1. Craniectomy 무균 수술 사이트는 수술 중에 isoflurane의 지속적인 흡입 수 있도록 O 2 플러시 (파클랜드 과학)과 마취 기계에 연결된 마우스 가스 마취 머리 홀더 (Kopf 인 스트 루먼트)와 마우스에 대한 stereotaxic 정렬 악기 (Kopf 악기)를 포함 준비가되어 있습니다 . C가 수술하는 동안 마우스를 아래에 배치됩니다 ° 온난 패드 37 있었죠. 수술 현미경 및 광원이 필요합니다. 실험자들은 다루는 실험실 외투, 수술 마스크, 발 커버, 장갑, 그리고 머리를 착용해야합니다. 외과 사이트에 문의 모든 도구와 자료는 소독해야합니다. Luer – 록의 여성 끝에 구성된 부상 허브, 면도날과 ½ "바늘 (백톤 디킨슨). 허브는 약간의 편견과 절단해야 20g 1의 금속 끝을 잘라 만든 것입니다 약 3mm 내경 오픈되어 있습니다. trephine는 (단계 1.10 참조) 정확한 직경의 부상 허브를 측정하고 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 한 허브 동물마다 필요합니다. 허브는 두개골에 붙어 LFP로 연결됩니다 압력의 펄스를 제공하는 장치. 솔리드 나일론 코드 (1.7 mm 직경 예 비드 트리머 라인)은 면도날을 사용하여 ~ 1mm 두께의 디스크로 절단됩니다. 다시 말하지만, 하나의 디스크는 동물마다 필요합니다. 이것은 (단계 1.10 참조) craniectomy을 수행하는 동안 trephine을 안정화하는 데 사용됩니다. 마우스는 어떤 변형과 연령 (- 9개월 우리가 주로 C57BL / 6 세 1을 사용)의 수 있습니다. 마우스는 최소한 1 분 작은 유도 챔버 (100 % O 2에 isoflurane 4~5% 사전 가득한)의 무게와 anesthetized입니다. 선제 진통제 들어, buprenorphrine (0.1 밀리그램 / kg)의 주사가 intraperitoneally 부여되고 마우스가 다른 잠시 동안 의회에 다시 배치됩니다. 진통제 처방은 지역 동물 사용 및 관리위원회와 협의하여 확정한다. 마우스의 머리 위에 머리는 가능한 한 피부에 가까운 손질합니다. 마우스는 휘발성 가스 마취 (Kopf 인 스트 루먼트)를 관리하기위한 입 도금 장착되어 stereotaxic 정렬 악기에 위치합니다. isoflurane 가스의 수준은 2 %이나 효과 줄어 듭니다. 호흡 속도는 수술 중에 시각 모니터입니다. 이러한 혈액 가스와 같은 다른 생리적 매개 변수 (P O 2, P CO 2), 혈액 산도이나 혈압이 절차를 수행하는 동안 해당 장비를 사용하여 측정할 수 있습니다. 인공 눈물 윤활유 아이 연고는 건조에서 그들을 유지하는 면으로 된 작은 주걱을 사용하여 마우스의 눈에 들어가게된다. Povidone – 요오드는 70 % 알콜 다음 면화 작은 주걱으로 눈을와 목 사이를 피부에 적용됩니다. povidone – 요오드와 알코올의 응용 프로그램은 3 회 총 반복됩니다. 정중선 두피 절개는 두개골을 노출하고 명확한 외과 필드를 제공하는 작은 불독 겸자 철회 메스 (# 15 블레이드)와 피부 (파인 과학 도구 # 18050-28)를 사용하여 눈을에서 목에 이루어집니다. 불독 클램프는 두개골의 측면 가장자리를 끊지. 