1. Craniectomie Un site chirurgical stérile est préparé, y compris un instrument d'alignement stéréotaxique (Kopf Instruments) pour les souris avec un support de la souris gaz de tête anesthésie (Kopf Instruments) relié à un appareil d'anesthésie avec O 2 flush (Parkland scientifique) afin de permettre l'inhalation continue de l'isoflurane pendant la chirurgie . Un pad réchauffement maintenue à 37 ° C est placé sous la souris pendant la chirurgie. Un microscope chirurgical et source de lumière est nécessaire. L'expérimentateur doit porter une blouse, un masque chirurgical, couvrant le pied, des gants et couvre-chef. Tous les outils et matériaux que le contact du site opératoire doivent être stérilisés. Un concentrateur blessure, composé de l'extrémité femelle d'un Luer-Lok, est créé en coupant le bout de métal d'un 20 g 1 ½ "aiguille (Becton Dickinson) avec une lame de rasoir. Le moyeu doit être coupé avec un léger biais et de avoir une ouverture de diamètre d'environ 3mm intérieure. Le trépan (voir l'étape 1.10) peut être utilisé pour mesurer et fabriquer une plaque tournante des blessures du diamètre correct. Un hub est nécessaire par animal. Le hub sera fixé au crâne et relié à la LFP appareil pour qu'il délivre le pouls de la pression. Corde de nylon solide (1,7 mm de diamètre, par exemple, la ligne débroussailleuse) est coupé en ~ 1 mm d'épaisseur des disques en utilisant une lame de rasoir. Encore une fois, un disque est nécessaire par animal. Ceci est utilisé pour stabiliser le trépan dans l'exercice de la craniectomie (voir l'étape 1.10). Les souris peuvent être de toute souche et l'âge (nous utilisons principalement des C57BL / 6 âgés de 1 – 9 mois). La souris est pesé et anesthésiés dans une chambre d'induction de petite taille (pré-rempli avec 4-5% d'isoflurane dans 100% d'O 2) pour au moins 1 minute. Pour l'analgésie préventive, une injection de buprenorphrine (0,1 mg / kg) est administrée par voie intrapéritonéale et de la souris est placée de nouveau dans la chambre pour une autre minute. Traitement antalgique doit être confirmé par une consultation avec l'utilisation d'animaux locaux et le comité de soins. Les cheveux sur le dessus de la tête de la souris est paré au plus près à la peau que possible. La souris est positionné dans un instrument d'alignement stéréotaxique équipé mordent plaqué conçu pour administrer une anesthésie de gaz volatils (Kopf Instruments). Le niveau du gaz isoflurane est réduit à 2% ou à effet. Le rythme respiratoire est contrôlé visuellement pendant la chirurgie. D'autres paramètres physiologiques tels que les gaz du sang (p O 2, p CO 2), le pH du sang ou la tension artérielle peut être mesurée en utilisant un équipement approprié lors de la procédure. Artificial onguent larmes des yeux lubrifiant est mis sur les yeux de la souris en utilisant un applicateur de coton pour les empêcher de sécher. Povidone-iode est appliqué sur la peau entre les yeux et le cou avec un coton suivie par 70% d'alcool. L'application de povidone-iode et d'alcool est répétée pour un total de 3 fois. Une incision du cuir chevelu médiane est faite à partir des yeux à la nuque à l'aide d'un scalpel (lame n ° 15) et la peau rétracté avec un bulldog petits colliers (Outils Fine Science # 18050-28) pour exposer le crâne et de fournir un champ libre chirurgicale. Les pinces bulldog pendent les bords latéraux du crâne. Anesthésique topique bupivacaïne (0,025% dans une solution saline) est appliqué sur le crâne avec un applicateur en coton et le fascia est raclé du crâne avec la pointe d'outil dentaire ou d'un grattoir d'os (par exemple, outils Fine Science, # 10075-16). Un marqueur permanent est utilisé pour marquer le crâne mi-chemin entre bregma et lambda, et entre la suture sagittale et arête latérale plus l'hémisphère droit (~ 2 mm à droite de la ligne médiane). Une goutte de colle cyanoacrylate Loctite (Loctite Tak Pak 454) est mis dans un sac plastique pèsent pince bateau et secondaires de préhension (Outils Fine Science, Dumont # 6) sont utilisés pour tremper un