Summary
मध्य मस्तिष्क धमनी ligation (एमसीए) के लिए पशु मॉडल में फोकल मस्तिष्क ischemia अध्ययन के लिए एक तकनीक है. इस विधि में, मध्य मस्तिष्क धमनी craniotomy से अवगत कराया है और दाग़ना द्वारा ligated. इस विधि में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रोधगलितांश मात्रा और वृद्धि की पोस्ट ऑपरेटिव अस्तित्व अन्य तरीके उपलब्ध की तुलना में दरों देता है.
Protocol
इस प्रोटोकॉल रोचेस्टर समिति विश्वविद्यालय के अनुसंधान में पशुओं के नैतिक उपयोग (UCAR) के लिए समर्पित द्वारा अनुमोदित किया गया था. सड़न रोकनेवाला तकनीक प्रोटोकॉल के दौरान पालन किया जाना चाहिए. बाँझ दस्ताने और एक मुखौटा का उपयोग आवश्यक है.
सभी उपकरण, सामग्री, रसायन, और उपकरण है कि प्रोटोकॉल के दौरान इस्तेमाल कर रहे हैं तालिका 1 में वर्णित हैं.
1. पूर्व शल्य चिकित्सा तैयारी
- चूहों subcutaneously buprenorphine (0.05mg/kg) सर्जरी से पहले 2 घंटे के साथ सर्जरी के तुरंत बाद और फिर पहले 24 घंटे की अवधि पोस्ट ऑपरेटिव के दौरान हर 3-5 घंटे, इंजेक्षन.
- आटोक्लेव द्वारा सभी सर्जिकल उपकरणों, धुंध स्पंज, और कपास टिप applicators जीवाणुरहित. सर्जरी और हवा का उपयोग करने से पहले सही बाँझ धुंध पर सूखे के दौरान 70% इथेनॉल में शल्य चिकित्सा उपकरण रखें. 70% इथेनॉल के साथ काम के क्षेत्र में स्प्रे.
- एक 3% isofluorane 20% ऑक्सीजन गैस मिश्रण के साथ एक संवेदनाहारी vaporizer का उपयोग करके माउस anesthetize. प्रवाह मीटर के साथ ऑक्सीजन राशि समायोजित करें. पैर की अंगुली या पूंछ बन्द रखो (वे अनुत्तरदायी होना चाहिए) द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का परीक्षण करें. 2% (v / v) isofluorane के साथ संज्ञाहरण के स्तर बनाए रखें.
- माउस आँखें कृत्रिम आँसू लागू करें और सावधानी का उपयोग करने के लिए शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान आंख हानिकारक से बचने के के लिए. एक पार्श्व स्थिति में अपनी सही पक्ष पर माउस रखें.
- बाईं आंख और बाएँ कान जानवर क़ैंची का उपयोग कर के आधार के बीच बाईं तरफ क्षेत्र दाढ़ी. एक betadine समाधान और 70% कपास टिप applicators और हल्के क्षेत्र मलाई का उपयोग इथेनॉल के बीच alternating द्वारा क्षेत्र शुद्ध. आवश्यक के रूप में दोहराएँ.
- एक हीटिंग एक गुदा जांच से जुड़े 37 में शरीर का तापमान बनाए रखने के पैड डिग्री सेल्सियस पर माउस रखें खनिज तेल का उपयोग करके गुदा जांच डालें.
- खुर्दबीन के नीचे सही पक्ष पर माउस स्थिति और टेप के साथ सुरक्षित. एक धुंध स्पंज में एक खिड़की कट और शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को कवर.
2. सर्जिकल प्रक्रिया तथा एमसीए Ligation
- बाईं आंख और ठीक सीधे कैंची का उपयोग करके बाएं कान के आधार के बीच एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाओ. घुमावदार hemostats का उपयोग करने के लिए शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को खुला रखने के लिए.
- वसंत कैंची का उपयोग करके अस्थायी पेशी पर एक क्षैतिज चीरा और थोड़ा खोपड़ी से धीरे धीरे संदंश के साथ खींच द्वारा टेम्पोरल मांसपेशियों को अलग.