국소 마취 bupivacaine (호수의 0.025 %)은 면화 작은 주걱과 근막이 치과 도구나 뼈 스크레이퍼 (예 : 파인 과학 도구, # 10075-16)의 팁과 두개골에서 스크랩한 것입니다로 두개골에 적용됩니다. 영구 마커는 중간 bregma과 람다 사이 오른쪽 뇌를 (정중선의 오른쪽 ~ 2 ㎜) 이상의 화살 봉합과 측면 능선 사이의 두개골을 표시하는 데 사용됩니다. Loctite cyanoacrylate 접착제 (Loctite 탁 박 454)의 드롭은 보트 측면 쥐고 집게 (파인 과학 도구, 더몬트 # 6)에 비드 견고한 나일론 코드의 디스크를 (위의 1.3 참조) 수영하는 데 사용되는 무게는 플라스틱에 들어가게된다 다음 접착제하고 두개골에있는 지시에 따라 디스크를 누르십시오. Loctite 가속기 중 하나에 두 방울은 접착제의 경화를 일으킬 수있는 1ml 주사기와 26 3 / 8 G 바늘을 사용하여 디스크의 상단에 전달됩니다. 진행하기 전에 두개골에 디스크의 테스트 부착. 디스크에 비해 3mm 외경 trephine을 (연구 계측 쇼핑, 펜실베니아 대학) 장소 및 두개골을 통과하여 갈 때까지 시계 방향으로 회전. 너무 멀리 두개골과 위배 두라에 책임을 피하기 위해 자주 trephine의 진행 상황을 확인합니다. 가볍게 눌렀을 때 디스크와 두개골 플랩의 주위에 두개골이 얇아은 자유롭게 느낄 것이다있을 것이다. 두개골 아래 놀리려는과 뼈가 플랩을 세운 치과 도구 병렬 / 두개골의 표면에 수평 놓습니다. 포셉와 두개골의 뼈를 분리합니다. 두라의 손상없이 출혈의 작은 금액이있다면 출혈이 중지되고 두라에 얻는 뼈 먼지를 방지 때까지 압력을 적용하는 면으로 된 작은 주걱을 사용합니다. 이러한 것을 헤르 니아가되는 것을 볼 수있는 두라에 위반이있는 경우 그러나, 동물은 인간 안락사에 의해 실험에서 제거되어야합니다. 이 단계는 충분한 연습이 필요필요한 수술 기술을 달성하기 위해. 허브의 바이어스가 두개골 (예 : 허브의 긴 가장자리는 두개골의 측면 능선 근처에 자리잡고 있습니다)의 곡률에 부합되도록 집게를 사용하여 두개골의 craniectomy 이상의 위치에 부상 허브를 유지합니다. 한편, 날카로운 팁을 가지고 면도날과 각도로 절단 나무 막대기를 사용, 그 반대 손으로 허브의 외부 가장자리 주위에 슈퍼 접착제 젤을 적용하고이 구멍을 통해 수직으로 부착된 때까지 허브를 안정화. 케어는 두라 위에 접착제를하지 않도록해야합니다. 두라에 접착제가 부상의 감쇄가 발생합니다. 작은 종이컵을 사용하여 점성 솔루션을 만들 수 메틸 메타 크릴 레이트 – 아크릴 치과 (펌의 Reline / 수리 수지, 버틀러 Schein과 제트 아크릴 액체)를 섞는다. 모든 부상 허브 주위에 시멘트를 적용하는 부착없이 바늘로 1 CC의 주사기를 사용합니다. 시멘트는 부상 허브의 하단 2mm뿐만 아니라 주변 노출된 두개골을 커버한다. 두개골의 봉합은 부상에서 유체 볼러스이 두개골 구멍 안에 남아 있도록 시멘트로 봉쇄하고 있습니다. 주사기와 바늘을 사용하여 무딘 멸균 0.9 % NaCl (염분)과 허브를 입력합니다. 호수가 복구 단계 동안 두라의 촉촉한을 유지합니다. 또한, 부상 허브가 가득 체류하지 않는 경우, 두개골에 허브 연결 누수를 나타내는 것입니다 새로운 허브가 첨부되어야합니다. 