disque de corde de nylon solide mauvaises herbes (voir 1.3 ci-dessus) dans le la colle et appuyez ensuite sur le disque sur la marque sur le crâne. Une à deux gouttes de l'accélérateur de Loctite est livré sur le dessus du disque à l'aide d'une seringue de 1ml et 26 3 / 8 G aiguilles pour provoquer le durcissement de la colle. Test de l'adhérence du disque sur le crâne avant de procéder. Placez un 3 mm de diamètre extérieur trépan (Boutique instrumentation pour la recherche, Université de Pennsylvanie) sur le disque et de spin dans le sens horaire jusqu'à ce que vous avez passé à travers le crâne. Vérifiez le progrès le trépan fréquemment pour éviter de percer trop loin dans le crâne et la rupture de la dure-mère. Il y aura un amincissement du crâne autour du périmètre du disque et le volet du crâne se sentent perdre lorsqu'il est pressé à la légère. Placez l'outil dentaires parallèle / horizontale à la surface du crâne pour faire levier sous le crâne et soulever le volet osseux en place. Détachez l'os du crâne avec une pince. S'il ya une petite quantité de sang, sans compromis de la dure-mère, utiliser un applicateur en coton pour appliquer une pression jusqu'à ce que le saignement s'arrête et empêcher la poussière d'os de pénétrer dans la dure mère. Cependant, si il ya une brèche dans la durée telle que hernie est visible, l'animal devrait être éliminé de l'expérience par euthanasie. Cette étape nécessite une pratique suffisantepour atteindre les compétences chirurgicales nécessaires. En utilisant des pinces, de maintenir la plaque tournante des blessures en position sur la craniectomie dans le crâne afin que le biais du moyeu est aligné avec la courbure du crâne (le plus long bord de la plate-forme se trouve près de l'arête latérale du crâne). En attendant, l'aide d'un bâton de bois, coupé à un angle avec une lame de rasoir pour avoir un bout pointu, appliquer le gel super glue sur les bords extérieurs du moyeu avec la main opposée et stabiliser le hub jusqu'à ce qu'il soit apposé debout sur le trou. Des précautions doivent être prises pour ne pas mettre de colle sur le dessus de la dure-mère. Glue sur la durée va provoquer une atténuation de la blessure. L'utilisation d'un gobelet en papier, mélanger méthacrylate de méthyle acrylique dentaire (liquide Jet acrylique avec Perm Reline / réparation de résine, Butler Schein) pour créer une solution visqueuse. Utiliser une seringue de 1 cc sans aiguille attachée à appliquer le ciment tout autour du carrefour des blessures. Le ciment devrait couvrir le fond 2 mm de la plaque tournante des blessures ainsi que le crâne entourant exposés. Les sutures crâniennes sont scellés avec du ciment pour s'assurer que le bol de liquide de la blessure reste dans la cavité crânienne. Remplir le moyeu avec NaCl 0,9% stérile (sérum physiologique) en utilisant une seringue et une aiguille émoussée. Les salines se conserver l'humidité dura pendant la phase de récupération. En outre, si la plaque tournante des blessures ne reste pas rempli, qui indique une fuite dans le moyeu au crâne et un nouveau pôle doit être jointe. La souris devrait être donnée d'une injection de 0,25 ml de solution saline stérile IP, retiré de l'alignement de l'instrument stéréotaxique et placé dans une cage vide sans couvercle barre de fil sur une plaque chauffante. Placez quelques HydraGel sur le fond de la cage et permettre à la souris pour récupérer pendant 1-2 heures. 2. L'induction de lésions Mettez l'oscilloscope (Tektronix TDS 1001B, deux Oscilloscope canal de stockage pièce de 40 MHz, 500Ms.s) et amplificateur (inducteur Trauma Capteur de pression amplificateur) qui est connecté à l'appareil LFP. Confirmez que le périphérique LFP (conception et la fabrication, la Virginia Commonwealth University) et le tuyau à haute pression (longueur 41cm, le volume de 2ml, Baxter # 2C5643) qui y sont connectés sont remplis d'eau stérile et exempt de bulles d'air. A la fin de la tubulure est un mâle Luer-Lok pièce. Avec la fin Luer-Lok du tube fermé, délivrer des impulsions de test