L'applicazione di permanente legatura dell'arteria cerebrale media nel mouse

Summary

Dell'arteria cerebrale media (MCA) legatura è una tecnica per lo studio ischemia cerebrale focale in modelli animali. In questo metodo, l'arteria cerebrale media è esposta da craniotomia e legato da cauterizzazione. Questo metodo dà volumi infarto altamente riproducibili e un aumento post-operatorio tassi di sopravvivenza rispetto ad altri metodi disponibili.

Abstract

Ischemia cerebrale focale è tra il tipo più comune di ictus osservato nei pazienti. A causa della rilevanza clinica c'è stato un lungo lavoro per sviluppare modelli animali adatti a studiare gli eventi che si svolgono durante l'insulto ischemico. Queste tecniche sono transitori o permanenti, i modelli di ischemia focale o globale usando molti diversi modelli animali, con i roditori più comuni sono.

Il metodo di legatura permanente MCA, che viene anche definito come pMCAo in letteratura è ampiamente utilizzato come modello di ischemia focale nei roditori ^1-6. Questo metodo è stato originariamente descritto per i ratti da Tamura et al. nel 1981 ^7. In questo protocollo una craniotomia è stato utilizzato per accedere alla MCA e le regioni prossimali sono state occluse da elettrocoagulazione. Il infarti coinvolgere soprattutto le regioni corticali e striatali volte a seconda della posizione della occlusione. Questa tecnica è ormai ben consolidata e utilizzata in molti laboratori ^8-13. L'uso precoce di questa tecnica ha portato alla definizione e descrizione del "core infarto" e "penombra" ^14-16, ed è spesso utilizzata per valutare il potenziale neuroprotettivo composti ^{10, 12, 13, 17.} Anche se gli studi iniziali sono stati condotti nel ratto, legatura permanente MCA è stato utilizzato con successo nei topi con lievi modifiche ^18-20.

Questo modello produce infarti riproducibile e un aumento post-tassi di sopravvivenza. Circa l'80% degli ictus ischemico negli esseri umani avvengono in zona MCA ²¹ e quindi questo è un modello molto importante per gli studi di ictus. Attualmente, c'è una scarsità di trattamenti efficaci a disposizione dei pazienti colpiti da ictus, e quindi c'è bisogno di buoni modelli per testare potenziali composti farmacologici e valutare i risultati fisiologici. Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare i meccanismi intracellulari di risposta all'ipossia in vivo.

Qui, vi presentiamo l'intervento legatura MCA in un mouse C57/BL6. Descriviamo la preparazione pre-chirurgica, la chirurgia legatura MCA e 2,3,5 trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione per la quantificazione dei volumi di infarto.

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dalla Università di Rochester comitato dedicato l'uso etico degli animali nella ricerca (UCAR). Tecniche asettiche da seguire durante il protocollo. L'utilizzo di guanti sterili e una maschera è necessario.

Tutte le attrezzature, materiali, prodotti chimici, e gli strumenti che vengono utilizzati durante il protocollo sono descritte nella tabella 1.

1. La preparazione pre-chirurgica

1. Iniettare topi per via sottocutanea con buprenorfina (0.05mg/kg) 2 h prima dell'intervento, subito dopo l'intervento chirurgico e poi ogni 3-5 ore durante le prime 24 ore post-operatorio.
2. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici, spugne garza, e applicatori punta del cotone in autoclave. Mantenere gli strumenti chirurgici in etanolo al 70% durante l'intervento chirurgico e aria secca a destra garza sterile prima dell'uso. Spruzzare l'area di lavoro con il 70% di etanolo.
3. Anestetizzare il mouse con un 3% isofluorane-20% miscela di ossigeno del gas utilizzando un vaporizzatore anestetico. Regolare la quantità di ossigeno con il misuratore di portata. Testare il livello di anestesia da dito o pizzicare la coda (che dovrebbero essere non risponde). Mantenere il livello di anestesia con il 2% (v / v) isofluorane.
4. Applicare lacrime artificiali per gli occhi del mouse e usare cautela per evitare di danneggiare l'occhio durante la procedura chirurgica. Posizionare il mouse sul lato destro in posizione laterale.
5. Radere l'area sul lato sinistro tra l'occhio sinistro e la base dell'orecchio sinistro con il tagliaunghie animale. Pulire l'area alternando tra una soluzione betadine e il 70% di etanolo con applicatori punta di cotone e strofinare leggermente la zona. Ripetere se necessario.
6. Posizionare il mouse su di una piastra elettrica collegato ad una sonda rettale per mantenere la temperatura corporea a 37 ° C. Inserire la sonda rettale utilizzando olio minerale.
7. Posizionare il mouse sul lato destro sotto il microscopio e fissare con nastro adesivo. Tagliare una finestra in una garza e coprire un'area chirurgica.