마우스는 stereotaxic 정렬 기기에서 제거하고 온난 화 접시에 노 와이어 바 뚜껑이있는 빈 새장에 배치 멸균 생리 IP의 0.25 ML 사출을 부여해야합니다. 새장 바닥에 몇 hydragel을 놓고 쥐가 1-2 시간 동안 복구할 수 있습니다. 2. 부상 유도 LFP 장치에 연결되어있는 오실로 스코프 (텍트로닉스 TDS 1001B, 두 채널 Digi 스토리지 오실로 스코프 40 MHz 이상, 500Ms.s) 및 앰프 (외상 유도 압력 변환기 증폭기)를 켭니다. LFP 장치 (사용자 정의 설계 및 제작, 버지니아 커먼 웰스 대학)와 그것에 연결된 고압 튜브가 (길이 41cm, 볼륨 2ml, 백스터 # 2C5643) 멸균 물을 채워 공기 방울 무료입니다 있는지 확인합니다. 튜브의 끝에 남성 Luer – 록의 조각입니다. 튜빙의 Luer – 록의 끝이 닫힌 상태에서 진자를 발표하여 테스트 펄스를 제공합니다. 장치는 약 10 테스트 펄스를 제공함으로써 끝났다해야합니다. 그 진자는 오실로 스코프와 앰프에 부드러운 신호를 제공합니다 확인합니다. 시끄러운 신호가 부상 펄스를 전달하기 전에 제거해야합니다 시스템에서 공기를 나타냅니다. 펄스의 기간은 약 20 밀리초해야합니다. LFP 장치와 함께 제공된 변환기 증폭기는 교정과 같은 것을 10 MV = 평방 인치 당 1.0 파운드 (PSI). 한 분위기 (ATM) = 14.7 PSI. 반사 시간과 폐 부종과 관련된 사망률 증가를 righting의 범위를 생산하기 위해 2.1 대기 – 전달 부상 압력은 0.9의 범위에 일반적으로있다. 4 분 및 0 – – 5 %의 사망률 가벼운 부상은 2 righting 반사 시간으로 간주됩니다. 10 분 및 10 – – 20 %의 사망률 보통 부상은 6 righting 반사 시간으로 간주됩니다. 필요한 경우, 펄스의 강도를 증가 또는 감소로 진자의 각도를 조정합니다. 진자의 시작 위치의 각도가 약 10도 정도입니다. LFP 장치를 조정 후, 튜브의 Luer – 록 엔드를 열고해야합니다. 마우스는 마취 수술 비행기에 도달할 때까지 4~5% isoflurane 마취 챔버 (미리 유료)에 배치됩니다. 마우스는 LFP 장치 옆에 플랫폼에 배치되고 허브 멸균 식염수로 가득합니다. 남성 Luer – 록과 LFP 장치의 튜브는 허브의 여성 Luer – 록 피팅에 첨부되어 있습니다. 동물은 그 옆에 한 번 정상적인 호흡 패턴 이력서에 위치하지만 이전에 완전한 의식 (~ 2 분) 회복 동물로, LFP 장치의 진자는 부상의 단일 펄스를 발생 배포되고 있습니다. 그것이 호흡과 죽음을 일으킬 수로 동물도 anesthetized있는 동안 그것은 부상을 유발하지 않는 것이 중요합니다. 펄스의 정확한 압력이 기록되어야합니다. 손상되지 않은, 가짜 동물은 부상을 유발하는 실제 유체 펄스의 예외와 동일한 절차를 모두 받고있다. 동물은 즉시 LFP 장치에서 제거하고 righting 반사 시간을 모니터하기 위해 뒷면에 배치해야합니다. 마우스 자체를 righted 후 다시 다음 잠시 anesthetized 있으며, 시멘트와 허브는 손으로 두개골에서 함께 삭제되었습니다. 두피는 다음 Vetbond 조직 접착제 (3M), 봉합 또는 스테이플과 함께 닫힙니다. 허브의 두라이나 폐색의 헤르 니아가되는 것이 기록됩니다. occluded 허브 알 수없는 크기의 감쇠 부상을 생산합니다. 