在小鼠永久性大脑中动脉结扎术中的应用

Summary

大脑中动脉（MCA）结扎是一种技术，研究在动物模型局灶性脑缺血。在此方法中，通过开颅暴露大脑中动脉和烧灼结扎。此方法提供了高度重复性的脑梗死体积和增加手术后的生存率率比现有的其他方法。

Abstract

局灶性脑缺血之间看到中风患者最常见的类型。由于临床意义出现了长时间的努力，制定合适的动物模型研究缺血期间开展的活动。这些技术包括短暂或永久的，局灶性或全球的许多不同的动物模型，使用最常见的啮齿类动物的缺血模型。

永久性MCA结扎的方法，这也是在文献中提到pMCAo，被广泛使用作为一个在^啮齿类动物中1-6局灶性脑缺血模型。这种方法最初是老鼠田村等。在1981年^7。开颅手术是在这个协议用于访问由电闭塞MCA和近端地区。梗死涉及大多是皮层和纹状体有时的地区，根据闭塞的位置。现在这项技术是建立和使用在许多实验室^8-13。早期使用这种技术的定义和描述的“梗塞核心”和“半影^{”14日至16}日，它往往是用来评估潜在的神经保护作用^{的化合物10，12，13，} 17。虽然最初的研究是在大鼠进行的，永久的马华结扎已成功地^使用在18-20稍作修改的小鼠。

这种模式产生重现梗死和增加后的存活率。在人类缺血性中风的约80％发生在MCA ^面积 21，因此这是一个中风的研究非常相关的模型。目前，中风患者提供有效的治疗方法缺乏，因此需要有一个很好的模式，来测试潜在的药理的化合物和评估生理成果。这种方法也可以用于研究体内细胞缺氧反应机制。

在这里，我们目前在C57/BL6鼠标MCA结扎手术。我们描述的术前准备，马华结扎手术和2,3,5 - 三苯基氯化四氮唑（TTC）染色脑梗死体积的定量。

Protocol

该协议被批准用于对动物研究的伦理（UCAR）的大学罗切斯特委员会。在协议应遵循无菌技术。无菌手套和口罩的使用是必需的。

表1描述了所有的设备，材料，化学品，并在协议使用工具。

1。手术前准备

1. 注入小鼠皮下丁丙诺啡（0.05mg/kg），术前2小时后，立即手术，然后在第一个24小时后手术期每​​3-5 h。
2. 高压灭菌器消毒所有的手术器械，纱布海绵，棉花尖端涂药。在手术期间和无菌纱布上空气干燥之前使用的手术工具保持在70％的乙醇。喷雾用70％乙醇的工作区。
3. 3％isofluorane - 20％的氧气混合气体麻醉使用麻醉蒸发器的鼠标。调整流量计的氧气量。测试脚趾或尾巴捏（他们应该反应迟钝）的麻醉水平。维持麻醉用2％（V / V）isofluorane的水平。
4. 应用人工泪液鼠标的眼睛和使用注意事项，以避免损坏的眼睛在手术过程中。在外侧的位置，放置在其右侧的鼠标。
5. 剃须面积之间的左眼和使用动物快船队的左耳朵基地的左侧。优碘溶液和70％的乙醇使用棉花尖端涂药，轻轻揉面积之间交替清洗的区域。必要时重复。
6. 放在鼠标连接到直肠探头体温保持在37 ° C的加热垫使用矿物油插入直肠探头。
7. 鼠标和定位在其右侧，在显微镜下，用胶带固定。剪下一个窗口，并在纱布覆盖手术区。

2。手术程序和马华结扎

1. 使左眼和左耳使用细直剪基地之间的垂直切口。用弯止血，保持手术区开放。
2. 使用弹簧剪刀，一个横向切口的颞肌，颞肌稍分开，从头骨与钳慢慢拉。
3. 使用18G针，弯钳颌骨，在颧弓和鳞骨交界的一个小颞下开颅手术。
4. 去除骨rongeurs小块头骨暴露马华。颧弓及眶内容不应该在这个过程中损坏。如果过度干燥的组织在此过程中发生的，适用于无菌PBS棉花尖端涂药。
5. 通过使用一个小型船只cauterizer结扎MCA的远端部分。
6. 将颞肌返回到其原来的位置，并关闭切口部位，手术5-0尼龙缝线。
7. 停止麻醉和删除直肠探头。与第二剂量丁丙诺啡（0.05mg/kg）皮下注入鼠标。返回鼠标保持在37 ° C加热板与笼。
8. 密切监察任何不适（食欲减退/水的消耗，弯腰驼背的姿势，呼吸增加，pilo竖立的头发）在接下来的24 h鼠标。鼠标注入丁丙诺啡皮下注射，每3-5小时后，手术到24h。在此期间，提供回收凝胶的鼠标。

