Summary
الشريان المخي الأوسط (MCA) هي تقنية ربط لدراسة نقص التروية الدماغية التنسيق في النماذج الحيوانية. في هذه الطريقة ، يتعرض الشريان الدماغي الأوسط والتي حج القحف ligated بواسطة الكي. هذا الأسلوب يعطي كميات احتشاء استنساخه عالية وزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة مقارنة مع الوسائل الأخرى المتاحة.
Abstract
نقص تروية الدماغ هو التنسيق بين النوع الاكثر شيوعا من السكتات الدماغية المشاهدة في المرضى. نظرا لأهمية سريرية كان هناك جهد لفترات طويلة لتطوير نماذج حيوانية مناسبة لدراسة الأحداث التي تتكشف خلال إهانة الدماغية. وتشمل هذه التقنيات عابرة أو دائمة ، ونماذج عالمية إقفار تنسيق أو باستخدام العديد من نماذج حيوانية مختلفة ، مع القوارض أكثرها شيوعا.
يتم استخدام أسلوب الربط الدائم MCA الذي يشار إليه أيضا باسم pMCAo في الأدب على نطاق واسع كنموذج الإسكيمية التنسيق في القوارض 1-6. وقد وصفت هذه الطريقة في الأصل للفئران بواسطة تامورا وآخرون. في عام 1981 7. في هذا البروتوكول استخدمت للوصول إلى حج القحف والمغطي للMCA والمناطق القريبة التي تخثير كهربي. عوائق في إشراك المناطق القشرية ومعظمهم من مخططي أحيانا اعتمادا على موقع الانسداد. الآن هذه التقنية راسخة واستخدامها في العديد من المختبرات 8-13. وقد أدى استخدامها في وقت مبكر من هذه التقنية لتعريف ووصف "الأساسية احتشاء" و "شبه الظل" 14-16 ، وغالبا ما يستخدم لتقييم المركبات المحتملة اعصاب 10 ، 12 ، 13 ، 17. على الرغم من إجراء الدراسات الأولية على الفئران ، وقد استخدمت بنجاح ربط دائم MCA في الفئران مع تعديلات طفيفة 18-20.
هذا النموذج غلة عوائق استنساخه وزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد. حوالي 80 ٪ من الجلطات يحدث في البشر في منطقة MCA 21 وبالتالي هذا هو نموذج مهم جدا للدراسات السكتة الدماغية. حاليا ، هناك قلة من العلاجات الفعالة المتاحة لمرضى السكتة الدماغية ، وبالتالي هناك حاجة لنماذج جيدة لاختبار المركبات الدوائية المحتملة وتقييم النتائج الفسيولوجية. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا الأسلوب لدراسة الخلايا آليات الاستجابة نقص الأكسجين في الجسم الحي.
هنا ، فإننا نقدم لجراحة ربط MCA في ماوس C57/BL6. وصفنا إعداد ما قبل الجراحة ، جراحة ربط MCA و2،3،5 Triphenyltetrazolium كلوريد (TTC) لتلطيخ الكمي لحجم احتشاء.
Protocol
وتمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل لجنة جامعة روتشستر المكرسة لاستخدام الأخلاقية للحيوانات في مجال البحوث (UCAR). وينبغي اتباع تقنيات العقيم خلال البروتوكول. ويتطلب استخدام قفازات معقمة وقناع.
يتم وصف كل المعدات والمواد والمواد الكيميائية ، والأدوات التي يتم استخدامها أثناء البروتوكول في الجدول 1.
1. التحضير قبل الجراحة
- حقن الفئران تحت الجلد مع البوبرينورفين (0.05mg/kg) 2 ح قبل الجراحة ، وذلك مباشرة بعد الجراحة وبعد ذلك كل 3-5 ساعات خلال فترة ال 24 الأولى بعد الجراحة ح.
- تعقيم جميع الأدوات الجراحية ، والإسفنج شاش ، وتطبيقها من قبل طرف القطن الأوتوكلاف. إبقاء الأدوات الجراحية في الايثانول 70 ٪ خلال الجراحة والهواء الجاف على شاش معقم الحق قبل الاستخدام. رذاذ مجال العمل مع الايثانول 70 ٪.