다음 외래와는 홈 케이지에 반환 때까지 동물은 온난 패드에있는 새장에 다시 배치됩니다. 3. 모터의 평가,인지 및 histological 결과 MOLFP에 의한 토르 적자는 rotarod 테스트, 통합 vestibulomotor 및 sensorimotor 기능 21 지표를 사용하여 결정하실 수 있습니다. 모든 동물은 기본적인 독서를 결정하고 패러다임에 쥐를 적응하기 전에 부상을 테스트해야합니다. 생쥐 전에 부상으로 이틀 동안 1 시간 간격으로 intertrial rotarod 장치에 하루 3 번 훈련하고 있습니다. 고무 표면이있는 36 mm 외경, 회전 막대에 균형을 지연이 측정됩니다. 속도가 180 초 이상의 간격 4-40 RPM에서 증가합니다. 동물 rotarod를 될때 각각의 재판은 끝납니다. 상해 (일반적으로 1, 7 21 일) 다음과 같은 서로 다른 시간 시점에서, 생쥐는 다시 rotarod 장치에 테스트됩니다. 부상 후 rotarod 시험의 평가들은 기본 대기 시간 22 상대적으로 개별 점수를 기준으로합니다. 부상 마우스의 가을에 평균 대기 시간은 가짜 마우스의 비교입니다. 인지 기능을 다음과 LFP는 모리스 워터 미로 (MWM), 설치류 23 외상후 공간 학습과 작업 메모리의 민감한 측정을 사용하여 마우스 별도의 세트에 테스트하실 수 있습니다. 생쥐는 패러다임에 acclimated 4 일 이전 상해에 보이는 플랫폼 테스트를 사용하여 기본적인 응답을 테스트하고 있습니다. 흰색 원형 수영장이 (1m 직경) 물, 무독성 흰색 페인트로 가득합니다. 플랫폼은 벽에있는 깃발이나 마커없이 시각적 단서를 사용하여 볼 수 이루어집니다. 네 시련 동안 마우스가 보이는 플랫폼의 반대 사분면에 위치하고, 플랫폼을 찾기 위해 대기 시간이 측정됩니다. 최대 시험 시간은 60 초이며 마우스는 남아 각 시험의 끝에서 15 초에 대한 플랫폼에 배치됩니다. intertrial 간격은 마우스가 가열 패드를 따뜻하게하는 동안 5 분입니다. 플랫폼은 각각의 재판에 대해 다른 사분면으로 이동하고 네번이나 재판이 수행됩니다. 학습 평가하기 위해 생쥐는 상해 (일반적으로 1, 7 21 일) 다음과 같은 여러 시간 지점 4 quadrants 중 하나에 고정 숨겨진 플랫폼을 사용하여 MWM에서 훈련을하고 있습니다. 흑백 신호는 벽면에 표시됩니다. 마우스가 배치되는 사분면은 pseudorandomly 플랫폼 기록됩니다 찾습니다 훈련과 시간에 걸쳐 다양합니다. 최대 시험 시간은 60 초이며 마우스는 남아 15 초에 대한 플랫폼에 위치하고 실험 사이에 5 분 예열합니다. 마우스는 3 일 연속 8 재판 / 일를 받게됩니다. 메모리 보존을 평가하기 위해 동물은 마지막 훈련 다음날 60 초 프로브 재판을 받게됩니다. 프로브 재판이 진행되는 동안,이 플랫폼은 시간 소비와 플랫폼으로 사용하는 사분면에있는 거리까지 수영을 결정하기 위해 제거됩니다. 마지막으로, 눈에 띄는 플랫폼 테스트는 가능한 모터와 사후 부상을 개발 시각 결손을 배제하기위한 것입니다. LFP 부상 histological 결과를 확인하려면, 조직은 NaCl이 부상 후 원하는 시간 지점에서 4 % paraformaldehyde 다음 0.9 %에서 intracardial 재관류에 의해 고정됩니다. 