en libérant le pendule. Le dispositif devrait être amorcée en fournissant environ 10 impulsions de test. Confirmer que le pendule donne le signal en douceur sur l'oscilloscope et l'amplificateur. Un signal bruyant indique air dans le système qui doit être enlevé avant la livraison de l'impulsion de blessure. La durée de l'impulsion doit être d'environ 20 ms. L'amplificateur de sonde fourni avec l'appareil est calibré LFP tels que 10 mV = 1,0 livres par pouce carré (PSI). Une atmosphère (ATM) = 14,7 PSI. Pressions blessures livrés sont typiquement dans la gamme de 0,9 à 2,1 atmosphères de produire une gamme de redressement fois réflexe et une augmentation de la mortalité associée à un œdème pulmonaire. Légère blessure est considérée comme un temps de réflexe de 2 – 4 min et un 0 – taux de mortalité de 5%. Blessures modérée est considérée comme un temps de réflexe de redressement de 6 – 10 min et 10 – taux de mortalité de 20%. Si nécessaire, ajuster l'angle du pendule pour augmenter ou diminuer l'intensité de l'impulsion. L'angle de position de départ du pendule est d'environ 10 degrés. Après réglage du dispositif LFP, assurez-vous d'ouvrir la fin Luer-Lok de la tubulure. La souris est placée dans la chambre de l'anesthésie 4-5% d'isoflurane (pré-chargés) jusqu'à ce qu'un plan chirurgical d'anesthésie est atteint. La souris est placée sur une plate-forme à côté du périphérique LFP et le moyeu est rempli de solution saline stérile. Le tube de l'appareil LFP avec un mâle Luer-Lok est attaché à la femelle Luer-Lok montage du moyeu. L'animal est placé sur le côté et une fois la normale reprend modèle de respiration, mais avant que l'animal reprendre conscience complète (~ 2 min), le pendule de l'appareil LFP est libéré pour provoquer une impulsion unique de blessure. Il est important de ne pas induire la blessure alors que l'animal est trop anesthésiés car elle pourrait provoquer une défaillance respiratoire et la mort. La pression exacte de l'impulsion doit être enregistré. Indemne, les animaux subissent imposture tous les mêmes procédures, à l'exception de l'impulsion de fluide réel pour induire une blessure. L'animal doit être immédiatement retirée de l'appareil LFP et placé sur le dos pour surveiller le temps de réflexe. Après la souris s'est redressé, il est ensuite brièvement anesthésiés à nouveau et le ciment et le moyeu enlevé en même temps à partir du crâne à la main. Le cuir chevelu est ensuite fermée par du tissu adhésif Vetbond (3M), suture ou des agrafes. Toute hernie de la dure-mère ou d'occlusion du moyeu est noté. Un concentrateur occlus va produire une blessure atténué d'une ampleur inconnue. L'animal est replacé dans la cage sur un pad réchauffement jusqu'en ambulatoires et est ensuite retourné dans sa cage à la maison. 3. Évaluation de moteur, les résultats cognitifs et histologiques Le moTor déficits causés par LFP peut être déterminé en utilisant le test de la tige tournante, un indicateur de vestibulomotor intégré et la fonction sensori-21. Tous les animaux doivent être testés avant l'accident pour déterminer une lecture de base et pour acclimater la souris au paradigme. Les souris sont formés sur le dispositif rotarod 3 fois par jour avec une heure d'intervalle intertrial pour les deux jours avant la blessure. Le temps de latence à l'équilibre sur un diamètre de 36 mm extérieur, en rotation la tige, qui a une surface en caoutchouc est mesurée. La vitesse passe de 4 à 40 tours par minute sur un intervalle de 180 sec. Chaque essai se termine lorsque l'animal tombe du rotarod. A différents moments après la blessure (typiquement de 1, 7 et 21 jours), les souris sont à nouveau testées sur le dispositif rotarod. Evaluation des tests rotarod après la blessure est basé sur les scores individuels par rapport à leur temps de latence de base 22. La latence moyenne de la chute des souris blessées est comparé à celui des souris imposture. LFP cognitive fonction suivante peut être testée sur un ensemble distinct de souris en utilisant la piscine de Morris (MWM), une mesure