Применение постоянных средней мозговой артерии Лигирование в мышь

Summary

Средней мозговой артерии (СМА) лигирование является методика исследования координационного ишемии мозга на животных моделях. В этом методе, средней мозговой артерии, предоставляемые трепанации черепа и лигируют путем прижигания. Этот метод дает очень воспроизводимые инфаркта объемов и увеличение послеоперационной выживаемости по сравнению с другими методами.

Abstract

Фокусное ишемии головного мозга является одним из наиболее распространенных типа инсульта у пациентов. Из-за клиническое значение имело длительных усилий по разработке подходящих животных моделей для изучения событий, которые разворачиваются в течение ишемического инсульта. Эти методы включают в себя временной или постоянной, фокусное или глобальной ишемии моделей с использованием различных моделей на животных, наиболее распространенными из которых являются грызуны.

Постоянные перевязки MCA метод, который также упоминается в качестве pMCAo в литературе широко используется в качестве координационного модели ишемии у грызунов ^1-6. Этот метод был впервые описан для крыс Тамура и соавт. в 1981 г. ^7. В этом протоколе трепанации черепа был использован для доступа MCA и проксимальных регионов окклюзии путем электрокоагуляции. Инфаркты включают главным образом коры, а иногда и полосатой регионам в зависимости от расположения окклюзии. Эта техника в настоящее время хорошо известны и используются во многих лабораториях ^8-13. Раннее использование этой техники привело к определению и описанию "инфаркт основные» и «полутени» ^14-16, и она часто используется для оценки потенциальных нейропротекторное соединений ^{10, 12, 13, 17.} Хотя первоначальные исследования проводились на крысах, постоянные перевязки MCA успешно применяется у мышей с небольшими изменениями ^18-20.

Эта модель дает воспроизводимые инфарктов и повышение после выживаемости. Около 80% ишемических инсультов у людей происходят в области MCA ²¹ и таким образом, это является очень актуальной моделью развития инсульта исследований. В настоящее время наблюдается нехватка эффективных методов лечения доступны для пациентов, перенесших инсульт, и, следовательно, есть потребность в хороших моделей для тестирования потенциальных фармакологических препаратов и оценить физиологическое результатов. Этот метод может также использоваться для изучения внутриклеточных механизмов реагирования гипоксии в естественных условиях.

Здесь мы представляем хирургии MCA лигирования в C57/BL6 мыши. Мы описываем предоперационной подготовки, MCA перевязки хирургии и 2,3,5 Triphenyltetrazolium хлорида (ТТК) окрашивания для количественного определения инфаркта томов.

Protocol

Этот протокол был одобрен Университета Рочестера комитета посвящено этическим использование животных в исследованиях (UCAR). Асептический методы должны соблюдаться во время протокола. Использование стерильных перчаток и маски не требуется.

Все оборудование, материалы, химикаты, и инструменты, которые используются во время протокола описаны в таблице 1.

1. Предоперационная подготовка

1. Inject мышам подкожно бупренорфин (0.05mg/kg) 2 ч до операции, сразу после операции, а затем каждые 3-5 ч в течение первых 24 часов послеоперационного периода.
2. Стерилизовать всех хирургических инструментов, марля губки, и аппликаторы хлопка наконечник в автоклаве. Держите хирургические инструменты в 70% этанола во время операции и сухой воздух на стерильную марлю непосредственно перед использованием. Спрей рабочей зоны с 70% этанола.
3. Обезболить мышь с 3% isofluorane-20% газовой смеси кислорода с помощью испарителя анестетиков. Отрегулируйте количество кислорода с расходомером. Проверьте уровень анестезии на ноги или хвост щипать (они должны быть все равно). Поддерживать уровень анестезии 2% (об. / об) isofluorane.
4. Применять искусственные слезы на глазах мыши и соблюдать осторожность, чтобы не повредить глаза во время хирургической операции. Наведите на правом боку в боковом положении.
5. Бритье области с левой стороны между левым глазом и основанием левого уха использования животного клиперов. Чистят области, чередуя решение бетадин и 70% этанола с помощью ватного наконечник аппликаторы и слегка втирают области. При необходимости повторите.
6. Наведите на грелку подключен к ректальный зонд для поддержания температуры тела при температуре 37 ° C. Вставьте ректальный зонд с помощью минерального масла.
7. Поместите мышь на правый бок под микроскопом и безопасный с лентой. Вырезать окна марлей губки и охватывают хирургической области.

