マウスの永久中大脳動脈結紮の応用

Summary

中大脳動脈（MCA）ライゲーションは、動物モデルでの局所脳虚血を研究する技術です。この方法では、中大脳動脈は開頭術によって公開されており、焼灼によって連結した。このメソッドは、非常に再現性の梗塞量と利用可能な他の方法に比べて増加した術後の生存率を与える。

Abstract

局所脳虚血は、患者に見られる脳卒中の最も一般的なタイプのひとつです。臨床的意義による虚血性傷害の間に展開するイベントを研究するために適切な動物モデルを開発するための長期の努力がなされている。これらの技術は、最も一般的なげっ歯類で、多くの異なる動物モデルを用いて一時的または永続的な、局所またはグローバル虚血モデルが含まれています。

また、文献で​​pMCAoと呼ばれる永久的なMCAのライゲーション法は、げっ歯類^1-6の局所的虚血モデルとして広く使用されています。このメソッドは当​​初、田村らによりラットに記述されていた。 1981年^7インチこのプロトコルでは開頭はMCAにアクセスするために使用され、近位領域は、電気凝固法によって閉塞させた。梗塞は閉塞の位置に応じて、主に皮質と時々線条体領域を含む。この手法は、今や十分に確立し、多くの研究室^8-13に使用されています。この技術の早期使用は、"梗塞コア"と"半影^"14から16の定義と記述につながった、とそれはしばしば潜在的な神経保護化合物^{10、12、13、17を}評価するために使用されます。初期の研究はラットで行われたが、恒久的なMCAの結紮は、若干の修正^18から20を有するマウスで正常に使用されています。

このモデルは、再現性梗塞と増加後の生存率が得られます。ヒトの虚血性脳卒中の約80％は、MCA領域²¹で発生するので、これは、脳卒中の研究のために非常に関連したモデルです。現在、脳卒中患者が利用できる効果的な治療の不足があるため、潜在的な薬理学的化合物をテストし、生理学的アウトカムを評価する良いモデルが必要である。このメソッドは、 生体内でも細胞内の低酸素応答のメカニズムを研究するために使用することができます。

ここで、我々は、C57/BL6マウスにおけるMCAの結紮術を紹介。我々は術前準備、MCAの結紮術および梗塞体積の定量化のための2,3,5塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）染色を説明します。

Protocol

このプロトコルは、研究における動物の倫理的な使用（UCAR）に捧げられたロチェスター委員会の大学により承認された。無菌技術は、プロトコル中に従うべきである。滅菌手袋とマスクを使用する必要があります。

すべての機器、材料、化学物質、およびプロトコル中に使用されるツールは、表1で説明されています。

1。術前準備

1. 最初の24時間、術後の期間中のすべての3から5時間後、手術直後、手術前にブプレノルフィン（0.05mg/kg）2時間で皮下マウスを注入して。
2. オートクレーブですべての手術器具、ガーゼスポンジ、そして綿の先端のアプリケーターを滅菌する。使用前に滅菌ガーゼの右上に手術して空気乾燥時に70％エタノールで手術器具を保管してください。 70％エタノールで作業領域を吹き付けます。
3. 麻酔気化器を使用して3％イソフルラン- 20％の酸素ガスの混合物で、マウスを麻酔。流量計で酸素の量を調整します。つま先や尾のピンチ（彼らが応答しなくなるはず）で麻酔のレベルをテストします。 2％（v / v）をイソフルランで麻酔のレベルを維持する。
4. マウスの目に人工涙液を適用し、手術中に目を損傷しないように注意してください。側臥位で、その右側にマウスを置きます。
5. 左眼と動物のバリカンを使用して、左耳の付け根の間の左側の領域を剃る。 betadine液と70％エタノール綿の先端のアプリケーターを使用し、軽く面積をこすりで交互にエリアを清め。必要に応じて繰り返します。
6. 37℃で体温を維持するために直腸プローブに接続された加熱パッド℃の上にマウスを置きますミネラルオイルを使用して直腸プローブを挿入します。
7. 顕微鏡下で、その右側にマウスを置き、テープで固定します。ガーゼのスポンジでウィンドウを切り取り、外科領域をカバー。

