L'application de la ligature permanente artère cérébrale moyenne chez la souris

Summary

L'artère cérébrale moyenne (MCA) ligature est une technique pour étudier l'ischémie cérébrale focale chez des modèles animaux. Dans cette méthode, l'artère cérébrale moyenne est exposée par craniotomie et ligaturée par cautérisation. Cette méthode donne les volumes d'infarctus hautement reproductible et une augmentation des taux de survie post-opératoires par rapport aux autres méthodes disponibles.

Abstract

Ischémie cérébrale focale est parmi les plus fréquentes d'accident vasculaire cérébral chez les patients. En raison de la signification clinique, il ya eu un effort prolongé pour développer des modèles animaux appropriés pour étudier les événements qui se déroulent pendant l'insulte ischémique. Ces techniques comprennent transitoire ou permanent, des modèles d'ischémie focale ou globale à l'aide de nombreux modèles animaux différents, avec les rongeurs les plus communs étant.

La méthode la ligature permanente MCA qui est également désigné comme pMCAo dans la littérature est largement utilisé comme un modèle d'ischémie focale chez les rongeurs ^1-6. Cette méthode a été initialement décrit pour le rat par Tamura et al. en 1981 ^7. Dans ce protocole une craniotomie a été utilisé pour accéder à la MCA et les régions proximales ont été occultées par électrocoagulation. L'infarctus impliquer les régions essentiellement corticale et parfois striés selon l'emplacement de l'occlusion. Cette technique est maintenant bien établi et utilisé dans de nombreux laboratoires ^8-13. L'utilisation précoce de cette technique ont conduit à la définition et la description du «noyau d'infarctus» et «pénombre» ^14-16, et il est souvent utilisé pour évaluer le potentiel des composés neuroprotecteurs ^{10, 12, 13, 17.} Bien que les études initiales ont été effectuées chez le rat, la ligature permanente MCA a été utilisé avec succès chez la souris avec de légères modifications ^18-20.

Ce modèle donne des infarctus reproductibles et augmenté les taux de survie après. Environ 80% des AVC ischémiques chez l'homme se produisent dans la région de MCA ²¹ et donc c'est un modèle très pertinent pour les études de course. Actuellement, il ya un manque de traitements efficaces disponibles pour les patients d'AVC, et il existe donc un besoin de bons modèles pour tester le potentiel des composés pharmacologiques et évaluer les résultats physiologiques. Cette méthode peut également être utilisé pour étudier les mécanismes intracellulaires de réponse hypoxie in vivo.

Ici, nous présentons la ligature MCA dans une souris C57/BL6. Nous décrivons la préparation pré-chirurgicale, la ligature MCA et 2,3,5 chlorure de triphényltétrazolium (TTC) coloration pour la quantification des volumes d'infarctus.

Protocol

Ce protocole a été approuvé par l'Université de Rochester comité consacré à l'utilisation éthique des animaux en recherche (UCAR). Techniques d'asepsie doivent être suivies pendant le protocole. L'utilisation de gants stériles et un masque est nécessaire.

Tous les équipements, matériaux, produits chimiques, et des outils qui sont utilisés au cours du protocole sont décrits dans le tableau 1.

1. Préparation préopératoire

1. Injecter des souris par voie sous cutanée à la buprénorphine (0.05mg/kg) 2 h avant la chirurgie, immédiatement après la chirurgie, puis toutes les 3-5 h pendant les 24 premières heures post-opératoire.
2. Stériliser tous les instruments chirurgicaux, compresses de gaze, et applicateurs coton-tige par autoclave. Garder les outils chirurgicaux dans l'éthanol à 70% pendant la chirurgie et l'air sec sur la gaze stérile juste avant utilisation. Vaporiser la zone de travail avec de l'éthanol à 70%.
3. Anesthésier la souris avec un 3% isofluorane-20% mélange gazeux d'oxygène en utilisant un vaporisateur anesthésique. Ajustez la quantité d'oxygène avec débitmètre. Testez le niveau de l'anesthésie par orteil ou le pincement de la queue (ils doivent être insensible). Maintenir le niveau de l'anesthésie avec 2% (v / v) isofluorane.
4. Appliquer des larmes artificielles pour les yeux de la souris et faire preuve de prudence pour éviter d'endommager l'œil pendant l'intervention chirurgicale. Placez la souris sur son côté droit en position latérale.
5. Rasez la zone sur le côté gauche, entre l'œil gauche et la base de l'oreille gauche en utilisant la tondeuse pour animaux. Nettoyer la zone en alternant entre une solution bétadine et 70% d'éthanol à l'aide des applicateurs coton-tige et les frottant légèrement la région. Répéter au besoin.
6. Placez la souris sur un coussin chauffant relié à une sonde rectale pour maintenir la température du corps à 37 ° C. Insérer la sonde rectale en utilisant une huile minérale.
7. Placez la souris sur son côté droit sous le microscope et sécurisé avec du ruban adhésif. Couper une fenêtre dans une compresse de gaze et de couvrir la zone chirurgicale.