sensible de la mémoire post-traumatique apprentissage et de travail spatiale chez les rongeurs 23. Les souris sont acclimatées au paradigme et testées pour répondre de base en utilisant un test plateforme visibles 4 jours avant l'accident. Un bassin circulaire blanc (1 m de diamètre) est rempli d'eau et non toxique de peinture blanche. La plateforme est visible en utilisant un drapeau ou un marqueur et sans repères visuels sont sur les murs. Plus de 4 essais, la souris est placée dans le quadrant opposé à celui de la plate-forme visible, et la latence de trouver la plate-forme est mesurée. Temps d'essai maximale est de 60 secondes et la souris reste ou est placée sur la plate-forme pendant 15 sec à la fin de chaque essai. L'intervalle est de 5 min intertrial au cours de laquelle la souris est réchauffé sur un coussin chauffant. La plate-forme est déplacée à un quadrant différent pour chaque procès et quatre essais sont effectués. Pour évaluer l'apprentissage, les souris sont formés sur le MWM en utilisant une plateforme cachée fixée dans l'un des quatre quadrants à divers moments après la blessure (typiquement de 1, 7 et 21 jours). Indices en noir et blanc sont placés sur les murs. Le quadrant dans lequel la souris est placé est pseudo-aléatoire varié tout au long de la formation et de temps à localiser la plateforme est enregistrée. Temps d'essai maximale est de 60 secondes et la souris reste ou est placée sur la plate-forme pendant 15 sec et réchauffé pendant 5 min entre les essais. Les souris sont soumises à des essais 8 / jour pendant 3 jours consécutifs. Pour évaluer la rétention de la mémoire, les animaux sont soumis à un essai de 60 sondes sec le lendemain du dernier entraînement. Pendant le procès, la sonde, la plate-forme est enlevée pour déterminer le temps passé et nagé la distance dans le quadrant où la plateforme utilisée pour l'être. Enfin, un test de la plate-forme visible est fait pour exclure du moteur possible et que les déficits visuels développés post-traumatique. Afin de déterminer les conséquences histologiques de lésion LFP, le tissu est fixé par perfusion intracardiaque dans NaCl 0,9% suivi par 4% de paraformaldéhyde à des temps désiré après une blessure. Tissu est post nuit à 4 ° C, puis cryoprotégés dans 10% et 30% d'une solution de saccharose et d'intégration. Frozen coupes sériées sont coupés sur un cryostat et traitées en utilisant diverses techniques immuohistochemical et histologiques. 4. Les résultats représentatifs: La blessure provoquée par le dispositif LFP est reproductible de l'animal à animal, en particulier avec la formation chirurgicale suffisante. Pour maintenir la cohérence de la blessure, la quantité de pression livré à la mère par l'appareil est contrôlé. Le pendule frappe un cylindre rempli d'eau en acrylique à haute pression et les tubes de raccord Luer-Lok qui est connecté au hub blessures apposée sur le site craniectomie sur l'animal (figure 1A). Pour une blessure légère à modérée, l'angle du pendule est fixé à générer une pression allant de 0,9 à 2,1 atm et un oscilloscope connecté à un amplificateur est utilisé pour visualiser l'impulsion de pression (figure 1B). Blessure produit une gamme de redressement fois réflexe et une augmentation de la mortalité associée à un œdème pulmonaire. Légère blessure est considérée comme un temps de réflexe de 2 – 4 min et un 0 – taux de mortalité de 5%. Blessures modérée est considérée comme un temps de réflexe de redressement de 6 – 10 min et 10 – taux de mortalité de 20%. Par ailleurs, les souris soumises à LFP peuvent présenter posture tonique qui peut être le signe de la saisie. La saisie est souvent associée à un compromis mère. Ensemble, ces résultats suggèrent que la blessure est à l'origine des dommages neurologiques. Sham animaux sont connectés à l'appareil LFP, mais le pendule n'est pas libéré. Pour visualiser les dommages induits par la LFP, nous avons effectué immunocytochimie en utilisant des anticorps qui reconnaissent les astrocytes et les macrophages qui sont tous deux types