היישום של קשירת העורקים התיכון הקבע מוחין העכבר

Summary

התיכון קשירת מוחין (MCA) עורק היא טכניקה כדי ללמוד איסכמיה מוחית מוקד במודלים של בעלי חיים. בשיטה זו, עורק המוח האמצעי הוא נחשף על ידי craniotomy ו ligated על ידי צריבה. שיטה זו נותנת כרכים האוטם לשעתקו מאוד והגדילה שלאחר הניתוח שיעורי ההישרדות בהשוואה לשיטות אחרות שקיימות.

Abstract

איסכמיה מוחית מיקוד היא בין הסוג הנפוץ ביותר של שבץ לראות חולים. בשל המשמעות הקלינית חלה מאמץ ממושך כדי לפתח מודלים של בעלי חיים מתאים ללמוד את האירועים המתרחשים במהלך עלבון איסכמי. טכניקות אלו כוללות זמני או קבוע, מודלים איסכמיה או מוקד עולמי באמצעות רבות במודלים של בעלי חיים שונים, עם מכרסמים להיות הנפוצים ביותר.

השיטה קשירת קבע MCA אשר נקראת גם בספרות pMCAo נעשה שימוש נרחב כמודל איסכמיה מוקד במכרסמים ^1-6. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Tamura ואח' לחולדות. בשנת 1981 ^7. בפרוטוקול זה craniotomy שימש לגשת MCA ואת האזורים הפרוקסימלי היו occluded ידי electrocoagulation. אוטמים לערב אזורים בקליפת המוח בעיקר striatal לפעמים בהתאם למיקום של חסימה. טכניקה זו היא כיום מבוססת היטב בשימוש במעבדות רבות ^8-13. בתחילת השימוש בטכניקה זו הביא להגדרת ותיאור של "הליבה האוטם" ו "הילה" ^14-16, והוא משמש לעתים קרובות כדי להעריך את הפוטנציאל תרכובות neuroprotective ^{10, 12, 13, 17.} למרות מחקרים ראשוניים שבוצעו בחולדות, קבע קשירת MCA שימש בהצלחה בעכברים עם שינויים קלים ^18-20.

מודל זה התשואות אוטמים לשחזור והגדילה שלאחר שיעורי ההישרדות. כ -80% של שבץ איסכמי בבני אדם לקרות באזור MCA ²¹ ולכן זהו מודל רלוונטי מאוד ללימודי שבץ. נכון לעכשיו, יש מחסור של טיפולים יעילים לרשות חולי שבץ, ולכן יש צורך במודלים טובה לבדוק תרכובות פרמקולוגיות הפוטנציאל ולהעריך תוצאות פיזיולוגיות. שיטה זו יכולה לשמש גם למטרות לימוד מנגנונים תאיים בתגובה היפוקסיה in vivo.

כאן, אנו מציגים את ניתוח קשירת MCA בעכבר C57/BL6. אנו מתארים את הכנה טרום ניתוחית, ניתוח קשירת MCA ו 2,3,5 כלוריד Triphenyltetrazolium (TTC) מכתים עבור כימות כרכים האוטם.

Protocol

פרוטוקול זה אושר על ידי אוניברסיטת רוצ'סטר הוועדה מוקדש להשתמש האתי של בעלי חיים במחקר (UCAR). טכניקות אספטי צריך להיות מלווה במהלך הפרוטוקול. השימוש כפפות סטריליות ומסכת נדרשת.

כל הציוד, החומרים, כימיקלים, כלים המשמשים במהלך פרוטוקול מתוארים בטבלה 1.

