Summary
중간 대뇌 동맥 (MCA) 내고 동물 모델에 초점 대뇌 국소 빈혈을 연구하는 기술입니다. 이 방법에서는, 중간 대뇌 동맥 craniotomy에 의해 노출 소작된에 의해 출혈도 잡았. 이 방법은 높은 재현성 경색 볼륨과 사용 가능한 다른 방법에 비해 증가 이후 수술 생존 속도를 제공합니다.
Abstract
초점 대뇌 국소 빈혈 환자에서 볼 뇌졸중의 가장 일반적인 유형 중 하나입니다. 때문에 임상 중요성에 허혈성 모욕하는 동안 펼쳐 이벤트를 연구하기 위해 적절한 동물 모델을 개발하기 위해 장기간 노력하고있다. 이러한 기법은 가장 일반되는 설치류와 다양한 동물 모델을 사용하여 과도하거나 영구적인 초점 또는 글로벌 국소 빈혈 모델을 포함합니다.
또한 문학 pMCAo로 불리는 영구 MCA의 결합 방법은 설치류 1-6에 초점 국소 빈혈 모델로 광범위하게 사용됩니다. 이 방법은 원래 타무라 외 의해 쥐에 대해 설명했다. 1981 7인치 이 프로토콜에서는 craniotomy은 MCA와 근위 지역이 electrocoagulation에 의해 occluded되었습니다 액세스하는 데 사용되었다. infarcts는 폐색의 위치에 따라 대부분 피질과 때로는 striatal 지역을 포함하고 있습니다. 이 기술은 이제 잘 설립하여 많은 실험실 8-13에서 사용됩니다. 이 기술의 조기 사용 "경색 코어"와 "penumbra"14-16의 정의 및 설명을 주도하고, 그것은 종종 잠재 neuroprotective 화합물 10, 12, 13, 17을 평가하는 데 사용됩니다. 초기 연구는 쥐에서 수행 되었으나, 영구 MCA의 결합은 약간의 수정을 18-20로 생쥐에서 성공적으로 사용되었습니다.
이 모델은 재현성 infarcts 증가 후 생존 속도를 산출. 인간의 허혈성 뇌졸중의 약 80 %가 MCA 지역 21 일이되므로이 뇌졸중 연구의 관련성이 매우 모델입니다. 현재 뇌졸중 환자에 사용할 효과적인 치료법의 소수가, 따라서 잠재적인 약리 화합물을 테스트하고 생리적 결과를 평가하는 좋은 모델 필요가있다. 이 방법은 생체내 세포에서 hypoxia 응답 메커니즘을 연구하고 사용할 수 있습니다.
여기, 우리는 C57/BL6 마우스에서 MCA의 내고 수술을 제시한다. 우리는 미리 수술 준비, MCA의 결합 수술과 경색 볼륨 부량 위해 2,3,5 Triphenyltetrazolium 염화물 (TTC) 얼룩을 설명합니다.
Protocol
이 프로토콜은 연구에 동물의 윤리적 사용 (UCAR)에 전념 로체스터위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. 무균 기법은 프로토콜 동안에 따라야한다. 무균 장갑과 마스크의 사용이 필요합니다.
프로토콜 동안 사용되는 모든 장비, 재료, 화학 물질 및 도구는 표 1에 설명되어 있습니다.
1. 사전 수술 준비
- 즉시 수술 후 후 처음 24 H 포스트 수술 기간 동안 매일 3-5 H, buprenorphine (0.05mg/kg) 수술 전에 2 H와 subcutaneously 쥐를 주사.
- 압력솥의 모든 수술기구, 거즈 스폰지, 그리고 면화 팁 applicators을 소독. 바로 사용하기 전에 멸균 거즈에 건조 수술과 공기 중에 70 % 에탄올에 수술 도구를 보관하십시오. 70 % 에탄올로 작업 영역을 스프레이.
