Tillämpningen av permanenta Mellanöstern Cerebral Artery Ligation i musen

Summary

Middle cerebral artär (MCA) ligatur är en teknik för att studera fokal cerebral ischemi i djurmodeller. I denna metod är den mellersta cerebral artär exponeras genom kraniotomi och knyts ihop med kauterisation. Denna metod ger mycket reproducerbar infarkt volymer och ökad postoperativ överlevnad jämfört med andra tillgängliga metoder.

Abstract

Fokal cerebral ischemi är bland de vanligaste typen av stroke hos patienter. På grund av den kliniska betydelsen det har varit en långvarig insats för att utveckla lämpliga djurmodeller för att studera de händelser som utvecklas under ischemisk förolämpning. Dessa tekniker inkluderar övergående eller permanent, fokal eller global ischemi modeller med hjälp av många olika djurmodeller, med de vanligaste är gnagare.

Den permanenta MCA ligation metod som också är kallad pMCAo i litteraturen används i stor utsträckning som en central ischemi modell i gnagare ^1-6. Denna metod beskrevs för råttor av Tamura et al. 1981 ^7. I detta protokoll ett kraniotomi användes för att få tillgång till MCA och den proximala regionerna blockerad av electrocoagulation. Den infarkter innebär oftast kortikal och ibland striatala regioner beroende på var i ocklusion. Denna teknik är nu väl etablerad och används i många laboratorier ^8-13. Tidig användning av denna teknik har lett till definition och beskrivning av "infarkt kärna" och "Penumbra" ^14-16, och det är ofta används för att utvärdera potentiella nervskyddande föreningar ^{10, 12, 13, 17.} Även om de inledande studierna utfördes på råttor, har permanent MCA ligation använts framgångsrikt i möss med smärre ändringar ^18-20.

Denna modell ger reproducerbara infarkter och ökade efter överlevnad. Ungefär 80% av ischemisk stroke hos människor hända i MCA området ²¹ och därmed detta är en mycket relevant modell för stroke studier. För närvarande finns det en brist på effektiva behandlingar tillgängliga för strokepatienter, och det finns därför ett behov av bra modeller för att testa eventuella farmakologiska substanser och utvärdera fysiologiska resultat. Denna metod kan också användas för att studera intracellulära mekanismer hypoxi svar in vivo.

Här presenterar vi MCA ligation operation i ett C57/BL6 mus. Vi beskriver före kirurgisk förberedelse, MCA ligation kirurgi och 2,3,5 Triphenyltetrazolium klorid (TTC) färgning för kvantifiering av infarkt volymer.

Protocol

Detta protokoll godkändes av University of Rochester kommitté ägnas åt etiska användningen av djur i forskning (UCAR). Aseptisk teknik bör följas under protokollet. Användning av sterila handskar och en mask krävs.

All utrustning, material, kemikalier och verktyg som används under protokollet beskrivs i tabell 1.

1. Pre-kirurgisk förberedelse

1. Injicera möss subkutant med buprenorfin (0,05 mg) 2 timmar före operation, direkt efter operationen och därefter var 3-5 timme under de första 24 timmar postoperativt.
2. Sterilisera alla kirurgiska instrument, svampar gasväv och bomull applikatorer spetsen av autoklav. Håll kirurgiska instrument i 70% etanol under operationen och lufttorka om steril gasbinda höger före användning. Spraya arbetsområdet med 70% etanol.
3. Bedöva musen med en 3% isofluorane-20% syre gasblandning med hjälp av ett bedövningsmedel förångaren. Justera syre belopp med flödesmätaren. Testa nivå av anestesi genom tå eller svans nyper (de bör inte svarar). Upprätthålla nivån på anestesi med 2% (v / v) isofluorane.
4. Ge konstgjord tårar musens ögon och försiktig för att undvika skador på ögat under det kirurgiska ingreppet. Placera musen på dess högra sida i ett sidoläge.
5. Raka området på vänster sida mellan vänster öga och basen på vänster öra med djuret Clippers. Rengör området genom att växla mellan en Betadine lösning och 70% etanol med hjälp av applikatorer bomull spets och lätt gnugga området. Upprepa vid behov.
6. Placera musen på en värmedyna ansluten till en rektal sond för att upprätthålla kroppstemperaturen vid 37 ° C. Sätt rektala sonden med hjälp av mineralolja.
7. Placera musen på dess högra sida under mikroskop och säkra med tejp. Skär ett fönster i en gasbinda svamp och täcker operationsområdet.