조직은 4 박 postfixed 있습니다 ° C 그리고 10 % cryoprotected 30 %의 자당 및 삽입 솔루션입니다. 냉동 시리얼 섹션은 그라 이오 스탯에 상처 다양한 immuohistochemical 및 histological 기술을 이용하여 처리됩니다. 4. 대표 결과 : LFP 장치에 의해 유도 부상은 특히 충분한 수술 훈련, 동물에서 동물로 재현할 수있다. 부상의 일관성을 유지하기 위해 장치에 의해 두라로 전달 압력의 크기는 모니터입니다. 진자는 동물에 craniectomy 사이트 (그림 1A)에 부착된 부상 허브에 연결된 고압 튜브 및 Luer – 록 피팅과 물이 채워진 아크릴 실린더를 친다. 2.1 ATM 및 증폭기에 연결된 오실로 스코프는 압력 펄스 (그림 1B)를 시각화하는 데 사용됩니다 – 상해를 운영 가벼운 들어, 진자의 각도는 0.9에 이르는 압력을 생성하도록 설정되어 있습니다. 부상 반응 시간과 폐 부종과 관련된 사망률 증가를 righting의 범위를 생산하고 있습니다. 4 분 및 0 – – 5 %의 사망률 가벼운 부상은 2 righting 반사 시간으로 간주됩니다. 10 분 및 10 – – 20 %의 사망률 보통 부상은 6 righting 반사 시간으로 간주됩니다. 또한, LFP의 대상이 생쥐는 발작을 나타내는 수 있습니다 토닉 허세가 발생할 수 있습니다. 발작은 종종 손상된 두라와 연결되어 있습니다. 함께,이 결과는 부상이 신경 손상을 일으키는 것을 권해드립니다. 섐 동물은 LFP 장치에 연결되어 있지만 진자는 공개되지 않습니다. LFP에 의해 유발되는 피해를 시각화하기 위해, 우리는 astrocytes 및 부상에 대한 반응과 관련된 세포 유형 둘 중 macrophages을 인식 항체를 사용하여 immunocytochemistry을 수행했습니다. Glial Fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 얼룩이 부상 무의 지역에서 피질 전반에 걸쳐 증가 gliosis를 보여ereas 위장 마우스 craniectomy 아래에 해당 사이트 (그림 2A, B)에서 증가 astrocytosis를 표시하지 않습니다. 마찬가지로, MAC1 얼룩은 위장 수술의 대상이 생쥐에 비해 부상의 사이트를 둘러싼 많은 macrophages을 보여줍니다. 또한,하지만 가짜 생쥐 (그림 2C, D)에 LFP의 대상이 생쥐에서 볼 수 피질 조직에 자주 물리적 손상이 있습니다. 가벼운 LFP 다음과 같은 행동 테스트는인지와 모터 결과 모두를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. MWM은 학습과 기억에 영향을 결정하는 데 사용됩니다. 테스트 룸에서 영상 신호를 사용하여 위장 마우스는 급속하게 물 미로 훈련의 각 후속 하루 플랫폼의 위치를보다 효율적으로되었다. 가벼운 LFP 대상이 마우스는하지만 세 번째 날 (그림 3A)에 의해 작업을 배울 수 표시 위장으로 마우스를 기준으로 테스트의 첫 두 일 숨겨진 플랫폼을 찾을 오래 걸립니다. 이러한 결과는 부상이 생쥐는 공간 학습을 얻을 수있는 속도를 줄일 것을 권장합니다. 메모리 보존에 부상의 효과를 확인하려면 프로브 재판은 마지막 훈련 후 일일 수행됩니다. 