2. Procedura chirurgica e MCA Ligation

1. Fai una incisione verticale tra l'occhio sinistro e la base dell'orecchio sinistro utilizzando bene le forbici diritte. Usa hemostats curva per mantenere l'area chirurgica aperta.
2. Effettuare una incisione orizzontale sul muscolo temporale utilizzando le forbici a molla e un po 'separare il muscolo temporale dal cranio lentamente tirando con una pinza.
3. Fai una piccola craniotomia subtemporal all'incrocio tra zigomatica e ossa squammoso utilizzando un ago da 18G mentre si tiene la mandibola con una pinza curva.
4. Esporre il MCA rimuovendo il piccoli pezzi di cranio con Rongeurs osso. Dell'arcata zigomatica e contenuti orbitale non deve essere danneggiato durante questo processo. Se l'essiccamento eccessivo di tessuto si verifica durante questo processo, si applicano PBS sterile con applicatori punta di cotone.
5. Legare la porzione distale del MCA cauterizer utilizzando un piccolo vaso.
6. Posizionare il muscolo temporale nella sua posizione originale e chiudere il sito di incisione chirurgica con 5-0 punti di sutura in nylon.
7. Interrompere l'anestesia e rimuovere la sonda rettale. Iniettare il mouse con una dose 2 di buprenorfina (0.05mg/kg) per via sottocutanea. Ritorna il mouse per la gabbia che è stata mantenuta a 37 ° C con un pannello di riscaldamento.
8. Seguire da vicino il mouse per le prossime 24 ore per ogni disagio (riduzione dell'appetito / consumo di acqua, la postura ingobbita, aumento della respirazione, pilo-eretto capelli). Iniettare il mouse con buprenorfina per via sottocutanea ogni 3-5 ore dopo l'intervento fino a 24 ore. Fornire il mouse con gel di recupero durante questo periodo.

3. TTC colorazione e Determinazione della gittata sistolica

1. Ventiquattro ore dopo l'intervento profondamente anestetizzare il mouse, transcardially profumato il mouse con un 4% TTC (w / v) in tampone fosfato (PBS) per 15 min e poi con una soluzione di paraformaldeide al 4% per 10 minuti utilizzando un mini pompa peristaltica a portata media. Togliere il cervello e posizionarlo nella soluzione di paraformaldeide al 4% durante la notte.
2. Posizionare il cervello nel blocco di sezionamento. Tagliate a fette il cervello 1 mm di spessore utilizzando lame di rasoio.
3. Mettere le fette accanto ad un righello scala millimetrata. Fotografare le fette utilizzando una fotocamera digitale collegata al microscopio da dissezione.
4. Calcolare l'area colpo sottraendo il non-infartuato area del sito ipsilaterale dalla superficie totale del sito controlaterale utilizzando immagini J Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Calcolare la gittata sistolica sovrapponendo l'area colpo di fette di ^22.

4. Indicazioni per l'uso J software Image

1. Aprire il file immagine da analizzare in software Image J cliccando sul menu File.
2. Fare clic sulla scheda 'retta' nel programma. Tracciare una linea retta tra i due margini sul righello. Fare clic su 'analizzare' menu e seleziona 'scala set'. Impostare la distanza nota come 1, unità di lunghezza mm.
3. Fare clic sulla scheda 'cerchio a mano libera'. Disegnare un cerchio a delineare l'emisfero controlaterale. Fare clic sul menu 'analizzare' e selezionare 'misura'. La finestra di calcolo si aprirà mostra l'area del cerchio disegnato.
4. Disegnare un altro cerchio intorno alla emisfero esclusi ictus ipsilaterale (bianco) zona. Misurare l'area, come indicato al punto 4.3. Il nuovo valore verrà aggiunto alla finestra di calcolo. La differenza tra il 1 ° e 2 ° valori rappresenta l'area dell'infarto, che è indicato come nella formula sottostante.
5. Calcolare l'area corsa in ogni fetta ripetendo i passaggi 4,2-4,4. Prendere sommatoria dell'area corsa calcolato in ogni sezione (ΣA _n). Questo rappresenta gittata sistolica conoscere il fatto che lo spessore di ogni fetta è 1 mm.
   ΣA _n x 1 mm (spessore di ogni fetta) volume = Corsa

5. Rappresentante dei risultati:

Il infarti ottenuto permanente legatura MCA nel topo sono in gran parte corticale. Tuttavia, è possibile ottenere le lesioni subcorticali se l'MCA è legatura prossimale al ramo lenticulostriate. I volumi di ictus dopo MCA legatura può variare da 10 millimetri a 35 mm ³ ³ ^{19, 23.} I volumi corsa calcolata con colorazione TTC in Moyanova et al. ¹⁹ sono tra ³ ³ 10mm a 22 millimetri mentre i volumi di corsa determinata da immagini MRI a Filiano e altri ²³ sono tra ³ ³ 20mm a 35mm. Il possibile motivo di queste differenze forse la posizione esatta della legatura ed i diversi metodi utilizzati per misurare i volumi di corsa.