2. Kirurgiska ingrepp och MCA Ligation

1. Gör ett vertikalt snitt mellan vänster öga och basen på vänster öra genom att använda fina raka sax. Använd böjda peanger att hålla operationsområdet öppen.
2. Gör ett horisontellt snitt om tidsperioder muskeln genom att använda vår sax och en aning separera tinningsmusklerna från skallen genom att långsamt dra med pincett.
3. Gör en liten subtemporal kraniotomi i korsningen zygomatic båge och squamosal ben genom att använda en 18G nål medan du håller käkbenet med böjda pincett.
4. Exponera MCA genom att ta bort små bitar av skallen med ben rongeurs. Den zygomatic båge och omloppsbanor innehåll bör inte skadas under denna process. Om stark uttorkning av vävnad sker under denna process, tillämpa sterila PBS med applikatorer bomull spets.
5. Ligate den distala delen av MCA med hjälp av en liten fartyg cauterizer.
6. Placera tinningsmusklerna tillbaka till sitt ursprungliga läge och stäng snitt platsen med kirurgiska 5-0 nylon suturer.
7. Avbryt anestesi och ta bort den rektala sonden. Injicera musen med en 2: a dosen av buprenorfin (0,05 mg) subkutant. Återgå musen till buren, som hölls vid 37 ° C med en värme-panel.
8. Noga övervaka musen för nästa 24 h för något obehag (minskad aptit / vattenförbrukning, krökt kroppshållning, ökad andning, Pilo-uppfördes hår). Injicera musen med buprenorfin subkutant var 3-5 timmar efter operationen upp till 24h. Ge musen med återhämtningen gel under denna period.

3. TTC färgning och Fastställande av slagvolymen

1. Tjugofyra timmar efter operationen djupt söva musen transcardially BEGJUTA musen med en 4% TTC (w / v) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i 15 min och sedan med en 4% paraformaldehyd lösningen i 10 min med hjälp av en mini peristaltiska pumpen på medelhög flöde. Ta bort hjärnan och placera den i 4% paraformaldehyd lösning över natten.
2. Placera hjärnan i snittning blocket. Skiva hjärnan i 1 mm tjocka skivor med hjälp av rakblad.
3. Lägg skivorna bredvid en millimeter skala härskare. Fotografera skivor med hjälp av en digitalkamera är ansluten till dissekera mikroskop.
4. Beräkna stroke området genom att subtrahera den icke-infarktområdet av ipsilaterala webbplats från den totala arealen av den kontralaterala webbplats med hjälp av Image J Software (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Beräkna slagvolymen genom att stapla slaget området i skivor ^22.

4. Vägbeskrivning att använda Image J

1. Öppna bildfilen som skall analyseras i bild J-programvara genom att klicka på Arkiv-menyn.
2. Klicka på "räta linjen"-fliken i programmet. Rita en rak linje mellan de två marginaler på linjalen. Klicka på "analysera"-menyn och välj "Set skala". Ställ känd sträcka som 1, längdenhet som mm.
3. Klicka på "frihand cirkel"-fliken. Rita en cirkel för att beskriva de kontralaterala hemisfären. Klicka på "analysera" menyn och välj "åtgärd". Beräkningen fönster kommer att dyka upp som visar området den ritade cirkeln.
4. Rita en annan cirkel runt den ipsilaterala halvklotet med undantag för stroke (vit)-området. Mät området som anges i steg 4,3. Det nya värdet läggs till beräkningen fönster. Skillnaden mellan 1 och 2 värden representerar det område av infarkt som anges som A i formeln nedan.
5. Beräkna stroke område i varje skiva genom att upprepa steg 4,2-4,4. Ta summering av stroke området beräknas i varje skiva (ΣA _n). Detta är slagvolymen vet att tjockleken på varje skiva är 1mm.
   ΣA _n x 1 mm (tjockleken på varje skiva) = Slagvolym

5. Representativa resultat:

Den infarkter erhålls genom permanenta MCA ligation i musen är oftast kortikal. Det är dock möjligt att få subkortikala lesioner om MCA är knyts ihop proximalt om lenticulostriate grenen. Stroke volymerna efter MCA ligation kan variera från 10 mm ³ 35 mm ³ ^{19, 23.} Stroke volymerna beräknas med TTC färgning i Moyanova et al. ¹⁹ är mellan 10 mm ³ till 22 mm ³ medan stroke volymerna bestäms av MRT-bilder i Filiano et al ²³ är mellan 20 mm ³ till 35 mm ³. Den möjlig orsak till dessa skillnader kanske den exakta placeringen av ligation och de olika metoder som används för att mäta stroke volymer.