위장 마우스는 부상이 플랫폼 (그림 3B) 거주하는 데 사용되는 장소를 기억하기 위해 생쥐의 능력에 영향을 것을 제안 가벼운 LFP의 대상이 생쥐와 비교하여 대상 사분면에 더 많은 시간을 보냅니다. 전위의 기능을 평가하기 위해, 생쥐는 rotarod 장치에 테스트됩니다. 가벼운 LFP 대상이 마우스는 1, 7 21 일 게시 부상 (DPI) (그림 3C)에서 가짜 마우스에 비해 가을 짧은 평균 지연 시간이 있습니다. 이러한 데이터는 부상 쥐가 통합 vestibulomotor 및 sensorimotor 기능 장애가하는 것이 좋습니다. 그림 1. LFP 장치와 부상 중 얻은 오실로 스코프에서 대표 추적. A) LFP 장치의 구성 요소는 다음과 같습니다 진자는 원하는 힘, 고압 관과 연결된 남성 Luer – 록 피팅, 증폭기와 아크릴 실린더를 가득 물을 전달하기 위해 미리 정해진 각도에 서서 설정 고정 그리고 오실로 스코프. 오실로 스코프에서 압력 펄스의 B) 대표 추적. 피크 – 투 – 피크 값을 1.47 ATM의 압력을 나타내는 2.16 볼트이다. 그림 2. LFP 다음과 같은 향상된 gliosis 및 염증 반응은 부상의 범위를 보여줍니다. 가짜 수술 (A, C) 또는 LFP 상해 (B, D) 7 일 포스트 부상 (DPI)의 대상이 마우스의 두뇌를 통해 얼어붙은 가로 섹션 (20μm). 대뇌 피질의 이미지는 craniectomy의 중심지에서 찍은 있습니다. (A, B) 조직은 astrocytes을 식별하는 항체 물들일 것입니다. Glial Fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 항체 (MAB360, Chemicon, 1:400)는 위장 수술에 비해 LFP 부상 (화살표)의 대상이 마우스의 피질에 걸쳐 astrocytes 높은 숫자를 보여줍니다. 이차 항체 염소 방지 마우스 594 (1:1000)입니다. (C. D) 조직은 macrophages을 식별하는 항체 물들일 것입니다. MAC1 항체 (MAC1 – 알파 체인 CD11b, BD Biosciences, 1시 50분)는 가짜 수술에 비해 피질 (화살표)에서 부상의 사이트의 주위에 더 많은 macrophges 및 / 또는 활성화 microglia을 보여줍니다. 이차 항체 염소 안티 쥐 CY3 (1시 50분)입니다. C와 D. A와 B, 100μm의 스케일 바 = 200μm 그림 3. 온화한 LFP 다음과 같은 행동 테스트 가짜 마우스에 비해 부상의 적자를 보여줍니다. A) 가벼운 LFP 대상이 마우스는 가짜 마우스보다 MWM의 플랫폼을 찾는 작업을 배울 오래 걸립니다. 섐 VS LFP (아베 초 ± SEM) 일일 34.21 ± 3.02 VS 38.64 ± 2.63; 이일 24.52 ± 2.84 VS 27.21 ± 2.11, 삼일 22.47 ± 2.00 VS 22.08 ± 2.52 (1 DPI, N = 9 사기, 10 LFP) . B) 가벼운 LFP 대상이 마우스는 가짜 마우스 (21 DPI, 여기서 n은 = 10)로 MWM 상대의 마지막 훈련 후 프로브 재판 24 시간 동안 대상 사분면에있는 더 적은 시간을 보내고. C) 가벼운 LFP를 받게 마우스 빨리 rotarod 장치 떨어지 사기 마우스보다 (1, 7, 21 DPI, N = 5 체하다, 8 LFP). 오류 바 SE를 나타냅니다.