1. טרום ניתוחית הכנה

1. הזרק עכברים תת עורי עם עצירות (0.05mg/kg) 2 שעות לפני הניתוח, מיד לאחר הניתוח ולאחר מכן כל 3-5 שעות במשך התקופה הראשונה שלאחר הניתוח 24 שעות.
2. לעקר את כל מכשירי הניתוח, ספוגים גזה, ועל קצה applicators כותנה ידי החיטוי. שמור כלים כירורגיים באתנול 70% במהלך הניתוח ואוויר יבש על גזה סטרילית מיד לפני השימוש. תרסיס את אזור העבודה עם אתנול 70%.
3. להרדים את העכבר עם תערובת 3% isofluorane-20% גז חמצן באמצעות מאדה הרדמה. התאם את כמות חמצן עם מד זרימה. בדוק את רמת ההרדמה על ידי הבוהן או צובט את הזנב (הם צריכים להיות לא מגיב). לשמור על רמת הרדמה עם 2% (v / v) isofluorane.
4. החל דמעות מלאכותיות לעיניים של העכבר לנקוט זהירות כדי למנוע פגיעה בעין במהלך ההליך הכירורגי. הנח את העכבר על הצד הימני שלה במצב לרוחב.
5. לגלח את האזור בצד שמאל בין העין השמאלית ובסיס האוזן השמאלית באמצעות קוצץ בעלי חיים. לנקות את האזור על ידי לסירוגין בין פתרון בבטאדין ואתנול 70% באמצעות קצה כותנה applicators קלות לשפשף את האזור. חזור על פי הצורך.
6. מניחים את העכבר על כרית חימום המחובר בדיקה רקטלית כדי לשמור על טמפרטורת הגוף על 37 ° C. הכנס את בדיקה רקטלית באמצעות שמן מינרלי.
7. מקם את העכבר על הצד הימני שלה מתחת למיקרוסקופ ובטוחה עם הקלטת. גזור חלון ספוג גזה ומכסים שטח כירורגית.

2. הליך כירורגי MCA קשירת

1. ביצוע חתך אנכי בין בעין שמאל הבסיס של האוזן השמאלית באמצעות מספריים ישר בסדר. השתמש hemostats מעוקל כדי לשמור על שטח פתוח כירורגית.
2. ביצוע חתך אופקי על השריר הזמני באמצעות מספריים באביב קצת להפריד את השריר הזמני מהגולגולת על ידי משיכת לאט עם מלקחיים.
3. הפוך craniotomy subtemporal קטן בצומת של קשת הזיגומטית ועצם squamosal באמצעות מחט 18G בעוד מחזיק את עצם הלסת עם מלקחיים מעוקל.
4. לחשוף את MCA ידי הסרת חתיכות קטנות של גולגולת עם rongeurs העצם. הקשת הזיגומטית ותכנים מסלולית לא צריך להיפגע במהלך תהליך זה. אם ייבוש יתר של רקמת מתרחשת במהלך תהליך זה, יחולו PBS סטרילי עם applicators קצה כותנה.
5. ולקשור את החלק הדיסטלי של MCA באמצעות cauterizer כלי שיט קטנים.
6. מניחים את השריר הזמני בחזרה למקומו המקורי ולסגור את האתר עם חתך 5-0 תפרים כירורגיים ניילון.
7. הפסק הרדמה ולהסיר את בדיקה רקטלית. הזרק את העכבר עם מינון של 2 עצירות (0.05mg/kg) תת עורית. החזר את העכבר לכלוב שבו הוחזק על 37 מעלות צלזיוס עם פאנל חימום.
8. לעקוב מקרוב אחר העכבר עבור שעות 24 הבא עבור כל אי נוחות (ירידה בתיאבון / צריכת המים, יציבה כפופה, נשימה מוגברת, pilo-שהוקמו שיער). הזרק את העכבר עם עצירות תת עורי כל 3-5 שעות לאחר הניתוח עד 24 שעות. ספק את עכבר עם ג'ל התאוששות בתקופה זו.

