La aplicación de la Permanente Ligadura arteria cerebral media en el ratón

Summary

La arteria cerebral media (MCA) ligadura es una técnica para estudiar la isquemia cerebral focal en modelos animales. En este método, la arteria cerebral media se expone mediante craneotomía y se liga con cauterización. Este método da volumen del infarto altamente reproducible y el aumento de post-operatorio las tasas de supervivencia en comparación con otros métodos disponibles.

Abstract

Isquemia cerebral focal se encuentra entre el tipo más común de accidente cerebrovascular en los pacientes. Debido a la importancia clínica no ha habido un esfuerzo prolongado para desarrollar modelos animales para estudiar los acontecimientos que se desarrollan durante la lesión isquémica. Estas técnicas incluyen transitoria o permanente, los modelos de isquemia focal o global con muchos diferentes modelos animales, con los roedores más comunes son.

El método permanente MCA ligadura que también se conoce como pMCAo en la literatura se utiliza ampliamente como un modelo de isquemia focal en los roedores ^1-6. Este método fue descrito originalmente para las ratas por Tamura et al. en 1981 ^7. En este protocolo se utilizó una craneotomía para acceder a la MCA y de las regiones proximal se ocluye por electrocoagulación. Los infartos a regiones corticales y sobre todo del estriado a veces dependiendo de la localización de la oclusión. Esta técnica está bien establecido y utilizado en muchos laboratorios de ^8.13. El uso precoz de esta técnica condujo a la definición y descripción del "núcleo del infarto" y "penumbra", ^14-16, y es a menudo utilizado para evaluar el potencial de compuestos neuroprotectores ^{10, 12, 13, 17.} Aunque los estudios iniciales se realizaron en ratas, la ligadura permanente MCA ha sido utilizado con éxito en ratones con ligeras modificaciones, ^18-20.

Este modelo produce infartos reproducible y el aumento de las tasas de supervivencia después. Aproximadamente el 80% de los accidentes cerebrovasculares isquémicos en los humanos ocurren en el área de MCA ²¹ y por lo tanto este es un modelo muy importante para los estudios de tiempos. En la actualidad, hay una escasez de tratamientos eficaces para los pacientes con ictus, y por lo tanto hay una necesidad de un buen modelo para evaluar el potencial compuestos farmacológicos y evaluar los resultados fisiológicos. Este método también puede ser utilizado para el estudio de los mecanismos de respuesta a la hipoxia intracelular in vivo.

A continuación, presentamos la cirugía de ligadura de MCA en un ratón C57/BL6. Se describe la preparación pre-quirúrgica, la cirugía de ligadura de MCA y 2,3,5 cloruro de trifenil tetrazolio (TTC) tinción para la cuantificación de los volúmenes de infarto.

Protocol

Este protocolo fue aprobado por la Universidad de Rochester comité dedicado a la ética del uso de animales en la investigación (UCAR). Técnicas de asepsia deben ser seguidas durante el protocolo. El uso de guantes estériles y mascarilla es necesario.

Todos los equipos, materiales, productos químicos y herramientas que se utilizan en el protocolo se describen en la Tabla 1.

1. La preparación pre-quirúrgica

1. Se inyecta por vía subcutánea ratones con buprenorfina (0.05mg/kg) 2 h antes de la cirugía, inmediatamente después de la cirugía y luego cada 3-5 h durante las primeras 24 horas post-operatorio.
2. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos, gasas, algodón y aplicadores de punta por autoclave. Mantenga las herramientas quirúrgicas en el 70% de etanol durante la cirugía y el aire seco en una gasa estéril justo antes de su uso. Rocíe el área de trabajo con el 70% de etanol.
3. Anestesiar el ratón con un 3% isofluorano-20% mezcla de gas de oxígeno mediante el uso de un vaporizador anestésico. Ajustar la cantidad de oxígeno con el medidor de flujo. Evaluar el nivel de anestesia por los pies o los pellizcos de cola (que debe ser que no responde). Mantener el nivel de la anestesia con un 2% (v / v) isofluorano.
4. Aplicar lágrimas artificiales para los ojos del ratón y tenga cuidado para evitar daños en el ojo durante la intervención quirúrgica. Coloque el ratón sobre su lado derecho en posición lateral.
5. Afeitar el área en el lado izquierdo entre el ojo izquierdo y la base de la oreja izquierda con los Clippers de los animales. Limpie el área por la alternancia entre una solución de Betadine y el 70% de etanol con aplicadores con punta de algodón y frotar suavemente la zona. Repita según sea necesario.
6. Coloque el ratón sobre una almohadilla eléctrica conectada a una sonda rectal para mantener la temperatura corporal a 37 º C. Inserte la sonda rectal mediante el uso de aceite mineral.
7. Coloque el ratón sobre su lado derecho bajo el microscopio y seguro con cinta adhesiva. Cortar una ventana en una gasa y cubrir el área quirúrgica.