2. Intervention chirurgicale et ligature MCA

1. Faire une incision verticale entre l'œil gauche et la base de l'oreille gauche en utilisant beaux ciseaux droits. Utilisez hémostatiques courbes pour garder la zone chirurgicale ouverte.
2. Faire une incision horizontale sur le muscle temporal en utilisant des ciseaux à ressort et légèrement séparée du muscle temporal du crâne par tirant lentement avec une pince.
3. Faites une petite craniotomie subtemporal à la jonction de l'arcade zygomatique et l'os squamosal en utilisant une aiguille 18G tout en tenant la mâchoire avec une pince courbe.
4. Exposer le MCA en enlevant les petits morceaux de crâne avec Os Rongeurs. L'arcade zygomatique et contenu orbitaire ne doit pas être endommagé pendant ce processus. Si une déshydratation excessive du tissu se produit pendant ce processus, appliquer PBS stérile avec des applicateurs de coton-tige.
5. Ligaturer la partie distale du MCA en utilisant un petit navire cauterizer.
6. Placez le muscle temporal dans sa position originale et fermer le site d'incision chirurgicale avec sutures 5-0 en nylon.
7. Cesser d'anesthésie et de retirer la sonde rectale. Injecter de la souris avec une 2e dose de buprénorphine (0.05mg/kg) sous-cutanée. Retour de la souris dans la cage qui a été maintenue à 37 ° C avec un panneau de chauffage.
8. Surveiller de près la souris pour les prochaines 24 h pour tout inconfort (diminution de l'appétit / consommation d'eau, une posture voûtée, augmentation de la respiration, pilo-érigé cheveux). Injecter de la souris avec la buprénorphine par voie sous cutanée toutes les deux heures 3-5 post-opératoire jusqu'à 24h. Fournir la souris avec gel de récupération durant cette période.

3. Coloration TTC et détermination du volume d'éjection

1. Vingt-quatre heures après la chirurgie profondément anesthésier la souris, transcardiaque perfuser la souris avec un 4% TTC (p / v) en tampon phosphate salin (PBS) pendant 15 min, puis avec une solution de paraformaldéhyde 4% pendant 10 min en utilisant un mini pompe péristaltique à un débit moyen. Enlever le cerveau et le placer dans la solution de paraformaldéhyde à 4% pendant une nuit.
2. Position du cerveau dans le bloc de coupe. Trancher le cerveau en tranches de 1mm d'épaisseur en utilisant des lames de rasoir.
3. Placer les tranches à côté d'une règle-échelle millimétrique. Photographier les tranches en utilisant un appareil photo numérique connecté à la loupe binoculaire.
4. Calculer la zone de course en soustrayant le secteur non-infarctus du site ipsilatérale de la superficie totale du site en utilisant l'image controlatérale J Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Calculer le volume d'éjection systolique par l'empilement de la zone de l'accident vasculaire cérébral ²² tranches.

4. Itinéraire d'utiliser un logiciel Image J

1. Ouvrez le fichier image à analyser dans le logiciel Image J en cliquant sur le menu Fichier.
2. Cliquez sur l'onglet «ligne droite» dans le programme. Tracez une ligne droite entre les deux marges sur la règle. Cliquez sur "analyser" le menu et sélectionner 'échelle définie. Réglez la distance connue comme une unité de longueur en mm.
3. Cliquez sur l'onglet «cercle à main levée». Tracez un cercle de décrire l'hémisphère controlatéral. Cliquez sur "analyser" et sélectionnez le menu «mesure». La fenêtre de calcul apparaît montrant la zone du cercle tracé.
4. Dessinez un autre cercle autour de l'hémisphère exclusion AVC ipsilatéral (blanc) région. Mesurer la surface, comme indiqué dans l'étape 4.3. La nouvelle valeur sera ajoutée à la fenêtre de calcul. La différence entre la 1ère et 2ème valeurs représente la zone de l'infarctus qui est indiqué comme A de la formule ci-dessous.
5. Calculer la zone de course dans chaque tranche en répétant les étapes 4.2 à 4.4. Prenez sommation de la zone de course calculé dans chaque tranche (Ea _n). Cela représente le volume d'éjection sachant le fait que l'épaisseur de chaque tranche est de 1mm.
   Ea _n x 1mm (épaisseur de chaque tranche) = volume des maladies

5. Les résultats représentatifs:

L'infarctus obtenus par ligature permanente MCA chez la souris sont principalement corticale. Cependant, il est possible d'obtenir des lésions sous-corticales si le MCA est ligaturé en amont de la branche lenticulostriées. Les volumes AVC après ligature MCA pourrait varier d'un 10mm à 35mm ³ ³ ^{19, 23.} Les volumes course calculé par coloration TTC en Moyanova et al. ¹⁹ sont entre ³ 10mm à 22mm ³ tandis que les volumes course déterminée à partir d'images IRM dans Filiano et al ²³ sont entre ³ 20mm à 35mm ³. Les raisons possibles de ces différences peut-être l'emplacement exact de la ligature et les différentes méthodes utilisées pour mesurer les volumes d'AVC.