3。 TTC染色和搏出量的测定

1. 深受二十四小时后，手术麻醉鼠标，transcardially灌注4％TTC（W / V）在磷酸盐缓冲液（PBS）为15分钟和一个10分钟的4％多聚甲醛溶液，然后通过使用鼠标中等流量的微型蠕动泵。取出大脑和过夜的4％多聚甲醛溶液放入。
2. 大脑切片块的位置。使用刀片的大脑切成1mm厚的片。
3. 将切片旁边一毫米的刻度标尺。通过使用数码相机连接到解剖显微镜的拍摄片。
4. 中风面积计算，减去非梗死区的总面积从对侧网站使用Image J软件（http://rsbweb.nih.gov/ij/）同侧网站。堆叠中风片²²面积计算每搏输出量。

4。指示使用Image J软件

1. 打开图像文件，通过点击“文件”菜单中的Image J软件分析。
2. “直线”选项卡上单击程序。绘制一个标尺上的两个利润率之间的直线。点击“分析”菜单并选择“设置规模”。设置为1的已知距离，单位为毫米的长度。
3. 点击“写意圈”的标签上。画一个圆圈勾勒出对侧半球。点击“分析”菜单，选择“测量”。显示绘制的圆的面积计算窗口会弹出。
4. 同侧半球，但不包括中风（白）区域周围绘制另一个圆形。测量步骤4.3中所示的区域。新的值将被添加到计算窗口。第一和第二值之间的差异，这是作为在下面的公式表示梗死面积。
5. 中风在每片面积计算重复步骤4.2-4.4。以每片_（ΣAN）计算中风面积的总和。这代表每搏输出量，知道的事实，每个切片厚度为1mm。
   _ΣAñ x 1毫米（每片厚度）=每搏输出量

5。代表性的成果：

获得永久马华结扎鼠标梗死大多皮质。但是，它有可能获得皮层下病灶，如果在MCA的豆纹分支近端结扎。马华结扎后的中风量可能会有所不同，从10mm ³到35 ^{毫米³ 19，} 23。中风卷Moyanova等染色与TTC计算¹⁹¹⁰毫米³到22毫米立方米之间，而中风的^容量从23到35mm ³之间20毫米³ Filiano等MRI图像确定。这些差异可能是结扎的确切位置和使用不同的方法来衡量中风卷的可能原因。

在图1中，一个TTC染色脑24小时后永久马华在野生型C57/BL6鼠标结扎。中风的网站是在外观上（图1A，B）的白色。图1A和B，说明从不同的角度梗死的网站。图2显示了1mm厚的TTC染色前中风脑片后（图2A - G）。 24小时手术后梗死体积计算。梗死体积〜23毫米³。

图1。中风的网站。AB公司表示 ，TTC染色马华结扎后，24小时全脑图像。白色区域代表梗塞。

图2。代表性的成果 （A> G），TTC染色1毫米脑切片，24 h后MCAL。由前至后的切片对齐。白色区域代表梗塞。

Discussion

永久性MCA结扎方法给予高度重复性的脑梗死体积和增加手术后的生存率率比现有的其他方法。程序的难易程度和持续时间短（约30分钟），使其更加实用。该方法被广泛用于在小鼠和大鼠。

这种方法需要一个立体显微镜下微创手术。因此，在显微镜下操作和完善一个成功的开颅手术的经验是必不可少的。最好是建立在实验室进行实验前，一致梗死。为了实现可重复性的结果是很重要结扎在马华每次相同的确切位置。马华应结扎近端豆​​纹皮质下梗死所需的分行。是完全结扎动脉闭塞是永久性的。因此，这种模式不允许再灌注通过MCA。虽然不包括在此演示，它是最好的，如果使用多普勒探头是测量血流量，以验证在受影响地区完成结扎动脉。

经营者应非常小心，不要损坏或穿刺马华，同时揭露和混凝动脉。开颅手术应具有广泛的服务，以防止任何损害颧骨。由于手术区是非常接近的梗塞面积，皮质表面造成任何损害，应避免在开颅手术或烧灼。福斯特18015-00 cateurizer单位或双极cateurizer可以使用，而不是在此演示中使用的福斯特18000-00。福斯特18015-00允许用户调整温度的cauterizer尖端发热量低，可能会阻止任何损伤皮层组织。福斯特18015-00也避免看到在电池供电烧灼工具的温度波动。在烧灼，用户应非常小心地保持氧流量的cauterizer，可以暂时关闭的O ₂ / isofluorane点火，以避免风险。这不会影响鼠标的麻醉状态。为了防止这种风险，我们使用一个通风管道延伸到手术区，从而增加足够的空气流通，以及提请关闭任何多余_的氧/空气isofluorane 。

永久性MCA结扎模型研究缺血性中风是非常有用的。它可用于测试神经保护剂或缺血的分子机制研究转基因小鼠模型体内。 在体内的方法使用明显的好处是，这允许缺血完整的神经网络研究和行为反应后的侮辱，除了是目前缺血性脑损伤后neuroinflammatory过程。因此，这提供了在体内中风模型的一个重要的补充办法原位模型，用来模拟在细胞培养缺血。