A aplicação de ligadura da artéria Cerebral Média Permanente no mouse

Summary

Ligadura da artéria cerebral média (MCA) é uma técnica para estudo da isquemia cerebral focal em modelos animais. Neste método, o da artéria cerebral média é exposto por craniotomia e ligados por cauterização. Este método dá volumes infarto altamente reprodutível e aumentou as taxas de sobrevivência pós-operatória em comparação com outros métodos disponíveis.

Abstract

Isquemia cerebral focal está entre o tipo mais comum de acidente vascular cerebral vista em pacientes. Devido à importância clínica, tem havido um esforço prolongado para desenvolver modelos animais adequados para o estudo dos eventos que acontecem durante o insulto isquêmico. Estas técnicas incluem transitória ou permanente, modelos de isquemia focal ou global usando muitos diferentes modelos animais, com os roedores mais comuns são.

O método de ligadura permanente MCA que também é referido como pMCAo na literatura é usado extensivamente como um modelo de isquemia focal em roedores ^1-6. Este método foi originalmente descrito para ratos por Tamura et al. em 1981 ^7. Neste protocolo uma craniotomia foi usado para acessar o MCA e as regiões proximal foram ocluídas por eletrocoagulação. Os infartos envolvem regiões principalmente cortical e às vezes estriado, dependendo da localização da oclusão. Esta técnica está agora bem estabelecida e usada por muitos laboratórios ^8-13. Utilização precoce desta técnica levou à definição e descrição do "core infarto" e "penumbra" ^14-16, e é freqüentemente usado para avaliar o potencial neuroprotetor compostos ^{10, 12, 13, 17.} Embora os estudos iniciais foram realizados em ratos, ligadura MCA permanente tem sido usado com sucesso em camundongos com ligeiras modificações ^18-20.

Este modelo produz infartos reprodutível e aumento da sobrevivência pós-taxas. Aproximadamente 80% dos acidentes vasculares cerebrais isquêmicos em humanos acontecem na área MCA ²¹ e, portanto, este é um modelo muito relevante para os estudos acidente vascular cerebral. Atualmente, há uma escassez de tratamentos eficazes disponíveis para pacientes com AVC, e, portanto, há uma necessidade de bons modelos para testar o potencial de compostos farmacológicos e avaliar os resultados fisiológicos. Este método também pode ser usada para estudar mecanismos de resposta a hipóxia intracelular in vivo.

Aqui, apresentamos a cirurgia de ligadura MCA em um rato C57/BL6. Descrevemos a preparação pré-cirúrgica, MCA cirurgia de ligadura e 2,3,5 trifeniltetrazólio cloreto de coloração (TTC) para quantificação dos volumes de infarto.

Protocol

Este protocolo foi aprovado pela Universidade de Rochester comitê dedicado ao uso ético de animais na pesquisa (UCAR). Técnicas de assepsia devem ser seguidas durante o protocolo. O uso de luvas estéreis e máscara é obrigatório.

Todos os equipamentos, materiais, produtos químicos e ferramentas que são usadas durante o protocolo são descritos na Tabela 1.

1. Preparação pré-cirúrgica

1. Injetar camundongos por via subcutânea com buprenorfina (0.05mg/kg) 2 h antes da cirurgia, imediatamente após a cirurgia e depois a cada 3-5 h nas 24 h primeiro período pós-operatório.
2. Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos, esponjas de gaze, e aplicadores com ponta de algodão por autoclave. Manter instrumentos cirúrgicos em etanol 70% durante a cirurgia e ar seco em gaze esterilizada direito antes de usar. Pulverizar a área de trabalho com álcool 70%.
3. Anestesiar o rato com uma mistura de gás de 3% isofluorano-20% de oxigênio, usando um vaporizador anestésico. Ajustar a quantidade de oxigênio com o medidor de vazão. Testar o nível de anestesia com pés ou beliscar a cauda (que deveria ser indiferente). Manter o nível de anestesia com 2% (v / v) isofluorano.
4. Aplicar lágrimas artificiais para os olhos do rato e tome cuidado para não danificar o olho durante o procedimento cirúrgico. Posicione o mouse em seu lado direito em uma posição lateral.
5. Raspar a área do lado esquerdo entre o olho esquerdo e na base da orelha esquerda usando o clippers animal. Limpar a área pela alternância entre uma solução de betadine e etanol a 70%, utilizando aplicadores de algodão ponta e esfregar levemente a área. Repita conforme necessário.
6. Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento ligado a uma sonda retal para manter a temperatura corporal a 37 ° C. Introduzir a sonda retal, utilizando óleo mineral.
7. Posicione o mouse em seu lado direito sob o microscópio e prenda com fita adesiva. Cortar uma janela em uma gaze e cubra área cirúrgica.