I Figur 1 är en TTC betsad hjärna 24 timmar efter permanent MCA ligation i en vild typ C57/BL6 mus visas. Det stroke webbplats är vit i utseende (Fig. 1A, B). Figur 1A och B illustrera infarkt platsen från olika vinklar. Figur 2 visar 1 mm tjocka skivor TTC färgade stroke hjärnan från främre till bakre (bild 2A-G). Infarkt volym beräknades 24 timmar efter kirurgi. Volymen på infarkt är ~ 23mm ³.

Figur 1. Representation av stroke webbplats. AB, färgade TTC hela hjärnan bilder, 24 timmar efter MCA ligatur. Vita området representerar infarkt.

Figur 2. Representativa resultat. (A> G), TTC färgade 1mm hjärnan sektioner, 24 timmar efter Mcal. Skivor är i linje från främre till bakre. Vita området representerar infarkt.

Discussion

Den permanenta MCA ligation metod ger mycket reproducerbar infarkt volymer och ökad postoperativ överlevnad jämfört med andra tillgängliga metoder. Enkelheten och den korta tid (~ 30 min) av förfarandet göra det ännu mer praktiskt. Metoden används flitigt i både möss och råttor.

Denna teknik kräver en invasiv kirurgi under ett stereomikroskop. Därför är erfarenhet från drift under ett mikroskop och finslipa en lyckad kraniotomi viktigt. Det är bäst att etablera konsekventa infarkter i labbet innan experimenten utförs. För att uppnå reproducerbara resultat är det viktigt att ligate MCA på exakt samma plats varje gång. MCA bör knyts ihop proximalt lenticulostriate grenar om subkortikala infarkter önskas. Artären är helt knyts ihop och ocklusion är permanent. Därför denna modell inte tillåter reperfusion via MCA. Även om det inte ingår i denna demonstration, är det bäst om ett Doppler sonden används för att mäta blodflödet i det drabbade området för att se komplett ligation i artären.

Operatören bör vara mycket noga med att inte skada eller punktera MCA men utsatte och koagulerar artären. Kraniotomi bör utföras med stor omsorg för att förhindra skador på zygomatic ben. Eftersom kirurgiska området är mycket nära till infarkt området, bör varje skada på kortikala ytan undvikas under kraniotomi eller kauterisation. FST 18.015-00 cateurizer enhet eller en bipolär cateurizer kan användas i stället för FST 18.000-00 som används i denna demonstration. FST 18.015-00 tillåter användaren att justera temperaturen i cauterizer tips till låg värme som kan förhindra skador på hjärnbarken vävnad. FST 18.015-00 undviker också de temperaturvariationer sett i batteridrivna BRÄNNING verktyg. Under BRÄNNING bör användaren vara mycket noga med att hålla cauterizer ur flödet av syre och kan tillfälligt stänga av O ₂ / isofluorane att undvika risk för antändning. Detta kommer inte att påverka anestesi tillståndet i musen. För att förhindra denna risk använder vi ett ventilationsrör utvidgas till operationsområdet vilket ökar luftcirkulationen tillräckligt, samt drar av överflödig O ₂ / isofluorane i luften.

Den permanenta MCA ligation Modellen är mycket användbar för att studera ischemisk stroke. Den kan användas för att testa neuroprotectants eller studera molekylära mekanismer för ischemi in vivo på transgena musmodeller. Den uppenbara fördelen för användning av denna in vivo synsätt är att detta gör det möjligt för studier av ischemisk förolämpning på intakt neuronala nätverk och beteendemässiga reaktion efter förolämpning, utöver de neuroinflammatoriska processer som finns efter ischemisk skada. Därför Detta in vivo stroke modell ger en kritisk komplement till på plats modeller som används för att efterlikna ischemi i cellkultur.