- تخدير الماوس مع 3 ٪ isofluorane - 20 ٪ خليط غاز الأكسجين باستخدام المرذاذ مخدر. ضبط كمية الأوكسجين مع تدفق متر. اختبار مستوى التخدير بواسطة إصبع أو معسر الذيل (أنها ينبغي أن لا تستجيب). المحافظة على مستوى التخدير مع 2 ٪ (V / V) isofluorane.
- تطبيق الدموع الاصطناعية لعيون الماوس ، وتوخي الحذر لتجنب إتلاف العين أثناء العملية الجراحية. ضع الماوس على جانبها الصواب في موقف الأطراف.
- حلق في منطقة تقع على الجانب الأيسر بين العين اليمنى وقاعدة الأذن اليسرى باستخدام كليبرز الحيوانية. تطهير المنطقة من قبل بالتناوب بين حل betadine والايثانول 70 ٪ باستخدام تطبيقها غيض القطن وفرك طفيفة في المنطقة. كرر حسب الضرورة.
- ضع الماوس على لوحة التدفئة متصلة التحقيق المستقيم للحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية. إدراج التحقيق المستقيم باستخدام الزيوت المعدنية.
- موقف الماوس على جانبها الأيسر تحت المجهر وآمنة مع الشريط. قطع الاسفنج في إطار والشاش ، وتغطي منطقة العمليات الجراحية.
2. الجراحية الإجرائية وربط MCA
- جعل شق عمودي بين العين اليمنى وقاعدة الأذن اليسرى باستخدام مقص غرامة على التوالي. استخدام المرقأة المنحني للحفاظ على المنطقة الجراحية المفتوحة.
- إجراء شق أفقي على العضلات الزمنية باستخدام مقص الربيع وفصل قليلا من العضلات الزمنية الجمجمة عن طريق سحب ببطء مع ملقط.
- جعل حج القحف صغيرة تحت الصدغ عند تقاطع القوس الوجنية صدفي والعظام باستخدام إبرة 18G حين عقد عظم الفك مع ملقط منحنية.
- فضح MCA عن طريق إزالة قطعة صغيرة من عظم الجمجمة مع rongeurs. لا ينبغي أن القوس الوجنية ومحتويات المدارية للتلف خلال هذه العملية. إذا كان الإفراط في تجفيف الأنسجة يحدث خلال هذه العملية ، وتطبيق برنامج تلفزيوني العقيمة مع تطبيقها غيض من القطن.
- Ligate الجزء الأعلى من MCA باستخدام cauterizer سفينة صغيرة.
- مكان العضلات الزمنية مرة أخرى إلى مكانها الأصلي وإغلاق موقع شق جراحي مع خيوط النايلون 5-0.
- وقف وإزالة التخدير التحقيق المستقيم. حقن الفأر مع جرعة من 2 البوبرينورفين (0.05mg/kg) تحت الجلد. عودة الماوس إلى القفص الذي كان يحتفظ بها في 37 درجة مئوية مع لوحة التدفئة.
- ترصد عن كثب الماوس ل24 ساعة المقبلة عن أي إزعاج (قلة الشهية / استهلاك المياه ، وموقف منحنية ، والتنفس المتزايدة ، الشعرية ، التي اقيمت الشعر). حقن تحت الجلد البوبرينورفين الفأر مع كل ح 3-5 بعد الجراحة حتى 24H. تزويد الفأر مع هلام الانتعاش خلال هذه الفترة.
3. TTC تلطيخ وتحديد حجم السكتة الدماغية
- أربع وعشرين ساعة بعد الجراحة تخدير عميق الماوس ، يروي transcardially الماوس مع TTC 4 ٪ (W / V) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 15 دقيقة ثم مع حل بارافورمالدهيد 4 ٪ لمدة 10 دقيقة باستخدام مضخة صغيرة تحوي على معدل التدفق المتوسط. إزالة المخ ووضعه في حل بارافورمالدهيد 4 ٪ بين عشية وضحاها.
