혼합 200 μl를 추가합니다.
- 컬렉션 튜브에 열을 놓고 열 lysed exosomes을 전송 14 000 X G.에서 1 분 원심
- 14 000 X G.에서 1 분 exosomal RNA와 원심 분리기를 포함하는 컬럼에 씻으 솔루션 400 μl를 추가하여 세 번 씻으십시오
- 컬럼이 건조하고 RNase없는 eppendorf 튜브의 건조한 열을 곳이 있는지 확인하기 위해 XG 14 000에서 2 분 동안 열을 원심.
- 2 열 및 원심 50 μl 용출 버퍼를 추가합니다 200 XG에 분 14 000 X G.에서 일분 뒤에
- 분리된 RNA를 계속하거나 -80에 저장 ° C.
압축을 푼 총 exosomal RNA의 검출 및 분석, RNA 6000 나노 또는 RNA 6000 피코 키트와 애질런트 2100 Bioanalyzer를 사용합니다. 분석 exosomal RNA 수율 및 크기 분포를 보여줍니다.
6. 대표 결과
Exosomes 사용할 수 유동세포계측법 방법에 의해 감지가 너무 작아 있으며, 따라서 (그림 1) 분석되기 전에 항체 - 코팅 구슬에 붙어 있습니다. exosome - 구슬 단지가 집계 가능한 유동세포계측법의 분산형 줄거리는 싱글, 더블, 트리플 구슬의 다른 인구 (그림 2A)을 포함할 수 있습니다. 화살표는 더 분석하는 하나의 구슬을 나타냅니다. 의 isotype 제어에 비해 CD63 양성 단일 비드 - exosome 인구는 그림 2B에 표시됩니다.
e_content은 "exosomes의 작은 크기로> 때문에, 그들은 그저 가벼운 현미경에 의한 전자 현미경 직접 시각되고, 수 없습니다. exosomes의 전형적인 형태학의 특성이 원형 모양 30-100 nm의 크기의 멤브레인 vesicles 있습니다. 그림 3, 전자 현미경에서 사진 exosomes은 CD63에 대한 골드 라벨 항체 (화살표로 표시)과 비 immunostained exosomes (B)와 (A) immunostained 보여줍니다.격리 vesicles 실제로 exosomes 것을 확인하고 더욱 exosomal 단백질을 특성화하기 위해 서양의 얼룩은 일반적으로 사용됩니다. 그림 4 calnexin, endoplasmic reticulum의 마커의 부재를 보여줍니다. 이것은 endoplasmic reticulum에서 vesicles 거의 오염을 나타냅니다. 또한, 그림 4는 일반적으로 exosomes의 풍부한 tetraspanin입니다 exosomes에서 CD81의 presences를 보여줍니다.
세포 RNA는 주로 포함되어 있습니다Bioanalyzer 분석 (그림 5A)에서 18S rRNA와 28S subunits에 대한 두 눈에 띄는 봉우리로 볼 수의 ribosomal RNA (rRNA). exosomes는 두 rRNA의 봉우리 (18S와 28S)을 부족과 같은 mRNA와 miRNA (그림 5B)로 짧은 RNA에 풍부한 아르 그러나 exosomal RNA 자신의 프로필에서 다릅니다.
그림 1. 유동세포계측법로 분석하면 exosomes (30-100 nm의)의 작은 크기로 인해, 그들은 소음과 배경에서 구분할 수 없습니다. 따라서 다음 레이저로 시각 수있는 exosomes가 분석되기 전에 항체 코팅 구슬로 그들을 첨부할 필요가 있습니다.
그림 2. 복잡한가 서로 양식을 더블, 트리플 구슬로 집계 수 exosome - 구슬 (A). 화살표는 단일 비드 - 엑소을 보여주는 것입니다 문이 추가적인 분석에 사용되는 몇 가지 인구. 이 인구는 직접 exosomes의 멤브레인 분자의 존재를 확인하기 위해 isotype 제어 (채워진 회색 피크)에 비해 것입니다. CD63 양성 exosomes는 (블랙 오픈 피크) 그림 B에 표시됩니다.