Dans la figure 1, un teint TTC cérébrales 24 heures après la ligature permanente MCA dans un type C57/BL6 souris sauvage est montré. Le site AVC est blanche en apparence (Fig. 1A, B). Figure 1A et B illustrent le site d'infarctus sous différents angles. La figure 2 montre les tranches de 1mm d'épaisseur de la TTC vasculaires cérébraux teinté d'avant en arrière (Fig. 2A-G). Volume de l'infarctus a été calculée 24 h après la chirurgie. Le volume de l'infarctus est ³ ~ 23mm.

Figure 1. Représentation du site d'AVC. AB, TTC teinté images du cerveau entier, 24 heures après la ligature du MCA. Zone blanche représente l'infarctus.

Figure 2. Les résultats représentatifs. (A à G>), TTC sections colorées du cerveau 1mm, 24 h après MCAL. Les tranches sont alignés d'avant en arrière. Zone blanche représente l'infarctus.

Discussion

La méthode la ligature permanente MCA donne volumes d'infarctus hautement reproductible et une augmentation des taux de survie post-opératoires par rapport aux autres méthodes disponibles. La facilité et la courte durée (~ 30 min) de la procédure de la rendre encore plus pratique. La méthode est largement utilisée dans les souris et les rats.

Cette technique nécessite une chirurgie invasive sous un stéréomicroscope. Par conséquent, expérience dans l'exploitation sous un microscope et de perfectionner une craniotomie réussie est essentielle. Il est préférable d'établir un infarctus cohérente dans le laboratoire avant les expériences sont effectuées. Pour obtenir des résultats reproductibles, il est important de ligaturer le MCA au même endroit exacte à chaque fois. Le MCA doit être ligaturé proximal lenticulostriées branches si infarctus sous-corticaux sont souhaitées. L'artère est complètement liée et l'occlusion est permanente. Donc ce modèle ne permet pas de reperfusion via le MCA. Bien que n'étant pas inclus dans cette démonstration, il est préférable si une sonde Doppler est utilisé pour mesurer le flux sanguin dans la zone touchée afin de vérifier la ligature complète de l'artère.

L'opérateur doit être très prudent pour ne pas endommager ou percer MCA tout en exposant et en coagulant l'artère. Craniotomie doit être effectuée avec soin vaste pour éviter tout dommage à l'os zygomatique. Parce que la zone chirurgicale est très proche de la zone d'infarctus, tout dommage causé à la surface corticale doit être évitée pendant une craniotomie ou cautérisation. Unité de TSF cateurizer 18015-00 ou un cateurizer bipolaire peut être utilisé au lieu du 18000-00 TSF utilisé dans cette démonstration. TSF 18015-00 permet à l'utilisateur d'ajuster la température de la pointe cauterizer à feu doux qui peut empêcher tout dommage au tissu cortical. TSF 18015-00 évite également les fluctuations de température vu dans la batterie d'outils cautérisation exploité. Pendant la cautérisation, l'utilisateur doit être très prudent pour garder le cauterizer hors du flux d'oxygène et peut momentanément arrêter le O ₂ / isofluorane pour éviter tout risque d'inflammation. Ceci n'affectera pas l'état d'anesthésie de la souris. Pour prévenir ce risque, nous utilisons un tuyau de ventilation étendue à la zone chirurgicale qui augmente la circulation d'air suffisante, ainsi que tire tout excès d'O ₂ / isofluorane dans l'air.

Le modèle ligature permanente MCA est extrêmement utile dans l'étude de l'AVC ischémique. Il peut être utilisé pour tester neuroprotecteurs ou l'étude des mécanismes moléculaires de l'ischémie in vivo sur des modèles de souris transgéniques. L'avantage évident d'utiliser cette approche in vivo, c'est que cela permet l'étude de l'accident ischémique sur les réseaux neuronaux et intacte la réponse comportementale de post-insulte, en plus des processus neuro-inflammatoires qui sont présents après les lésions ischémiques. Par conséquent, cette course dans le modèle in vivo constitue une approche complémentaire aux critiques dans les modèles in situ qui sont utilisés pour imiter l'ischémie en culture cellulaire.