- Zygomatic चाप और squamosal हड्डी के जंक्शन पर एक 18G सुई का उपयोग जबकि घुमावदार संदंश के साथ जबड़े की हड्डी पकड़े द्वारा एक छोटे subtemporal craniotomy बनाओ.
- अस्थि rongeurs के साथ खोपड़ी के छोटे टुकड़े को हटाने के द्वारा एमसीए बेनकाब. zygomatic चाप और कक्षीय सामग्री इस प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त नहीं किया जा चाहिए. यदि ऊतक के अत्यधिक सुखाने इस प्रक्रिया के दौरान होता है, कपास टिप applicators के साथ बाँझ पीबीएस लागू होते हैं.
- एमसीए के एक छोटे पोत cauterizer का उपयोग करके बाहर का भाग Ligate.
- टेम्पोरल मांसपेशियों को वापस अपनी मूल स्थिति में प्लेस और चीरा साइट शल्य 5-0 नायलॉन sutures के साथ बंद.
- संज्ञाहरण बंद और गुदा जांच निकालने के. Subcutaneously buprenorphine (0.05mg/kg) के 2 खुराक के साथ माउस इंजेक्षन. पिंजरे जो 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा था एक हीटिंग पैनल के साथ करने के लिए माउस लौटें.
- बारीकी से किसी भी असुविधा (कमी आई खपत / भूख पानी, hunched आसन, श्वसन वृद्धि हुई है, बाल pilo खड़ा) के लिए अगले 24 घंटे के लिए माउस की निगरानी. 24 घंटों के लिए buprenorphine subcutaneously हर 3-5 घंटे के बाद सर्जरी के साथ माउस इंजेक्षन. वसूली जेल के साथ इस अवधि के दौरान माउस प्रदान करें.
3. टीटीसी धुंधला और स्ट्रोक वॉल्यूम का निर्धारण
- सर्जरी के बाद चौबीस घंटे गहरा माउस anesthetize, transcardially फॉस्फेट में 4% (w / v) 15 और फिर 10 मिनट के लिए एक 4% paraformaldehyde समाधान के साथ मिनट के लिए एक का उपयोग करके टीटीसी खारा (पीबीएस) buffered के साथ माउस perfuse मिनी मध्यम प्रवाह दर पर क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप. मस्तिष्क निकालें और यह रातोरात 4% paraformaldehyde समाधान में जगह.
- सेक्शनिंग ब्लॉक में मस्तिष्क स्थिति. 1mm मोटी स्लाइसें में रेज़र ब्लेड का उपयोग करके मस्तिष्क स्लाइस.
- एक मिलीमीटर पैमाने पर शासक के लिए अगले स्लाइस रखें. विदारक माइक्रोस्कोप से जुड़े एक डिजिटल कैमरे का उपयोग कर तस्वीर स्लाइस.
- Contralateral साइट का उपयोग कर छवि जम्मू सॉफ्टवेयर (http://rsbweb.nih.gov/ij/) के कुल क्षेत्रफल से ipsilateral साइट के गैर infarcted क्षेत्र subtracting द्वारा स्ट्रोक क्षेत्र की गणना. 22 स्लाइस की स्ट्रोक क्षेत्र stacking द्वारा स्ट्रोक की मात्रा की गणना.
4. दिशा छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए
- छवि फ़ाइल खोलें छवि जम्मू सॉफ्टवेयर में फ़ाइल मेनू पर क्लिक करके विश्लेषण किया.
- कार्यक्रम में 'सीधी रेखा' टैब पर क्लिक करें. शासक पर दो हाशिये के बीच एक सीधी रेखा आरेखित. 'विश्लेषण' मेनू पर क्लिक करें और सेट पैमाने पर 'का चयन करें. 1 के रूप में जाना जाता दूरी मिमी के रूप में लंबाई की इकाई का सेट.
- 'मुक्तहस्त चक्र' टैब पर क्लिक करें. Contralateral गोलार्द्ध रूपरेखा सर्कल ड्रा. 'विश्लेषण' मेनू पर क्लिक करें और 'उपाय' का चयन करें. गणना विंडो पॉप अप तैयार सर्कल के क्षेत्र दिखा होगा.