2. Хирургические процедуры и MCA Лигирование

1. Сделайте вертикальный разрез между левым глазом и основанием левого уха с помощью тонкой прямые ножницы. Используйте изогнутые hemostats держать хирургические области открыты.
2. Сделать горизонтальный разрез на височной мышцы с помощью ножниц весной и слегка отдельных височной мышцы с черепом на медленно тянуть пинцетом.
3. Сделайте небольшой subtemporal краниотомии на пересечении скуловой дуги и чешуйчатой ​​костей с помощью иглы 18G, удерживая челюсть с изогнутым пинцетом.
4. Expose MCA, удаляя мелкие кусочки черепа с костями rongeurs. Скуловой дуги и орбитальных содержимого не должна быть повреждена во время этого процесса. Если чрезмерного высыхания тканей происходит во время этого процесса, применять стерильную PBS с аппликаторами хлопка наконечником.
5. Лигировать дистальной части MCA с помощью небольшого cauterizer судна.
6. Место височной мышцы в исходное положение и закройте разреза с хирургическим 5-0 швами из нейлона.
7. Прекратите анестезии и удалить ректального датчика. Inject мышь с 2-й дозы бупренорфина (0.05mg/kg) подкожно. Вернуться мыши клетке, которая хранилась при температуре 37 ° С при нагреве панели.
8. Внимательно следить за мышь в течение следующих 24 ч в течение какого-либо дискомфорта (снижение аппетита / потребления воды, выгибание спины, увеличение дыхания, Пило-возведена волос). Inject мышь с бупренорфин подкожно каждые 3-5 ч после операции до 24 часов. Обеспечить мыши с восстановлением геля в этот период.

3. TTC Окрашивание и определение ударного объема

1. Двадцать четыре часа после операции глубоко анестезию мыши, transcardially заливать мышь с 4% TTC (м / о) в фосфатном буферном растворе (PBS) в течение 15 мин, а затем с 4% параформальдегида решение в течение 10 мин с помощью мини перистальтического насоса на средней скорости потока. Удалить мозга и поместить его в 4% параформальдегида решение в одночасье.
2. Позиция мозг в секционирования блока. Нарежьте мозга в 1 мм толщиной ломтиками с помощью лезвия.
3. Место ломтиками рядом с миллиметровой линейкой масштаба. Фотография ломтики с помощью цифровой камеры, подключенной к рассекает микроскопом.
4. Вычислить площадь инсульта путем вычитания без инфаркта области ипсилатерального сайт с общей площадью контралатеральной сайте, используя изображения J Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Расчет ударного объема, складывая инсульта области ломтиками ^22.

4. Направления в использовании программное обеспечение изображение J

1. Откройте файл изображения должны быть проанализированы в изображение программного обеспечения J, нажав на файл меню.
2. Нажмите на вкладку "прямой линии" в программе. Нарисуйте прямую линию между двумя полями на линейке. Нажмите на "анализ" и выберите "набор масштаба». Установить известное расстояние, как 1, единица длины, как мм.
3. Нажмите на вкладку "от руки круг». Нарисуйте круг очертить контралатерального полушария. Нажмите на "анализ" и выберите "мера". Расчет появится всплывающее окно показывает площадь круга нарисован.
4. Нарисуйте еще один круг вокруг ипсилатерального полушария исключением инсульта (белые) области. Измерьте площадь, как указано в пункте 4.3. Новое значение будет добавлено в расчет окна. Разница между первым и вторым значениями представляет область инфаркта который указан как в приведенной ниже формуле.
5. Рассчитать инсульта области, в каждый кусочек, повторяя шаги 4.2-4.4. Возьмите суммирования инсульта площадь рассчитывается в каждом срезе (ΣA _п). Это представляет ударный объем зная то, что толщина каждого среза 1 мм.
   ΣA _п х 1 мм (толщина каждого среза) = Ударный объем

5. Представитель Результаты:

Инфаркты получить постоянное перевязки MCA в мышь в основном коры. Тем не менее, можно получить подкорковых поражений, если MCA лигируют проксимальнее lenticulostriate отрасли. Ударный объем после перевязки MCA может варьироваться от 10 мм до 35 мм ³ ³ ^{19, 23.} Ударный объем рассчитывается с TTC окрашивания в Moyanova и соавт. ¹⁹ составляет от 10 мм до 22 мм ³ ³ в то время как ударный объем определяется по МРТ в Filiano и др. ²³ составляет от 20 мм до 35 мм ³ ³. Возможной причиной этих различий может быть, точное расположение труб и различных методов, используемых для измерения объемов инсульта.