2。外科手術とMCAライゲーション

1. 左眼と素晴らしいストレートハサミを使用して、左耳の付け根の間に縦切開を加えます。外科領域を開いておくための湾曲した止血を使用してください。
2. 春のはさみを使って、側頭筋上に水平方向の切開を行い、少しゆっくりと鉗子で引っ張って頭蓋骨から側頭筋を分離。
3. 湾曲鉗子で顎骨を保持しながら18G針を用いて頬骨弓と側頭鱗骨の接合部に小さな側頭下開頭術を行います。
4. 骨Rongeursと頭蓋骨の小さ​​な断片を除去することによりMCAを公開。頬骨弓と眼窩内容は、このプロセス中に破損してはならない。組織の過度の乾燥は、このプロセス中に発生した場合は、綿の先端のアプリケーターで滅菌PBSを適用します。
5. 小血管cauterizerを使用してMCAの遠位部分をライゲーションする。
6. 元の位置に戻して側頭筋を置き、外科5から0ナイロン縫合糸で切開部位を閉じる。
7. 麻酔を中止し、直腸プローブを削除します。皮下ブプレノルフィン（0.05mg/kg）の2番目の用量でマウスに注入する。加熱パネルで37℃に保温したケージにマウスを返します。
8. 密接に不快感（食欲減退/水消費量、猫背の姿勢、増加した呼吸、髪をピーロは、建てられた）のための次の24時間マウスを監視する。最高24時間までブプレノルフィン皮下すべての3から5時間後に手術とマウスを注入する。この期間中に回復ゲルでマウスを提供しています。

3。 TTC染色と一回拍出量の測定

1. 手術24時間後には、深く、マウスを麻酔transcardially 15分間、その後10分間、4％パラホルムアルデヒド溶液で使用することによりリン酸塩のTTC（w / v）の緩衝生理食塩水4％（PBS）でマウスを灌流培地流量でミニ蠕動ポンプ。脳を取り出して、一晩4％パラホルムアルデヒド溶液に入れてください。
2. セクショニングのブロックに脳を置きます。かみそりの刃を使用して1mm厚のスライスに脳をスライスして。
3. ミリメートル規模の定規の横のスライスを置きます。解剖顕微鏡に接続したデジタルカメラを使用してスライスを撮影する。
4. 画像Jソフトウェア（http://rsbweb.nih.gov/ij/）を使用して対側のサイトの総面積から同側のサイトの非梗塞領域を差し引くことにより、ストロークの領域を計算します。スライス²²のストロークの領域を積み重ねることによって一回拍出量を計算します。

4。画像Jソフトウェアを使用する方向

1. ファイルメニューをクリックして画像Jソフトウェアで分析する画像ファイルを開きます。
2. プログラムで"直線"タブをクリックします。ルーラー上の2つのマージンの間に直線を描画します。 "分析"メニューをクリックし、"セットの規模"を選択します。 1と既知の距離、mmの長さの単位を設定します。
3. "フリーハンドサークル"タブをクリックします。対側半球の輪郭を円を描く。 "分析"メニューをクリックし、"尺度"を選択します。計算画面では、描画した円の面積を示すポップアップ表示されます。
4. 同側半球を除くストローク（白）周辺に別の円を描きます。として、ステップ4.3で示された領域を測定します。新しい値が計算ウィンドウに追加されます。 1番目と2番目の値の差は、以下の数式と同様に示される梗塞の領域を表します。
5. ステップ4.2から4.4までを繰り返すことによって、各スライスのストロークの領域を計算します。各スライス_（ΣAn）で計算されたストローク領域の総和を取る。これは、各スライスの厚さは1mmであるという事実を知って一回拍出量を表しています。
   _ΣAn個の x 1mmの（各スライスの厚さ）=ストローク量