- Ipsilateral गोलार्द्ध छोड़कर स्ट्रोक क्षेत्र (सफेद) के चारों ओर एक चक्र ड्रा. उपाय के रूप में 4.3 चरण में संकेत क्षेत्र. नए मूल्य गणना विंडो में जोड़ा जाएगा. 1 और 2 मूल्यों के बीच अंतर रोधगलितांश जो नीचे दिए गए सूत्र में एक के रूप में संकेत दिया है के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है.
- 4.2-4.4 कदम दोहरा द्वारा प्रत्येक टुकड़ा में स्ट्रोक क्षेत्र की गणना. स्ट्रोक प्रत्येक टुकड़ा (ΣA एन) में गणना क्षेत्र के संकलन ले लो . यह स्ट्रोक मात्रा जानने के तथ्य यह है कि प्रत्येक टुकड़ा की मोटाई 1mm है का प्रतिनिधित्व करता है.
ΣA n (x प्रत्येक टुकड़ा की मोटाई) = स्ट्रोक मात्रा 1mm
5. प्रतिनिधि परिणाम:
माउस में स्थायी एमसीए ligation द्वारा प्राप्त दौरे ज्यादातर cortical हैं. हालांकि, यह संभव है subcortical घावों प्राप्त अगर एमसीए lenticulostriate शाखा प्रॉक्सिमल ligated है. एमसीए ligation के बाद स्ट्रोक मात्रा 10mm ³ से 35 मिमी 19 ³, 23 भिन्न हो सकता है . स्ट्रोक Moyanova एट अल में टीटीसी धुंधला के साथ गणना की मात्रा 19. करने के लिए 10mm 22mm ³ ³ बीच हैं जबकि स्ट्रोक मात्रा Filiano एट अल में एमआरआई छवियों के लिए 20mm 35 मिमी ³ ³ के बीच 23 से निर्धारित है. इन शायद ligation की सटीक स्थान और अलग स्ट्रोक मात्रा को मापने के तरीकों का इस्तेमाल किया मतभेद के लिए संभावित कारण.
चित्रा 1 में एक दाग टीटीसी मस्तिष्क एक जंगली प्रकार माउस C57/BL6 में 24 घंटा पोस्ट स्थायी एमसीए ligation दिखाया गया है. स्ट्रोक साइट उपस्थिति (छवि 1 ए, बी) में सफेद है. चित्रा 1 ए और बी विभिन्न कोणों से रोधगलितांश साइट वर्णन. चित्रा 2 1mm मोटी स्लाइसें टीटीसी दाग स्ट्रोक मस्तिष्क को पूर्वकाल से पता चलता है पश्च (छवि 2A जी). Infarct मात्रा के बाद सर्जरी में 24 घंटे की गणना की गई. रोधगलितांश की मात्रा ~ 23mm ³ है.
चित्रा 1. स्ट्रोक साइट अटल बिहारी प्रतिनिधित्व, टीटीसी एमसीए ligation के बाद पूरे मस्तिष्क छवियों, 24 घंटे दाग . व्हाइट क्षेत्र रोधगलितांश का प्रतिनिधित्व करता है.
चित्रा 2. प्रतिनिधि परिणाम (ए जी>), टीटीसी दाग 1mm मस्तिष्क वर्गों, MCAL के बाद 24 घंटे. स्लाइसें पीछे पूर्वकाल से जुड़ रहे हैं. व्हाइट क्षेत्र रोधगलितांश का प्रतिनिधित्व करता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
स्थायी एमसीए ligation विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रोधगलितांश मात्रा और वृद्धि की पोस्ट ऑपरेटिव अस्तित्व अन्य तरीके उपलब्ध की तुलना में दरों देता है. और प्रक्रिया के लघु अवधि (~ 30 मिनट) आसानी यह भी अधिक व्यावहारिक बनाते हैं. विधि व्यापक रूप से दोनों चूहों और चूहों में प्रयोग किया जाता है.