그림 3. 일반적인 형태 및 크기 (40-80 nm의) (A와 B)과 exosomes의 전자 micrographs. 그림에서 화살표는이 exosome는 막 표면에 CD63이 있는지 확인, 보조 항체의 황금 입자를 나타냅니다.
그림 4. endoplasmic reticulum 단백질 calnexin의 부재하지만, 일반적으로 exosomes, tetraspanin CD81에 풍부한 단백질의 존재를 보여주는 서양 얼룩 결과입니다.
그림 5. 전지 (A)과 exosomes (B)에 존재 RNA를 보여주는 Bioanalyzer 결과입니다. 화살표는 18S와 28S를 나타냅니다 rRNA의 subunits는 세포에 존재. exosomal RNA 남성이 작은 RNA를 포함하는으로 아무거나 작은 rRNA는 exosomes에서 확인되지 않습니다.
Discussion
분자 컨텐츠 및 / 또는 exosomes의 기능을 공부하면 적절한 수율 및 오염의 가장 낮은 가능한 학위를 제공하는 우수한 품질의 절연 방법을 사용하는 데있어 매우 중요합니다. 이 문서에서 설명하는 방법론 exosomes를 분리하고 RNA 내용 및 생물 학적 기능을 연구하기 위해 설립 잘 접근이다. 또한, 전자 현미경, 유동세포계측법, 그리고 서양의 얼룩을 포함하여 서로 다른 방식의 조합에 의해 격리 exosomes의 특성의 중요성이 강조 표시됩니다.
exosomes를 분리하면, 최초의 원심 분리 단계 (300 XG)은 세포 현탁액 또는 공부 생물 학적 액체에 존재있을 펠렛 전지하는 데 사용됩니다. 16 500 XG의 요구에 두 번째 원심 분리는 펠렛 죽은 세포, 큰 파편, apoptotic 기관 및 기타 organelles 충분히 강해 져야합니다. 이 원심 분리 후, 일부 프로토콜은 나노 여과 단계지만, 몇 가지 인보이스를 포함estigators이 단계를 제외했습니다. 그러나, 우리는 근절 파편 200 NM보다 크고 따라서 강력하게 여과 단계를 포함시키는 것이 좋습니다 vesicles의 중요성을 강조. 더 엄격한 격리가 필요한 경우, 100 nm의 필터를 사용하지만, 점성 유체를 사용하는 경우 이러한 필터가 쉽게 차단하고 exosomal 자료가 손실 될 수 있습니다 수 있습니다. 또한, 100 nm의 여과는 exosomes의 형태에 영향을 미칠 수 있으며 exosomes가 큰 규모로하는 경우뿐만 아니라 그들은 손실될 수 있습니다. 따라서 200 nm의 필터는 exosome 격리에 적합한 것 같습니다. 여과 후, 120,000 XG에서 필수 ultracentrifugation는 펠렛 exosomes하는 데 사용됩니다. exosomes는 더욱 항체 코팅 구슬에 바인딩하고 씻어, 또는 오염 물질의 단백질을 제거하는 자당 기울기에 위치, PBS로 씻어하실 수 있습니다. 시작 샘플 볼륨이 작은 및 / 또는 RNA 내용 O 특히 경우에는, 이것은 우리가 필요하지 않는 주장은 매우 리소스를 소모 과정 수추가 단계가 실질적으로 더 자료를 저하되므로 F exosomes가 낮습니다. 그러나, 다시 절연 vesicles의 특성은 특정 단백질의 존재와 부재에 의해 입증되어야합니다.