2. Procedimiento quirúrgico y la ligadura de MCA

1. Haga una incisión vertical entre el ojo izquierdo y la base de la oreja izquierda con finas tijeras rectas. Use pinzas hemostáticas curvas para mantener el área de cirugía abierta.
2. Se practica una incisión horizontal en el músculo temporal mediante el uso de tijeras de primavera y un poco separado del músculo temporal del cráneo tirando lentamente con unas pinzas.
3. Hacer una craneotomía subtemporal pequeña en la unión del arco cigomático y hueso escamoso mediante el uso de una aguja 18G, mientras que la celebración de la mandíbula con pinzas curvas.
4. Exponer la MCA mediante la eliminación de los pequeños trozos de cráneo con gubia ósea. El arco cigomático y contenido de la órbita no debe ser dañada durante el proceso. Si el secado excesivo de los tejidos se produce durante este proceso, se aplican PBS estéril con aplicadores con punta de algodón.
5. Ligar la porción distal de la MCA mediante el uso de un cauterizador de pequeños vasos.
6. Lugar del músculo temporal en su posición original y cerrar el sitio de la incisión quirúrgica con suturas de nylon 5-0.
7. Deje de anestesia y retire la sonda rectal. Inyectar el ratón con una 2 ª dosis de buprenorfina (0.05mg/kg) por vía subcutánea. Devolver el ratón de la jaula que se mantuvo a 37 ° C con un panel de calefacción.
8. Vigilar de cerca el ratón durante las próximas 24 horas para cualquier molestia (disminución del apetito / consumo de agua, postura encorvada, aumento de la respiración, pilo-erigido pelo). Inyectar el ratón con la buprenorfina por vía subcutánea cada 3-5 h después de la cirugía hasta 24 horas. Proporcionar el ratón con gel de recuperación durante este período.

3. TTC tinción y determinación del volumen sistólico

1. Veinticuatro horas después de la cirugía profundamente anestesiar el ratón, el ratón transcardially perfundir con un 4% IVA incluido (w / v) en tampón fosfato salino (PBS) durante 15 minutos y luego con una solución de paraformaldehído al 4% durante 10 minutos usando una mini-bomba peristáltica a un flujo medio. Quitar el cerebro y colocarlo en la solución de paraformaldehído al 4% durante la noche.
2. La posición del cerebro en el bloque de corte. Cortar las rebanadas de cerebro en 1 mm de espesor mediante el uso de hojas de afeitar.
3. Colocar las rebanadas de lado de una regla escala milimétrica. Fotografía de los cortes mediante el uso de una cámara digital conectada al microscopio de disección.
4. Calcular el área de derrame cerebral al restar el área no infartada del sitio ipsilateral de la superficie total del sitio contralateral usando la imagen J Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Calcular el volumen de movimiento de la estiba del área de la apoplejía de los ²² cortes.

4. Instrucciones para utilizar el software Image J

1. Abra el archivo de imagen para ser analizadas en el software Image J haciendo clic en el menú de archivo.
2. Haga clic en la pestaña "línea recta" en el programa. Trace una línea recta entre los dos márgenes de la regla. Haga clic en "analizar" y seleccione "escala de conjunto". Establecer la distancia conocida como 1, unidad de longitud en mm.
3. Haga clic en la pestaña "círculo a mano alzada. Dibuje un círculo para delinear el hemisferio contralateral. Haga clic en "analizar" y seleccione "medida". La ventana de cálculo se abrirá mostrando el área del círculo dibujado.
4. Dibuja otro círculo alrededor del hemisferio ipsilateral exclusión de accidente cerebrovascular (blanco) la zona. Medir el área, como se indica en el paso 4.3. El nuevo valor se añade a la ventana de cálculo. La diferencia entre la primera y la segunda representa los valores de la zona del infarto que se indica como A en la fórmula a continuación.
5. Calcular el área del accidente cerebrovascular en cada rebanada repitiendo los pasos 4.2-4.4. Tome la suma del área de movimiento calculado en cada sector (ΣA _n). Esto representa el volumen de eyección conocer el hecho de que el grosor de cada rebanada es 1 mm.
   ΣA _n x 1 mm (grosor de cada rebanada) = volumen Carrera

5. Los resultados representativos:

Los infartos obtenidos por la ligadura permanente de la MCA en el ratón son en su mayoría cortical. Sin embargo, es posible obtener lesiones subcorticales si el MCA se liga proximal a la rama lenticuloestriadas. Los volúmenes de derrame cerebral después de la ligadura de MCA puede variar de 10 mm a 35 mm ³ ³ ^{19, 23.} El volumen sistólico calculado con la tinción de TTC en Moyanova et al. ¹⁹ se encuentran entre ³ 10 mm a 22 mm ³, mientras que el volumen sistólico determina a partir de imágenes de resonancia magnética en Filiano et al ²³ se encuentran entre ³ 20 mm a 35 mm ³. La posible razón de estas diferencias tal vez la ubicación exacta de la ligadura y los diferentes métodos utilizados para medir el volumen sistólico.