2. Procedimento cirúrgico e MCA Ligadura

1. Faça uma incisão vertical entre o olho esquerdo e na base da orelha esquerda usando uma tesoura fina reta. Use hemostats curvas para manter a área de cirurgia aberta.
2. Faça uma incisão horizontal sobre o músculo temporal usando uma tesoura primavera e ligeiramente separada do músculo temporal do crânio por lentamente puxando com fórceps.
3. Fazer uma craniotomia pequena subtemporal na junção do arco zigomático e osso esquamosal usando uma agulha de 18G, mantendo o maxilar com uma pinça curva.
4. Expor o MCA, removendo os pequenos pedaços de crânio com fórceps óssea. Do arco zigomático e conteúdo orbital não deve ser danificado durante este processo. Se a secagem excessiva de tecido ocorre durante este processo, aplique PBS estéril com ponta de algodão aplicadores.
5. Ligadura da porção distal do MCA usando um cauterizador de pequenos vasos.
6. Coloque o músculo temporal de volta para sua posição original e feche o local da incisão cirúrgica com nylon 5-0.
7. Descontinuar a anestesia e remover a sonda retal. Injetar o mouse com uma 2 ª dose de buprenorfina (0.05mg/kg) por via subcutânea. Devolver o mouse para a gaiola que foi mantida a 37 ° C com um painel de aquecimento.
8. Acompanhar de perto o mouse para os próximos 24 h para qualquer desconforto (diminuição do consumo de apetite / água, postura encurvada, respiração aumentada, pilo-erigido cabelo). Injetar o mouse com buprenorfina por via subcutânea a cada 3-5 h pós-operatório até 24h. Fornecer o mouse com gel de recuperação durante este período.

3. TTC Coloração e Determinação do Volume Sistólico

1. Vinte e quatro horas após a cirurgia profundamente anestesiar o mouse, transcardially perfundir do mouse com um TTC 4% (w / v) em tampão fosfato salino (PBS) por 15 min e depois com uma solução de paraformaldeído a 4% por 10 min usando uma mini-bomba peristáltica de vazão média. Remover o cérebro e colocá-lo na solução de paraformaldeído 4% durante a noite.
2. Posição do cérebro dentro do bloco de corte. Fatia do cérebro em fatias 1 mm de espessura, utilizando lâminas de barbear.
3. Coloque as fatias ao lado de uma régua de escala milimétrica. Fotografar as fatias usando uma câmera digital conectada ao microscópio de dissecação.
4. Calcular a área acidente vascular cerebral, subtraindo a área não-infartada do site ipsilateral da área total do site contralateral utilizando Software Image J (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Calcular o volume de ejeção pelo empilhamento da área golpe de ²² fatias.

4. Instruções para usar o software Image J

1. Abra o arquivo de imagem a ser analisada no software Image J, clicando no menu arquivo.
2. Clique na guia "linha reta" no programa. Desenhar uma linha reta entre as duas margens na régua. Clique em 'analisar' menu e selecione "escala set '. Definir a distância conhecida como 1, unidade de comprimento como mm.
3. Clique na guia 'círculo à mão livre ". Desenhar um círculo para delinear o hemisfério contralateral. Clique em 'analisar' menu e selecione "medida". A janela de cálculo irá aparecer mostrando a área do círculo desenhado.
4. Desenhar outro círculo em torno da área do acidente vascular cerebral ipsilateral excluindo hemisfério (branco). Medir a área, como indicado no passo 4.3. O novo valor será adicionado à janela de cálculo. A diferença entre os valores 1 e 2 representa a área do infarto, que é indicado como A na fórmula abaixo.
5. Calcular a área acidente vascular cerebral em cada fatia, repetindo os passos 4,2-4,4. Tome somatória da área curso calculado em cada fatia (ΣA _n). Isso representa volume de curso o fato de saber que a espessura de cada fatia é de 1mm.
   ΣA _n x 1mm (espessura de cada fatia) = volume do curso

5. Resultados representativos:

Os infartos obtidos por ligadura MCA permanente no rato são principalmente cortical. No entanto, é possível obter lesões subcorticais se o MCA é ligada ao ramo proximal lenticulostriate. Os volumes de acidente vascular cerebral após MCA ligadura pode variar de 10 milímetros a 35mm ³ ³ ^{19, 23.} O volume sistólico calculado com TTC coloração em Moyanova et al. ¹⁹ estão entre 10mm a ³ ³ 22 milímetros, enquanto os volumes de acidente vascular cerebral determinada a partir de imagens de ressonância magnética em Filiano et al ²³ têm entre 20mm a ³ ³ 35mm. A possível razão para estas diferenças talvez a localização exata da ligadura e os diferentes métodos utilizados para medir os volumes de acidente vascular cerebral.