- موقف الدماغ إلى كتلة sectioning. شريحة الدماغ إلى شرائح سميكة 1MM باستخدام شفرات الحلاقة.
- مكان شرائح المقبل لحاكم النطاق ملليمتر. صورة شرائح باستخدام كاميرا رقمية متصلة مجهر تشريح.
- حساب مساحة السكتة الدماغية عن طريق طرح منطقة غير احتشاء للموقع المماثل من المساحة الكلية للموقع المقابل باستخدام صورة J البرمجيات (http://rsbweb.nih.gov/ij/). حساب حجم السكتة الدماغية عن طريق التراص منطقة السكتة الدماغية من شرائح 22.
4. توجيهات لاستخدام صورة برنامج J
- فتح ملف الصورة التي سيتم تحليلها في مجال البرمجيات J صورة عن طريق النقر على القائمة ملف.
- انقر على علامة التبويب "خط مستقيم" في البرنامج. رسم خط مستقيم بين الهوامش اثنين على المسطرة. انقر على القائمة "تحليل" وحدد "تعيين النطاق. تعيين المسافة المعروفة باسم 1 ، وحدة طول ملم.
- انقر فوق علامة التبويب "دائرة اليدوي. رسم الخطوط العريضة لدائرة نصف الكرة الأرضية المقابل. انقر على القائمة "تحليل" وحدد "قياس". سوف يطفو على السطح نافذة الحساب تظهر المنطقة من دائرة مرسومة.
- رسم دائرة أخرى في مختلف أنحاء الكرة الأرضية باستثناء منطقة المماثل (أبيض) السكتة الدماغية. قياس المساحة كما هو مبين في الخطوة 4.3. سيتم إضافة قيمة جديدة إلى إطار الحساب. الفرق بين 1 و 2 القيم يمثل منطقة احتشاء الذي يشار اليه على أنه ألف في الصيغة أدناه.
- حساب مساحة السكتة الدماغية في كل شريحة بتكرار الخطوات 4،2-4،4. تتخذ من منطقة الجمع السكتة الدماغية محسوب في كل شريحة (ΣA ن). وهذا يمثل حجم المخ معرفة حقيقة أن سمك كل شريحة من 1MM.
ن خ ΣA 1MM (سمك كل شريحة) = حجم السكتة الدماغية
5. ممثل النتائج :
وعوائق التي حصلت عليها MCA ربط دائم في الماوس القشرية هي في الغالب. ومع ذلك ، فمن الممكن الحصول على الآفات تحت القشرية إذا ligated في MCA الأقرب إلى فرع العدسي. قد حجم المخ بعد ربط MCA تختلف من 10MM ل 35mm ³ ³ 19 و 23. وحدات التخزين مع احتساب ضربة تلطيخ TTC في Moyanova آخرون ما بين 19 ³ ³ 22mm و 10mm إلى حين تحديد حجم المخ من صور الرنين المغناطيسي في Filiano وآخرون ما بين 23 إلى ³ ³ 20mm 35mm. السبب المحتمل لهذه الاختلافات ربما يكون الموقع الدقيق للربط والأساليب المختلفة المستخدمة لقياس حجم المخ.
في الشكل 1 ، يظهر المخ ملطخة TTC 24 ساعة ظيفة دائمة MCA في ربط ماوس البرية C57/BL6 النوع. موقع السكتة الدماغية البيضاء في المظهر (الشكل 1A ، B). الشكل 1A وباء توضيح موقع احتشاء من زوايا مختلفة. ويبين الشكل 2 شرائح سميكة من 1MM الدماغ TTC الملون من السكتة الدماغية الأمامية إلى الخلفية (الشكل 2A - G). تم حساب حجم احتشاء 24 ساعة بعد الجراحة. حجم احتشاء هو ~ ³ 23mm.
الشكل 1. تمثيل موقع السكتة الدماغية. AB ملون TTC صور الدماغ كله ، 24 ساعة بعد ربط MCA. المنطقة البيضاء يمثل احتشاء.