На рисунке 1, мозгом TTC витражи 24 часов после перевязки постоянного MCA в дикого типа C57/BL6 мышь показано на рисунке. Инсульт сайт имеет белый внешний вид (рис. 1а, б). Рисунок 1А и В иллюстрируют инфаркта сайт под разными углами. На рисунке 2 показан 1 мм толщиной ломтиками TTC окрашенных инсульт мозга спереди назад (рис. 2A-G). Инфаркт объеме рассчитывалась 24 ч после операции. Объем инфаркта составляет ~ 23 мм ³.

Рисунок 1. Представление инсульта сайта. AB, TTC окрашенных целом изображения головного мозга, через 24 ч после перевязки MCA. Белая область представляет инфаркта.

Рисунок 2. Представитель результаты. (> G), TTC окрашенных мозга 1мм разделов, через 24 ч после MCAL. Фрагменты выравниваются от передних к задним. Белая область представляет инфаркта.

Discussion

Постоянные перевязки MCA метод дает очень воспроизводимые инфаркта объемов и увеличение послеоперационной выживаемости по сравнению с другими методами. Легкости и малой длительности (~ 30 мин) Процедура сделать его еще более практичным. Метод широко используется в обеих мышей и крыс.

Эта техника требует хирургического вмешательства под стереомикроскопа. Таким образом, опыт работы под микроскопом и совершенствование успешной трепанации черепа имеет важное значение. Лучше всего провести последовательный инфарктов в лаборатории до эксперименты проводятся. Для достижения воспроизводимости результатов важно лигировать MCA в то же точное место каждый раз. MCA должны быть перевязаны проксимальнее lenticulostriate отрасли, если подкорковые инфаркты желательны. Артерии полностью лигируют и окклюзии является постоянным. Поэтому эта модель не позволяет реперфузия с помощью MCA. Хотя это и не включены в эту демонстрацию, это лучше, если зонд допплер используется для измерения кровотока в пораженной области для проверки полной перевязки артерии.

Оператор должен быть очень осторожным, чтобы не повредить или проколоть MCA разоблачая и коагулирующих артерии. Краниотомия должны быть выполнены с большим аккуратность, не допуская повреждения скуловой кости. Потому что хирургическое области находится очень близко к инфаркта области, любое повреждение поверхности коры следует избегать во время трепанации черепа или прижигания. ФСТ 18015-00 блок cateurizer или cateurizer биполярного может быть использован вместо ФСТ 18000-00, используемых в этой демонстрации. ФСТ 18015-00 позволяет пользователю регулировать температуру cauterizer наконечник слабом огне, которые могли бы предотвратить любые повреждения корковой ткани. ФСТ 18015-00 также позволяет избежать колебаний температуры видел в батарейках инструментов прижигания. Во время прижигания, пользователь должен быть очень осторожны, чтобы сохранить cauterizer из потока кислорода и может на мгновение закрыть O ₂ / isofluorane, чтобы избежать опасности возгорания. Это не повлияет на состояние наркоза мыши. Чтобы предотвратить эту опасность, мы используем вентиляционные трубы продлен до хирургической области, которая увеличивает циркуляцию воздуха в достаточной степени, а также обеспечивает вывод любой избыток O ₂ / isofluorane в воздухе.

Постоянные перевязки MCA модель чрезвычайно полезна при изучении ишемического инсульта. Он может быть использован для тестирования или нейропротекторные исследования молекулярных механизмов ишемии в естественных условиях на модели трансгенных мышей. Очевидное преимущество использования данного подхода в естественных условиях является то, что это позволяет изучение ишемического инсульта на неповрежденных нейронных сетей и поведенческая реакция постинсультных, в дополнение к neuroinflammatory процессов, которые присутствуют после ишемического повреждения. Таким образом, эта модель в ход естественных условиях дает критическую дополнительный подход к на месте модели, которые используются для имитации ишемии в клеточной культуре.