यह तकनीक एक stereomicroscope तहत एक इनवेसिव सर्जरी की आवश्यकता है. इसलिए, एक खुर्दबीन के तहत काम करने और एक सफल craniotomy समाप्ति में अनुभव आवश्यक है. यह सबसे अच्छा है के लिए प्रयोगशाला में लगातार दौरे स्थापित करने से पहले के प्रयोगों का प्रदर्शन कर रहे हैं. यह प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है एक ही सटीक स्थान पर एमसीए हर समय ligate. एमसीए शाखाओं lenticulostriate अगर subcortical दौरे वांछित हैं प्रॉक्सिमल ligated होना चाहिए. धमनी और पूरी तरह से ligated रोड़ा स्थायी है. इसलिए इस मॉडल एमसीए के माध्यम से reperfusion की अनुमति नहीं है. हालांकि इस प्रदर्शन में शामिल नहीं है, यह सबसे अच्छा है अगर एक डॉपलर जांच प्रभावित क्षेत्र में रक्त के प्रवाह को मापने के लिए धमनी की पूरी ligation सत्यापित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
ऑपरेटर बहुत क्षति या पंचर एमसीए के लिए नहीं सावधान हो सकता है, जबकि उजागर और धमनी coagulating चाहिए. Zygomatic हड्डी के लिए किसी भी क्षति को रोकने के Craniotomy व्यापक देखभाल के साथ किया जाना चाहिए. क्योंकि शल्य चिकित्सा क्षेत्र बहुत रोधगलितांश क्षेत्र करीब है, cortical सतह के लिए किसी भी क्षति craniotomy या दाग़ना के दौरान से बचा जाना चाहिए. FST 18015-00 cateurizer इकाई या एक द्विध्रुवी cateurizer FST 18000-00 इस प्रदर्शन में प्रयोग किया जाता के बजाय प्रयोग किया जा सकता है. FST 18015-00 उपयोगकर्ता जो cortical ऊतकों को किसी भी नुकसान को रोकने सकता है कम गर्मी के लिए cauterizer टिप के तापमान को समायोजित करने के लिए अनुमति देता है. FST 18015-00 भी तापमान बैटरी संचालित दाग़ना उपकरण में देखा उतार - चढ़ाव से बचा जाता है. दाग़ना के दौरान, उपयोगकर्ता बहुत सावधान रहना करने के लिए ऑक्सीजन का प्रवाह के cauterizer बाहर रखने चाहिए और क्षण भर के नीचे 2 हे / isofluorane प्रज्वलन के जोखिम से बचने के बंद कर सकते हैं. यह माउस के संज्ञाहरण राज्य को प्रभावित नहीं करेगा. इस जोखिम को रोकने के लिए, हम एक वेंटिलेशन पाइप शल्य चिकित्सा क्षेत्र जो हवा परिसंचरण पर्याप्त बढ़ जाती है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में किसी भी अतिरिक्त हे 2 / हवा में isofluorane ड्रॉ के लिए बढ़ाया का उपयोग करें.
स्थायी एमसीए ligation मॉडल ischemic स्ट्रोक का अध्ययन करने में अत्यंत उपयोगी है. यह neuroprotectants परीक्षण या ट्रांसजेनिक माउस मॉडल पर vivo में ischemia के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. vivo दृष्टिकोण में इस का उपयोग करने के लिए स्पष्ट लाभ यह है कि इस बरकरार neuronal नेटवर्क पर इस्कीमिक अपमान और व्यवहार के अध्ययन के बाद अपमान प्रतिक्रिया neuroinflammatory प्रक्रियाओं है कि ischemic क्षति के बाद मौजूद हैं के अलावा, के लिए अनुमति देता है. इसलिए, इस vivo स्ट्रोक मॉडल में सीटू मॉडल है कि सेल संस्कृति में ischemia नकल के लिए उपयोग किया जाता है में एक महत्वपूर्ण पूरक दृष्टिकोण प्रदान करता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
सर्जिकल तकनीक मूल रूप से जॉर्जिया के मेडिकल कॉलेज में डॉ. विलियम डी. हिल की प्रयोगशाला में अधिग्रहण कर लिया था. लेखकों को भी विच्छेदन कैमरे के उपयोग के लिए डॉ. डेविड ए Rempe और Landa Prifti धन्यवाद देना चाहूंगा. इस शोध NIH NS041744, NS051279, NS064700 F31 और अहा 30815697D द्वारा समर्थित किया गया था.