الشكل 2. نتائج ممثلة (A G>) ، TTC الدماغ 1MM ملطخة أقسام ، 24 ساعة بعد MCAL. يتم محاذاة شرائح من الأمامي إلى الخلفي. المنطقة البيضاء يمثل احتشاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وربط MCA دائمة الطريقة تعطي كميات احتشاء استنساخه عالية وزيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة مقارنة مع الوسائل الأخرى المتاحة. سهولة وخلال مدة قصيرة (~ 30 دقيقة) من إجراء جعلها أكثر عملية. ويستخدم على نطاق واسع في كل من الأسلوب الفئران والجرذان.
هذا الأسلوب يتطلب جراحة تحت stereomicroscope. ولذلك ، والخبرة في تشغيل تحت المجهر واتقان حج القحف الناجح هو ضروري. فمن الأفضل لوضع عوائق متسقة في المختبر قبل أن يتم إجراء التجارب. لتحقيق النتائج واستنساخه من المهم للligate MCA في الموقع نفسه بالضبط في كل مرة. وينبغي على ligated MCA الأقرب إلى العدسي فروع إذا المطلوب عوائق تحت القشرية. هو ligated كاملا وانسداد الشريان دائمة. ولهذا النموذج لا يسمح ضخه عبر MCA. وإن لم تكن مدرجة في هذه التظاهرة ، فمن الأفضل إذا تم استخدام مسبار دوبلر لقياس تدفق الدم في المنطقة المصابة للتحقق من إتمام عملية ربط الشريان.
يجب أن يكون المشغل حريصا جدا على ألا ضرر أو MCA ثقب في حين كشف والتخثر الشريان. يجب أن يتم تنفيذ حج القحف مع رعاية شاملة لمنع أي ضرر حتى العظم الوجني. لأن المنطقة الجراحي هو قريب جدا من منطقة احتشاء ، ينبغي تجنب أي ضرر على السطح القشري خلال حج القحف أو الكي. ويمكن استخدام وحدة FST cateurizer 18015-00 أو cateurizer القطبين بدلا من 18000-00 FST المستخدمة في هذه المظاهرة. FST 18015-00 يسمح للمستخدم لضبط درجة الحرارة في تلميح إلى cauterizer حرارة منخفضة التي قد تمنع أي ضرر للأنسجة القشرية. FST 18015-00 يتجنب أيضا شهدت تقلبات درجات الحرارة في البطارية تعمل أدوات الكي. أثناء الكي ، يجب على المستخدم أن تكون حذرا جدا للحفاظ على cauterizer من تدفق الأكسجين ، ويمكن أن تغلق مؤقتا باستمرار O 2 / isofluorane لتجنب خطر الاشتعال. وهذا لن يؤثر على حالة تخدير من الفأرة. لمنع هذا الخطر ، ونحن نستخدم أنبوب تهوية ممتدة إلى منطقة العمليات الجراحية مما يزيد من دوران الهواء بما فيه الكفاية ، وكذلك توجه إيقاف أي فائض O 2 / isofluorane في الهواء.
وربط MCA دائمة نموذج مفيد للغاية في دراسة السكتة الدماغية. يمكن استخدامها لاختبار neuroprotectants أو دراسة الآليات الجزيئية لنقص التروية في الجسم الحي على نماذج الماوس المعدلة وراثيا. فائدة واضحة لاستخدام هذا النهج في الجسم الحي هو أن هذا يسمح لدراسة إهانة الدماغية على الشبكات العصبية سليمة وردة الفعل السلوكية في مرحلة ما بعد إهانة ، بالإضافة إلى عمليات neuroinflammatory التي موجودة بعد الأضرار الدماغية. ولذلك ، فإن هذا النموذج في المخ فيفو يوفر مقاربة نقدية مكملة لفي نماذج الموقع التي يتم استخدامها لتقليد الثقافة نقص التروية في الخلية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وكانت الشركة في الأصل تقنية جراحية في مختبر الدكتور وليم هيل دال في كلية الطب في جورجيا. فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر الدكتور ديفيد ألف Rempe Prifti واندا لاستخدام الكاميرا تشريح. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة NS041744 ، NS051279 ، NS064700 F31 و30815697D AHA.