En la Figura 1, un manchado TTC cerebral 24 horas después de la ligadura permanente MCA en una de tipo salvaje C57/BL6 del ratón se muestra. El sitio de accidente cerebrovascular es de apariencia blanca (Fig. 1A, B). Figura 1 A y B ilustran el sitio del infarto desde diferentes ángulos. La figura 2 muestra rodajas de 1 mm de espesor de la TTC manchada cerebro tiempos de adelante hacia atrás (Fig. 2A-G). El volumen del infarto se calculó 24 horas después de la cirugía. El volumen del infarto es ³ ~ 23mm.

Figura 1. Representación de sitio accidente cerebrovascular. AB, TTC manchadas imágenes a todo el cerebro, 24 horas después de la ligadura de MCA. Área blanca representa el infarto.

Figura 2. Los resultados representativos. (A, G>), IVA incluido manchado secciones de cerebro de 1 mm, 24 horas después de MCAL. Los sectores se alinean de adelante hacia atrás. Área blanca representa el infarto.

Discussion

El método permanente MCA ligadura da volumen del infarto altamente reproducible y el aumento de post-operatorio las tasas de supervivencia en comparación con otros métodos disponibles. La facilidad y la corta duración (~ 30 min) del procedimiento que sea aún más práctico. El método es ampliamente utilizado tanto en ratones y ratas.

Esta técnica requiere una cirugía invasiva bajo un microscopio estereoscópico. Por lo tanto, la experiencia en la operación bajo el microscopio y el perfeccionamiento de una craneotomía con éxito es esencial. Lo mejor es establecer infartos consistente en el laboratorio antes de los experimentos se llevan a cabo. Para obtener resultados reproducibles es importante ligar la MCA en el punto exacto mismo cada vez. La MCA debe ser ligado proximal a las ramas lenticuloestriadas si infartos subcorticales son deseados. La arteria está totalmente ligado y la oclusión permanente. Por lo tanto, este modelo no permite la reperfusión a través de la MCA. Aunque no se incluye en esta demostración, lo mejor es que una sonda Doppler se utiliza para medir el flujo sanguíneo en la zona afectada para verificar la ligadura completa de la arteria.

El operador debe tener mucho cuidado de no dañar o punción MCA, mientras que la exposición y la coagulación de la arteria. Craneotomía debe realizarse con cuidado extenso para evitar cualquier daño en el hueso cigomático. Debido a que el área quirúrgica está muy cerca de la zona infartada, daños a la superficie cortical se deben evitar durante la craneotomía o la cauterización. FST 18015-00 unidad cateurizer o cateurizer bipolar se puede utilizar en lugar de la FST 18000-00 utilizada en esta demostración. FST 18015-00 permite al usuario ajustar la temperatura de la punta del cauterizador a fuego lento, que podría evitar cualquier daño en el tejido cortical. FST 18015-00 también evita las fluctuaciones de temperatura de la batería se ve en las herramientas de cauterización operado. Durante la cauterización, el usuario debe tener mucho cuidado para mantener el cauterizador del flujo de oxígeno y por un momento puede apagar el O ₂ / isofluorano para evitar el riesgo de ignición. Esto no afectará el estado de anestesia del ratón. Para evitar este riesgo, se utiliza un tubo de ventilación extendió a la zona quirúrgica que aumenta la circulación de aire suficiente, así como atrae el exceso de O ₂ / isofluorano en el aire.

El modelo MCA ligadura permanente es extremadamente útil en el estudio de un accidente cerebrovascular isquémico. Puede ser utilizado para probar neuroprotectores o estudiar los mecanismos moleculares de la isquemia in vivo en modelos de ratones transgénicos. El beneficio obvio para el uso de este enfoque en vivo es que permite el estudio de la lesión isquémica en las redes neuronales intactos y la respuesta del comportamiento post-insulto, además de los procesos neuroinflamatorios que están presentes después de la lesión isquémica. Por lo tanto, esta en el modelo de derrame cerebral in vivo constituye un método complementario importante en los modelos in situ que se utilizan para imitar la isquemia en cultivos celulares.