References
- Britton, M., Rafols, J., Alousi, S., Dunbar, J. C. The effects of middle cerebral artery occlusion on central nervous system apoptotic events in normal and diabetic rats. Int J Exp Diabesity Res. 4, 13-20 (2003).
- Ciceri, P., Rabuffetti, M., Monopoli, A., Nicosia, S. Production of leukotrienes in a model of focal cerebral ischaemia in the rat. Br J Pharmacol. 133, 1323-1329 (2001).
- Jin, K. Delayed transplantation of human neural precursor cells improves outcome from focal cerebral ischemia in aged rats. Aging Cell. 9, 1076-1083 (2010).
- McCaig, D. Evolution of GADD34 expression after focal cerebral ischaemia. Brain Res. 1034, 51-61 (2005).
- Shirotani, T., Shima, K., Chigasaki, H. In vivo studies of extracellular metabolites in the striatum after distal middle cerebral artery occlusion in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Stroke. 26, 878-884 (1995).
- Wu, Y. P., Tan, C. K., Ling, E. A. Expression of Fos-like immunoreactivity in the brain and spinal cord of rats following middle cerebral artery occlusion. Exp Brain Res. 115, 129-136 (1997).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
- Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
- Carswell, H. V. Genetic and gender influences on sensitivity to focal cerebral ischemia in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Hypertension. 33, 681-685 (1999).
- Mary, V., Wahl, F., Uzan, A., Stutzmann, J. M. Enoxaparin in experimental stroke: neuroprotection and therapeutic window of opportunity. Stroke. 32, 993-999 (2001).
- Menzies, S. A., Hoff, J. T., Betz, A. L. Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model. Neurosurgery. 31, 100-107 (1992).
- Iaci, J. F. Glial growth factor 2 promotes functional recovery with treatment initiated up to 7 days after permanent focal ischemic stroke. Neuropharmacology. 59, 640-649 (2010).
- Richard, M. J. P., Khan, B. V. C. B. J., Saleh, T. M. Cellular mechanisms by which lipoic acid confers protection during the early stages of cerebral ischemia: A possible role for calcium. Neuroscience Research. , (2011).
- Heiss, W. D. Progressive derangement of periinfarct viable tissue in ischemic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 193-203 (1992).
- Nedergaard, M., Gjedde, A., Diemer, N. H. Focal ischemia of the rat brain: autoradiographic determination of cerebral glucose utilization, glucose content, and blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 414-424 (1986).
- Nowicki, J. P., Assumel-Lurdin, C., Duverger, D., MacKenzie, E. T. Temporal evolution of regional energy metabolism following focal cerebral ischemia in the rat. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 462-473 (1988).
- Butcher, S. P., Bullock, R., Graham, D. I., McCulloch, J. Correlation between amino acid release and neuropathologic outcome in rat brain following middle cerebral artery occlusion. Stroke. 21, 1727-1733 (1990).
- Arlicot, N. Detection and quantification of remote microglial activation in rodent models of focal ischaemia using the TSPO radioligand CLINDE. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, 2371-2380 (2010).
- Moyanova, S. G. Protective role for type 4 metabotropic glutamate receptors against ischemic brain damage. J Cereb Blood Flow Metab. , (2010).
- Ortolano, F. Advances in imaging of new targets for pharmacological intervention in stroke: real-time tracking of T-cells in the ischaemic brain. Br J Pharmacol. 159, 808-811 (2010).
- O'Neill, M. J., A, C. J. Rodent models of focal cerebral ischemia. Current Protocols in Neuroscience. , 9.6.1-9.6.32 (2000).
- Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
- Filiano, A. J., Tucholski, J., Dolan, P. J., Colak, G., Johnson, G. V. Transglutaminase 2 protects against ischemic stroke. Neurobiol Dis. 39, 334-343 (2010).