5。代表的な結果：

マウスで恒久的なMCAの結紮によって得られた梗塞は主に皮質です。しかし、MCAは、レンズ核線条体枝の近位に連結している場合皮質下病変を得ることができる。 MCA結紮後のストローク量が10mm ³から35mm ³ ^19、23に変わる可能性があります。 MoyanovaらのTTC染色で計算されたストロークボリューム。Filianoら²³のMRI画像から決定ストローク量が35mm ³に20ミリメートル³の間にある間^、19は 22ミリメートル³に10ミリメートル³の間です。多分ライゲーションの正確な位置やストローク量を測定するために使用される様々な方法でこれらの違いの可能な理由。

図1では、野生型C57/BL6マウスにおけるTTC染色した脳の24時間後に永久的なMCAの結紮が表示されます。脳卒中サイトは外観（図1A、B）に白です。図1AおよびBには、さまざまな角度から梗塞部位を示しています。図2は、後に前方からTTC染色した脳卒中脳の1mm厚のスライス（図2A - G）を示しています。梗塞体積は、24時間後に手術を算出した。梗塞の体積は、〜23ミリメートル³です。

図1。脳卒中サイトの表現。AB、TTC ​​は、MCAの結紮後の全脳の画像、24時間を染色した。白い部分は梗塞を表します。

図2。代表的な結果。（> G）、TTC染色した1mmの脳切片、MCAL 24時間後。スライスは、後に前から整列されます。白い部分は梗塞を表します。

Discussion

永久的なMCAのライゲーション法は再現性の高い梗塞量と利用可能な他の方法に比べて増加した術後の生存率を与える。手続きの容易さと、短い期間（〜30分）は、さらに実践的なもの。法が広く、マウスとラットの両方で使用されています。

この手法は、実体顕微鏡下低侵襲手術が必要になります。そのため、顕微鏡下で動作し、成功した開頭術を完璧に経験が不可欠です。実験が行われる前に、ラボで一貫性の梗塞を確立することをお勧めします。再現性のある結果を達成することは、まったく同じ場所でそれぞれの時間をMCAを連結することが重要です。 MCAは、皮質下梗塞を望む場合に枝をレンズ核線条体に近位連結する必要があります。動脈が完全に連結し、閉塞は永続的です。したがって、このモデルでは、MCAを経由して再灌流を許可しません。このデモに含まれていないが、ドップラープローブは、動脈の完全結紮を確認するために患部の血流を測定するために使用されている場合、それが最善です。

動脈を露出し、凝固しながらオペレータができない損傷やパンクMCAに細心の注意を払う必要があります。開頭術は頬骨の損傷を防ぐために大規模な注意を払って行ってください。外科領域では梗塞領域に非常に近いため、皮質表面への損傷は、開頭術または焼灼中は避けるべきである。 FST 18015から00 cateurizerユニットまたはバイポーラcateurizerは、このデモで使用されているFST 18000から00の代わりに使用することができます。 FST 18015〜00は、ユーザーが皮質組織への損傷を防ぐ可能性が低く、熱にcauterizerチップの温度を調整することができます。 FST 18015〜00はまた、バッ​​テリー駆動焼灼ツールに見られる温度の変動を回避することができます。焼灼中に、ユーザーは、酸素の流れからcauterizerを保つために細心の注意を払う必要がありますし、瞬間的に発火の危険性を避けるために、O ₂ /イソフルランをシャットダウンすることができます。これはマウスの麻酔状態には影響しません。このリスクを防ぐために、我々は、十分に空気循環を増加させるだけでなく、空気中に余分なO ₂ /イソフルランをオフ描画外科領域に拡張換気パイプを使用してください。

永久的なMCAの結紮モデルでは、虚血性脳卒中の研究において非常に有用です。それはneuroprotectantsをテストするか、またはトランスジェニックマウスモデルでin vivoで虚血の分子メカニズムを研究するために使用することができます。 in vivoでのアプローチでこれを使用するための明白な利点は、これが虚血性損傷後に存在しているneuroinflammatoryプロセスに加えて、無傷の神経回路網上で虚血性傷害の研究および行動反応後の侮辱、できることです。したがって、これはin vivoでの脳卒中のモデルで細胞培養での虚血を模倣するために使用されているその場のモデルにするための重要な補完的なアプローチを提供します。