- 마취 기화기를 사용하여 3 % isofluorane - 20 %의 산소 기체 혼합물로 마우스를 마취. 유량계와 산소 금액을 조정합니다. 발가락이나 꼬리 곤란 (그들은 응답한다)에 의해 마취의 수준을 테스트합니다. 2퍼센트 (V / V) isofluorane과 마취의 수준을 유지합니다.
- 마우스의 눈에 인공 눈물을 적용하고 수술 중에 눈을 손상을 방지하기 위해주의를 사용합니다. 가로 위치의 오른쪽에있는 마우스를 놓습니다.
- 왼쪽 눈과 동물 가위를 사용하여 왼쪽 귀의 기본 사이에 왼쪽에있는 영역을 쉐이브. betadine 솔루션과 면화 팁 applicators과 가볍게 지역을 바르고을 사용하여 70 % 에탄올 사이의 교류에 의해이 지역을 정화. 필요에 따라 반복합니다.
- 37 체온을 유지하기 위해 직장 탐침에 연결된 손난로 ° C.에 마우스를 놓고 미네랄 오일을 사용하여 직장 프로브를 삽입합니다.
- 현미경의 오른쪽에 마우스를 위치하고 테이프로 고정하십시오. 거즈 스폰지에 창문을 잘라 외과 영역을 커버.
2. 수술 및 MCA 내고
- 왼쪽 눈 및 좋은 직선 가위를 사용하여 왼쪽 귀의 기지 사이에 수직 절개를합니다. 외과 영역을 넓히려고 곡선 hemostats를 사용합니다.
- 스프링 가위를 사용하여 시간적 근육에 수평 절개를 만들고 약간 천천히 포셉로 당겨 두개골에서 관자놀이 근육을 분리.
- 굽은 집게와 턱뼈를 누른 상태에서 18G 바늘을 사용하여 광대뼈 아치와 squamosal 뼈의 교차점에 작은 subtemporal craniotomy하십시오.
- 뼈 rongeurs와 함께 두개골의 작은 조각을 제거하여 MCA을 폭로. 광대뼈 아치와 궤도 내용은이 과정에서 손상되지 않습니다. 조직의 과도한 건조는이 과정에서 발생하면, 면화 팁 applicators과 멸균 PBS를 적용합니다.
- 작은 선박 cauterizer를 사용하여 MCA의 말초 부분을 Ligate.
- 원래 위치로 다시 관자놀이 근육을 놓고 수술 5-0 나일론 봉합과 절개 사이트를 닫습니다.
- 마취를 중단하고 직장 프로브를 제거합니다. subcutaneously buprenorphine (0.05mg/kg)의 두번째 복용량으로 마우스를 주사. 난방 패널 ° C 37 보관했던 케이지 마우스를 반환합니다.
- 밀접하게 어떤 불편 (감소 식욕 / 물 소비, hunched 자세, 호흡 증가, 머리카락을 pilo가 - 건설)에 대한 향후 24 H에 대한 마우스를 모니터합니다. 최대 24 시간에 buprenorphine subcutaneously 매일 3-5 H 수술로 마우스를 주사. 이 기간 동안 복구 젤로 마우스를 제공합니다.
3. TTC의 스테 이닝과 뇌졸중 볼륨의 결정
- 수술 후 스물넷 시간 깊이 마우스를 마취, transcardially 인산의 4% TTC (W / V)을 사용하여 10 분에 대한 4 % paraformaldehyde 솔루션 후 15 분 및 위해 호수 (PBS)를 버퍼로 마우스를 perfuse 중간 유량의 미니 연동이 펌프. 두뇌를 제거하고 밤새 4 % paraformaldehyde 용액에 넣습니다.
- sectioning 블록에 머리를 놓습니다. 면도날을 사용하여 1mm 두께의 조각에 머리를 슬라이스.