References
- Britton, M., Rafols, J., Alousi, S., Dunbar, J. C. The effects of middle cerebral artery occlusion on central nervous system apoptotic events in normal and diabetic rats. Int J Exp Diabesity Res. 4, 13-20 (2003).
- Ciceri, P., Rabuffetti, M., Monopoli, A., Nicosia, S. Production of leukotrienes in a model of focal cerebral ischaemia in the rat. Br J Pharmacol. 133, 1323-1329 (2001).
- Jin, K. Delayed transplantation of human neural precursor cells improves outcome from focal cerebral ischemia in aged rats. Aging Cell. 9, 1076-1083 (2010).
- McCaig, D. Evolution of GADD34 expression after focal cerebral ischaemia. Brain Res. 1034, 51-61 (2005).
- Shirotani, T., Shima, K., Chigasaki, H. In vivo studies of extracellular metabolites in the striatum after distal middle cerebral artery occlusion in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Stroke. 26, 878-884 (1995).
- Wu, Y. P., Tan, C. K., Ling, E. A. Expression of Fos-like immunoreactivity in the brain and spinal cord of rats following middle cerebral artery occlusion. Exp Brain Res. 115, 129-136 (1997).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
- Carswell, H. V. Genetic and gender influences on sensitivity to focal cerebral ischemia in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Hypertension. 33, 681-685 (1999).
- Mary, V., Wahl, F., Uzan, A., Stutzmann, J. M. Enoxaparin in experimental stroke: neuroprotection and therapeutic window of opportunity. Stroke. 32, 993-999 (2001).
- Menzies, S. A., Hoff, J. T., Betz, A. L. Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model. Neurosurgery. 31, 100-107 (1992).
- Iaci, J. F. Glial growth factor 2 promotes functional recovery with treatment initiated up to 7 days after permanent focal ischemic stroke. Neuropharmacology. 59, 640-649 (2010).
- Richard, M. J. P., Khan, B. V. C. B. J., Saleh, T. M. Cellular mechanisms by which lipoic acid confers protection during the early stages of cerebral ischemia: A possible role for calcium. Neuroscience Research. , (2011).
- Heiss, W. D. Progressive derangement of periinfarct viable tissue in ischemic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 193-203 (1992).
- Nedergaard, M., Gjedde, A., Diemer, N. H. Focal ischemia of the rat brain: autoradiographic determination of cerebral glucose utilization, glucose content, and blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 414-424 (1986).
- Nowicki, J. P., Assumel-Lurdin, C., Duverger, D., MacKenzie, E. T. Temporal evolution of regional energy metabolism following focal cerebral ischemia in the rat. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 462-473 (1988).
- Butcher, S. P., Bullock, R., Graham, D. I., McCulloch, J. Correlation between amino acid release and neuropathologic outcome in rat brain following middle cerebral artery occlusion. Stroke. 21, 1727-1733 (1990).
- Arlicot, N. Detection and quantification of remote microglial activation in rodent models of focal ischaemia using the TSPO radioligand CLINDE. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, 2371-2380 (2010).
- Moyanova, S. G. Protective role for type 4 metabotropic glutamate receptors against ischemic brain damage. J Cereb Blood Flow Metab. , (2010).
- Ortolano, F. Advances in imaging of new targets for pharmacological intervention in stroke: real-time tracking of T-cells in the ischaemic brain. Br J Pharmacol. 159, 808-811 (2010).
- O'Neill, M. J., A, C. J. Rodent models of focal cerebral ischemia. Current Protocols in Neuroscience. , 9.6.1-9.6.32 (2000).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
- Filiano, A. J., Tucholski, J., Dolan, P. J., Colak, G., Johnson, G. V. Transglutaminase 2 protects against ischemic stroke. Neurobiol Dis. 39, 334-343 (2010).