Nella Figura 1, un cervello colorato TTC 24 ore posto permanente legatura MCA in un tipo selvaggio C57/BL6 del mouse viene mostrato. Il sito di corsa è di colore bianco in apparenza (Fig. 1A, B). Figure 1A e B illustrano il sito dell'infarto da diverse angolazioni. La Figura 2 mostra fette 1 mm di spessore del cervello macchiato TTC corsa da anteriore a posteriore (Fig. 2A-G). Volume dell'infarto è stata calcolata 24 ore post-operatorie. Il volume dell'infarto è ³ ~ 23mm.

Figura 1. Rappresentazione del sito ictus. AB, TTC macchiato immagini del cervello intero, 24 ore dopo la legatura MCA. Area bianca rappresenta l'infarto.

Figura 2. Risultati rappresentativi. (A> G), TTC macchiato 1 millimetro cervello sezioni, 24 ore dopo Mcal. Fette sono allineate da anteriore a posteriore. Area bianca rappresenta l'infarto.

Discussion

Il metodo di legatura permanente MCA dà volumi infarto altamente riproducibili e un aumento post-operatorio tassi di sopravvivenza rispetto ad altri metodi disponibili. La facilità e la breve durata (~ 30 min) della procedura di renderlo ancora più pratico. Il metodo è ampiamente utilizzato sia in topi e ratti.

Questa tecnica richiede un intervento chirurgico invasivo sotto uno stereomicroscopio. Pertanto, l'esperienza nella gestione sotto un microscopio e perfezionare una craniotomia di successo è essenziale. E 'meglio stabilire infarti coerente in laboratorio prima di esperimenti vengono eseguiti. Per ottenere risultati riproducibili è importante legare il MCA nella stessa posizione esatta ogni volta. L'MCA dovrebbe essere legata prossimale lenticulostriate rami se infarti sottocorticali sono volute. L'arteria è completamente legata e l'occlusione è permanente. Quindi questo modello non permette di riperfusione tramite il MCA. Anche se non incluso in questa dimostrazione, è meglio se una sonda doppler viene utilizzato per misurare il flusso sanguigno nella zona interessata per verificare la completa legatura dell'arteria.

L'operatore deve essere molto attenti a non danneggiare o forare MCA, esponendo e coagulare l'arteria. Craniotomia deve essere eseguita con cura ampia per evitare danni all'osso zigomatico. Poiché l'area chirurgica è molto vicino alla zona infartuata, danni alla superficie corticale, devono essere evitati durante la craniotomia o cauterizzazione. FST 18015-00 unità cateurizer o un cateurizer bipolare può essere usato al posto del FST 18000-00 usato in questa dimostrazione. FST 18015-00 permette all'utente di regolare la temperatura della punta cauterizer a fuoco basso che possa prevenire qualsiasi danno al tessuto corticale. FST 18015-00 evita anche le fluttuazioni di temperatura della batteria visto in strumenti di cauterizzazione operato. Durante la cauterizzazione, l'utente dovrebbe essere molto attenti a mantenere il cauterizer fuori dal flusso di ossigeno e può momentaneamente chiudere la O ₂ / isofluorane per evitare il rischio di incendio. Questo non influenzerà lo stato di anestesia del mouse. Per evitare questo rischio, si usa un tubo di aerazione estesa alla zona chirurgico che aumenta la circolazione d'aria a sufficienza, così come attira il prodotto in eccesso O ₂ / isofluorane nell'aria.

Il modello di legatura permanente MCA è estremamente utile nello studio di ictus ischemico. Può essere usato per testare neuroprotectants o studio dei meccanismi molecolari di ischemia in vivo su modelli di topi transgenici. Il vantaggio evidente per l'utilizzo di questo approccio in vivo è che questo consente lo studio di insulto ischemico intatta reti neuronali e la risposta comportamentale post-insulto, oltre ai processi neuroinfiammatorie che sono presenti dopo danno ischemico. Pertanto, questo modello in corsa vivo fornisce un approccio critico complementare in situ modelli che vengono utilizzati per simulare l'ischemia in coltura cellulare.