- 밀리미터 스케일 통치자 옆에있는 슬라이스를 놓습니다. 해부 현미경에 연결된 디지털 카메라를 사용하여 조각을 사진에 담아보세요.
- 이미지 J 소프트웨어 (http://rsbweb.nih.gov/ij/)를 사용하여 contralateral 사이트의 전체 영역에서 ipsilateral 사이트의 비 infarcted 지역을 빼서하여 스트로크 영역을 계산합니다. 조각 22 스트로크 영역을 쌓아하여 스트로크 볼륨을 계산합니다.
4. 방향 이미지 J 소프트웨어를 사용하는
- 파일 메뉴를 클릭하여 이미지 J 소프트웨어의 분석에 이미지 파일을 엽니다.
- 프로그램의 '직선'탭을 클릭하십시오. 눈금자에있는 두 개의 여백 사이에 직선을 그립니다. '분석'메뉴를 클릭하고 '설정 규모'를 선택합니다. 1로 알려진 거리, mm로 길이의 단위를 설정합니다.
- '프리핸드 원'탭을 클릭하십시오. contralateral 반구를 대략적으로 원을 그립니다. '분석'메뉴를 클릭하고 '측정'을 선택합니다. 계산 창이 그려진 동그라미의 영역을 보여주는 팝업됩니다.
- ipsilateral 반구 제외 뇌졸중 (흰색) 주변 다른 원을 그립니다. 로 단계 4.3에 표시된 영역을 측정합니다. 새로운 값은 계산 창에 추가됩니다. 1, 2 가치의 차이는 아래의 수식으로 표시됩니다 경색의 영역을 나타냅니다.
- 4.2-4.4 단계를 반복하여 각 슬라이스에서 스트로크 영역을 계산합니다. 각 슬라이스 (ΣA N)으로 계산 스트로크 지역의 변론을 가져가라. 이것은 각 슬라이스의 두께는 1mm있다는 사실을 알고 뇌졸중 볼륨을 나타냅니다.
ΣA N X 1mm (각 슬라이스의 두께) = 뇌졸중 볼륨
5. 대표 결과 :
마우스의 영구 MCA의 결합에 의해 얻은 infarcts는 대부분 대뇌 피질 있습니다. 그러나, 그것은 MCA가 lenticulostriate 지점 근위 출혈도 잡았 경우 subcortical 병변을 얻을 수 있습니다. MCA 내고 후 뇌졸중 볼륨 10mm ³에서 35mm ³ 19 23 달라질 수 있습니다. 스트로크 볼륨 23 35mm 20mm ³ ³하는 사이 Filiano 외의 MRI 이미지에서 결정하면서 Moyanova 외의 TTC의 얼룩과 계산 스트로크 볼륨. 19 22mm 10mm ³ ³로 사이에있다. 아마 내고의 정확한 위치 및 스트로크 볼륨을 측정하는 데 사용되는 다른 방법이 차이에 사용할 수있는 이유.
그림 1에서, 야생의 유형 C57/BL6 마우스에서 TTC 자국 두뇌 24 시간 게시물 영구 MCA의 결합이 표시됩니다. 뇌졸중 사이트 모양 (그림 1A, B)에 흰색입니다. 그림 1A와 B는 서로 다른 각도에서 경색 사이트를 보여줍니다. 그림 2는 (그림 2A - G) 후부에 앞쪽에에서 TTC 스테인드 스트로크 두뇌의 1mm 두께의 조각 보여줍니다. 경색 부피 24 H 수술 후 계산되었다. 경색의 볼륨 ~ 23mm ³이다.
그림 1. 스트로크 사이트입니다. AB의 표현, TTC는 MCA의 결합 후 전체 뇌 이미지, 24 H를 더럽 혔다. 화이트 영역 경색을 나타냅니다.
그림 2. 대표 결과입니다. (A> G), TTC 스테인드 1mm 두뇌 섹션, MCAL 후 24 H. 조각은 뒷부분에 앞쪽에에서 정렬됩니다. 화이트 영역 경색을 나타냅니다.