지금까지 exosomes에 대한 절대적으로 고유한 단백질 마커는 샘플 exosomes 진통제가 포함되어 있는지 확인하기 위해 확인되지 않았습니다. 따라서, 방법의 조합은 크기와 전자 현미경에 의해 exosomes의 형태의 결정을 포함하여 exosomes을 특성화해야합니다. 이 방법은 같은 microparticles, apoptotic 기관이나 세포 파편으로 큰 vesicles와 예를 들어 샘플의 오염 수준의 개요를 제공할 수로 또한, 시료의 순도는 전자 현미경에 의해 결정하실 수 있습니다. 또한 exosomes의 단백질 내용은 유동세포계측법과 서양 얼룩에 의해 결정 될 수 있으며, 모두 막의 분석에서 이러한 두 가지 방법 결과의 조합 (예 : CD63을 구속하고exosomes의 CD81)와 내면 단백질 (예 : Tsg101 및 alix). 이러한 CD63, Tsg101 및 alix, 그리고 endoplasmic reticulum 단백질 calnexin로 단백질의 부재로 exosomes에 풍부한 단백질의 탐지, exosome 풍부한 펠렛은 실제로 exosomes과 세포의 다른 구획에서하지 오염 vesicles는 것을 나타냅니다.
exosomes에서 감지되는 RNA의 프로필이 손상 세포에서 발견 RNA의에 근본적으로 다릅니다. 따라서 Bioanalyzer 또는 겔 기반의 RNA 분석 방식에 분석 exosomal RNA는 세포의 RNA 분석 저명한있는 18S rRNA와 28S subunits에 대한 두 봉우리 부족합니다. 따라서 샘플에서 rRNA의 상당한 양의 검출은 절연 방법 개선과 품질을 보장해야 할 것을 따라서 추출한 총 RNA 혼자 exosomal 원산지되지 않았음을 나타냅니다, 그리고 주장한다.
Disclosures
JL은 세포에 RNA의 전송을위한 벡터로 exosomes의 활용에 관한 특허의 공동 소유자이다.
Acknowledgments
이 연구는 스웨덴 연구 협의회 (K2008 - 57X - 20 676-01-3)에 의해 재정되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 65670 | |
| Quick-seal ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter Inc. | Depending on the rotor used different tubes are needed. Ti70 (342414), Ti45 (345776) | |
| Quick-Seal Cordless Tube Topper kit | Beckman Coulter Inc. | 358312 | |
| Filtropur Syringe Filter, 0.20μm | Sarstedt Ltd | 83.1826.001 | For viscose fluids and/or large volumes, a Vacuum filtration system, 0.2 μm, from VWR International can be used instead (514-0600). |
| Formvar/carbon coated nickel grids | Ted Pella, Inc. | 1GN200 | |
| Mouse-anti-human CD63 | BD Biosciences | 556019 | Final conc: 0.05μg/μl |
| Isotype control; IgG1κ (MOPC 21) | Sigma-Aldrich | M9269 | Final conc: 0.05μg/μl |
| Anti-Mouse IgG Gold Conjugate, 10 nm | Sigma-Aldrich | G7777 | Final conc: 1% |
| LEO 912AB Omega Electron microscope | Carl Zeiss, Inc. | Or equivalent equipment. | |
| 4μm aldehyd/sulphate latex beads | Interfacial Dynamics | 12-4000 | |
| Antibody for coating of the latex beads | For example anti-CD63 from BD Bioscience (556019) | ||
| Intelli-Mixer RM-2L | ELMI | Or equivalent equipment. | |
| IgG from human serum | Sigma-Aldrich | I4506 | |
| Antibodies for detection | BD Biosciences | For example: PE anti-CD63 (556020)PE anti-CD9 (555372)PE anti-CD81 (555676) Isotype control (555749) | |
| BD FACSAria | BD Biosciences | ||
| Transsonic T 490 DH | ELMA | Or equivalent equipment. | |
| miRCURY RNA Isolation Kit | Exiqon A/S | 300110 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939A |
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