Na Figura 1, um manchado TTC cérebro 24 horas pós ligadura MCA permanente em um rato selvagem tipo C57/BL6 é mostrado. O site do curso é branco na aparência (Fig. 1A, B). Figura 1A e B ilustram o site infarto de diferentes ângulos. A Figura 2 mostra fatias 1 mm de espessura do cérebro TTC manchada acidente vascular cerebral no sentido antero-posterior (Fig. 2A-G). Volume de infarto foi calculada 24 horas pós-cirurgia. O volume do infarto é ~ ³ 23mm.

Figura 1. Representação do site acidente vascular cerebral. AB, TTC manchado imagens do cérebro inteiro, 24 h após a ligadura MCA. Área branca representa o infarto.

Figura 2. Resultados representativos. (A G>), as seções do cérebro TTC manchada 1mm, 24 h após Mcal. Fatias estão alinhados no sentido antero-posterior. Área branca representa o infarto.

Discussion

O método de ligadura permanente MCA dá volumes infarto altamente reprodutível e aumentou as taxas de sobrevivência pós-operatória em comparação com outros métodos disponíveis. A facilidade ea curta duração (~ 30 min) do processo de torná-lo ainda mais prático. O método é amplamente utilizado em ambos os ratos e ratazanas.

Esta técnica requer uma cirurgia invasiva sob um estereomicroscópio. Portanto, a experiência em operar sob um microscópio e aperfeiçoando uma craniotomia sucesso é essencial. É melhor estabelecer infartos consistente no laboratório antes dos experimentos são realizados. Para alcançar resultados reproduzíveis é importante para ligadura do MCA no mesmo local exato de cada vez. O MCA deve ser ligada proximal para lenticulostriate ramos se infartos subcorticais são desejados. A artéria está completamente ligada e a oclusão é permanente. Portanto, este modelo não permite reperfusão através do MCA. Embora não esteja incluído nesta demonstração, o melhor é se uma sonda doppler é utilizado para medir o fluxo de sangue na área afetada para verificar ligadura completa da artéria.

O operador deve ter muito cuidado para não danificar ou punção MCA enquanto expondo e coagulação da artéria. Craniotomia deve ser realizada com cuidado extenso para evitar qualquer dano ao osso zigomático. Porque a área cirúrgica é muito próximo da área de infarto, qualquer dano à superfície cortical devem ser evitados durante craniotomia ou cauterização. FST unidade cateurizer 18015-00 ou um cateurizer bipolar pode ser usado em vez do FST 18000-00 usados ​​nesta demonstração. FST 18015-00 permite ao usuário ajustar a temperatura da ponta cauterizador ao fogo baixo o que pode evitar danos ao tecido cortical. FST 18015-00 também evita a flutuações de temperatura da bateria visto em ferramentas de cauterização operado. Durante a cauterização, o usuário deve ter muito cuidado para manter o cauterizador fora do fluxo de oxigênio e pode momentaneamente desligar o O ₂ / isofluorano para evitar risco de ignição. Isso não afetará o estado de anestesia do mouse. Para evitar esse risco, usar um tubo de ventilação estendido para a área cirúrgica que aumenta a circulação de ar suficiente, bem como puxa qualquer excesso O ₂ / isofluorano no ar.

O modelo de ligadura permanente MCA é extremamente útil no estudo de acidente vascular cerebral isquêmico. Ele pode ser usado para testar neuroprotetores ou estudar os mecanismos moleculares de isquemia in vivo em modelos de ratos transgênicos. A vantagem óbvia para a utilização deste na abordagem vivo é que esta permite o estudo de insulto isquêmico na intactas as redes neuronais e da resposta comportamental pós-insulto, além dos processos neuroinflamatórias que estão presentes após o dano isquêmico. Portanto, este modelo in vivo curso fornece uma abordagem crítica complementar em modelos in situ, que são utilizados para imitar isquemia em cultura de células.