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Discussion
영구 MCA의 결합 방법은 높은 재현성 경색 볼륨과 사용 가능한 다른 방법에 비해 증가 이후 수술 생존 속도를 제공합니다. 절차의 간편하고 짧은 기간 (~ 30 분)는 더욱 실용적합니다. 방법은 널리 마우스 및 쥐 모두에서 사용됩니다.
이 기술은 stereomicroscope 아래 침략 수술을 필요로합니다. 따라서 현미경으로 운영하고 성공적인 craniotomy을 완성 경험이 필수적입니다. 실험이 수행되기 전에 연구실에서 일관성 infarcts를 확립하는 것이 좋습니다. 재현성 결과를 달성하기 위해서는 똑같은 위치에서 매번 MCA를 ligate하는 것이 중요합니다. MCA는 subcortical infarcts이 원하는 경우에는 지점을 lenticulostriate하는 근위 출혈도 잡았해야합니다. 동맥 완전히 출혈도 잡았 및 폐색은 영구적입니다. 그러므로이 모델은 MCA를 통해 reperfusion을 허용하지 않습니다. 이 예제에 포함되지 않지만, 그것은 도플러 프로브는 동맥의 완전한 결합을 확인하기 위해 영향을받는 영역에 혈액 흐름을 측정하기위한 사용하면 좋습니다.
노출과 동맥을 coagulating 동안 교환하지 손상 또는 주사 MCA 매우 신중해야합니다. Craniotomy는 광대뼈에 손상을 방지하기 위해 광범위한주의하여야한다. 외과 영역의 경색 영역에 매우 가까이 있기 때문에, 대뇌 피질의 표면에 손상이 craniotomy하거나 소작하는 동안 피해야한다. FST 18015-00 cateurizer 단위 또는 바이폴라 cateurizer이 데모에서 사용되는 FST 18000-00 대신 사용할 수 있습니다. FST 18015-00 사용자가 대뇌 피질의 조직 손상을 방지 수도 저열에 cauterizer 팁의 온도를 조절할 수 있습니다. FST 18015-00 또한 배터리 작동 소작된 도구 본 온도 변동을 방지합니다. 소작하는 동안, 사용자는 산소 흐름 cauterizer을 유지하는 것은 매우 신중해야하고 순간적으로 점화의 위험을 피하기 위해 O 2 / isofluorane를 종료할 수 있습니다. 이것은 마우스의 마취 상태에 영향을 미치지 않습니다. 이러한 위험을 방지하기 위해, 우리는뿐만 아니라, 충분히 공기 순환을 증가 공중에있는 여분의 O 2 / isofluorane을 그리는 외과 영역으로 확장 환기 파이프를 사용합니다.
영구 MCA의 결합 모델은 허혈성 뇌졸중을 공부에 매우 유용합니다. 그것은 neuroprotectants를 테스트하거나 유전자 변형 마우스 모델에 생체내에 국소 빈혈의 분자 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 생체내 접근에서 이것을 사용하기위한 확실한 이점이 허혈성 손상 후 존재하는 neuroinflammatory 프로세스 이외에 그대로의 연결을 네트워크에 허혈성 모욕의 연구 및 행동 반응 포스트 모욕에 대한 허용됩니다. 따라서, 이것은 생체내 행정 모델에서 세포 배양에 국소 빈혈을 모방하는 데 사용되는 현장 모델로하는 중요한 보완적인 접근 방법을 제공합니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
수술 기술은 원래 조지아 메디컬 대학에서 박사 윌리엄 D. 힐의 연구실에 인수되었다. 저자는 또한 절개 카메라의 사용에 대한 데이빗 A. Rempe 및 란다 Prifti 감사하고 싶습니다. 이 연구는 NIH NS041744, NS051279, F31 NS064700 및 AHA 30815697D 지원했다.
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