3. TTC מכתים וקביעת נפח הפעימה

1. עשרים וארבע שעות לאחר הניתוח עמוק להרדים את העכבר, transcardially perfuse את העכבר עם TTC 4% (w / v) ב פוספט בופר סליין (PBS) במשך 15 דקות ולאחר מכן עם פתרון paraformaldehyde 4% במשך 10 דקות באמצעות מיני peristaltic המשאבה בקצב זרימת בינוני. הסר את המוח ואת המקום אותו הפתרון paraformaldehyde 4% בין לילה.
2. מקם את המוח לבלוק חתך. פורסים את המוח לפרוסות בעובי 1 מ"מ באמצעות סכיני גילוח.
3. מניחים את פרוסות לצד השליט סולם מילימטר. צילום הפרוסות באמצעות מצלמה דיגיטלית מחובר מיקרוסקופ הניתוחים.
4. חישוב שטח שבץ על ידי הפחתת שטח שאינו infarcted האתר ipsilateral מאזור הכולל של האתר הנגדי באמצעות תמונה J תוכנה (http://rsbweb.nih.gov/ij/). חשב את נפח הפעימה ידי הערמה אזור שבץ של ²² פרוסות.

4. כיווני להשתמש J תוכנה תמונה

1. פתח את קובץ התמונה להיות מנותח בתוכנה J תמונה על ידי לחיצה על תפריט קובץ.
2. לחץ על הכרטיסייה "הקו הישר" בתוכנית. לצייר קו ישר בין שתי השוליים בסרגל. לחץ על תפריט "לנתח" ובחר 'סולם מוגדר ". הגדר את המרחק המכונה 1, יחידת אורך כפי מ"מ.
3. לחץ על הכרטיסייה 'מעגל חופשי ". צייר עיגול מתאר את הכדור הנגדי. לחץ על תפריט "לנתח" ובחר "למדוד". חלון חישוב יצוץ מראה את שטח המעגל נמשך.
4. צייר עוד עיגול סביב אזור ipsilateral למעט בחצי הכדור (לבן) שבץ. מדוד את האזור כפי שצוין צעד 4.3. הערך החדש יתווסף חלון החישוב. ההבדל בין 1 ו 2 ערכים מייצג את אזור האוטם אשר כפי שצוין בנוסחה הבאה.
5. חישוב שטח לשבץ כל פרוסה על ידי חזרה על שלבים 4.2-4.4. קח סיכום של האזור שבץ מחושב כל פרוסה (ΣA _n). זה מייצג את נפח הפעימה לדעת את העובדה עובי כל פרוסה הוא 1mm.
   ΣA _n x 1 מ"מ (עובי כל פרוסה) = נפח הפעימה

5. נציג תוצאות:

אוטמים מתקבל על ידי קשירת MCA קבע העכבר נמצאים בעיקר בקליפת המוח. עם זאת, ניתן לקבל נגעים קורטיקליים אם MCA הוא ligated הפרוקסימלי לסניף lenticulostriate. הכרכים שבץ לאחר MCA קשירת עשוי להשתנות ³ 10mm ל 35mm ³ ^{19, 23.} הכרכים שבץ מחושב עם מכתים TTC ב Moyanova et al. הם בין ¹⁹ ל ³ ³ 10mm 22mm בעוד כרכים שבץ נקבע מתמונות MRI ב Filiano ואח' ²³ הם בין 20 מ"מ ל ³ ³ 35mm. סיבה אפשרית ההבדלים הללו אולי את המיקום המדויק של קשירת ואת שיטות שונות למדידת נפח שבץ.

באיור 1, מוח מוכתם TTC 24 שעות שלאחר קשירת קבע MCA ב עכבר הבר סוג C57/BL6 מוצג. האתר שבץ הוא לבן במראה (איור 1 א ', ב). איור 1 א 'וב' להמחיש את האתר האוטם מזוויות שונות. איור 2 מראה פרוסות בעובי 1 מ"מ של המוח TTC מוכתם שבץ מן הקדמי אל האחורי (איור 2A-G). נפח האוטם היה מחושב 24 שעות לאחר הניתוח. היקף האוטם הוא ~ ³ 23mm.

באיור 1. ייצוג של האתר שבץ. AB, מוכתם TTC תמונות המוח כולו, 24 שעות לאחר קשירת MCA. השטח הלבן מייצג את האוטם.

איור 2. נציג תוצאות. (> G), TTC סעיפים מוכתם 1mm המוח, 24 שעות לאחר MCAL. Slices מיושרים מן הקדמי אל האחורי. השטח הלבן מייצג את האוטם.

Discussion

שיטת קשירת קבע MCA נותן כרכים האוטם לשעתקו מאוד מוגברת שלאחר הניתוח שיעורי ההישרדות בהשוואה לשיטות אחרות שקיימות. הקלות ומשך קצר (~ 30 דקות) של הפרוצדורה לעשות את זה אפילו יותר מעשי. השיטה היא בשימוש נרחב גם עכברים וחולדות.

טכניקה זו דורשת ניתוח פולשני תחת stereomicroscope. לכן, ניסיון בהפעלת תחת מיקרוסקופ ושכלול craniotomy מוצלחת היא חיונית. עדיף להקים אוטמים עקבי במעבדה לפני ניסויים מתבצעים. כדי להשיג תוצאות לשחזור חשוב ולקשור MCA על המיקום המדויק אותו בכל פעם. MCA צריך להיות ligated בקרבה lenticulostriate סניפים אם אוטמים קורטיקליים הם הרצויה. עורק הוא ligated מלא חסימה הוא קבע. לכן מודל זה אינו מאפשר reperfusion דרך MCA. למרות שלא נכללו הפגנה זו, עדיף אם בדיקה דופלר משמש למדידת זרימת הדם באזור הפגוע כדי לוודא קשירת מלאה של העורק.

המפעיל צריך להיות מאוד זהירים לא לפגוע או לנקב MCA תוך חשיפת ונקרש העורק. Craniotomy צריך להתבצע בזהירות נרחב כדי למנוע נזק לעצם הזיגומטית. מכיוון אזור כירורגית קרוב מאוד לאזור האוטם, נזק על פני השטח של קליפת המוח יש להימנע במהלך craniotomy או צריבה. FST 18015-00 יחידת cateurizer או cateurizer דו קוטבית יכול לשמש במקום 18000-00 FST להשתמש בהפגנה זו. FST 18015-00 מאפשרת למשתמש להתאים את הטמפרטורה של קצה cauterizer לחום נמוך אשר עשוי למנוע נזק לרקמות קליפת המוח. FST 18015-00 גם ימנע את תנודות הטמפרטורה לראות סוללה כלי צריבה פעלה. במהלך צריבה, המשתמש צריך להיות זהיר מאוד כדי לשמור על cauterizer מתוך זרימת חמצן יכול לרגע לסגור את O ₂ / isofluorane כדי למנוע סיכון של הצתה. זה לא ישפיע על מצב ההרדמה של העכבר. כדי למנוע סיכון זה, אנו משתמשים צינור אוורור להרחיב את אזור הניתוח אשר מגביר את זרימת אוויר מספקת, כמו גם שואבת את כל עודף O ₂ / isofluorane באוויר.

המודל קשירת קבע MCA שימושי מאוד בלימוד שבץ איסכמי. זה יכול לשמש כדי לבדוק neuroprotectants או ללמוד המנגנונים המולקולריים של איסכמיה in vivo על מודלים עכבר מהונדס. היתרון הברור של שימוש בגישה vivo היא כי זה מאפשר ללמוד את העלבון איסכמי על רשתות נוירונים שלמים התגובה ההתנהגותית שלאחר להעליב, בנוסף לתהליכים neuroinflammatory שנמצאים לאחר נזק איסכמי. לכן, במודל שבץ vivo מספק גישה משלים חיוני במודלים באתרו המשמשים לחקות איסכמיה בתרבות התא.