de cellules associée à une réponse à une blessure. Protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) révèle gliose coloration accrue dans le cortex de la région de blessure WHEREA souris imposture ne s'affichent pas astrocytose augmenté dans le site équivalent en dessous de la craniectomie (figure 2A, B). De même, MAC1 coloration démontre plus macrophages entourant le site de la lésion par rapport à des souris soumises à une intervention chirurgicale fictive. De plus, il ya des dommages physiques à la Foire tissu cortical visibles chez les souris soumises à LFP, mais pas dans simulacre souris (figure 2C, D). Tests comportementaux suivants LFP doux peut être utilisé pour évaluer les résultats cognitifs et moteurs. MWM est utilisé pour déterminer les effets sur l'apprentissage et la mémoire. Utiliser des indices visuels dans la salle de test, les souris imposture devient rapidement plus efficace à localiser la plateforme avec chaque jour qui suit la formation dans le labyrinthe d'eau. Souris soumises à une légère LFP prendre plus de temps à localiser la plateforme cachée sur les deux premiers jours d'essais par rapport aux souris imposture mais semblent apprendre la tâche dès le troisième jour (figure 3A). Ces résultats suggèrent que la blessure réduit la vitesse à laquelle les souris peuvent acquérir l'apprentissage spatial. Pour déterminer l'effet des blessures sur la rétention de la mémoire, un essai de sonde est effectué un jour après la dernière séance d'entraînement. Souris Sham passer plus de temps dans le quadrant cible par rapport à des souris soumises à LFP doux ce qui suggère que la blessure a affecté la capacité des souris à rappeler l'emplacement d'où la plateforme utilisée pour résident (figure 3B). Afin d'évaluer la fonction locomotrice, les souris sont testées sur le dispositif rotarod. Souris soumises à une légère ont LFP courte latence moyenne à tomber par rapport à la souris imposture à 1, 7 et 21 jours après la blessure (ppp) (figure 3C). Ces données suggèrent que des souris blessées ont entravé vestibulomotor intégré et la fonction sensori-motrices. Figure 1. Dispositif de la LFP et une trace représentant de l'oscilloscope obtenus lors de blessures. A) Les composants du dispositif LFP sont: le pendule fixé à un support et fixé à un angle prédéterminé pour fournir la force désirée, une eau remplie cylindre en acrylique avec des tubes à haute pression et un mâle Luer-Lok montage ci-joint, un amplificateur, et un oscilloscope. Représentant traces B) de l'impulsion de la pression de l'oscilloscope. La valeur crête à crête est de 2,16 volts indiquant une pression de 1,47 atm. Figure 2. Gliose améliorée et une réponse inflammatoire suivantes LFP démontre l'étendue de la lésion. Frozen sections transversales (20μm) à travers le cerveau d'une souris soumis à une chirurgie imposture (A, C) ou une blessure LFP (B, D) 7 jours après la blessure (ppp). Corticale des images sont prises à l'épicentre de la craniectomie. (A, B) des tissus est coloré avec un anticorps pour identifier les astrocytes. Fibrillaire gliale protéine acide (GFAP) antibody (MAB360, Chemicon, 1:400) révèle une augmentation du nombre des astrocytes dans le cortex de la souris soumises à des blessures LFP (flèches) par rapport à une intervention chirurgicale fictive. Anticorps secondaire est de chèvre anti-souris 594 (1:1000). (C. D) Tissu est coloré avec un anticorps pour identifier les macrophages. MAC1 anticorps (MAC1-alpha de la chaîne CD11b, BD Biosciences, 01:50) révèle plus macrophges et / ou la microglie activée autour du site de la lésion dans le cortex (flèches) par rapport à une intervention chirurgicale fictive. Anticorps secondaire est le rat de chèvre anti CY3 (1:50). Barre d'échelle = 200μm en A et B, 100 microns en C et D. Figure 3. Tests comportementaux suivants LFP douce démontre déficits blessés par rapport à des souris imposture. A) des souris soumises à LFP douces prennent plus de temps pour apprendre la tâche de trouver la plate-forme dans le MWM que les souris imposture. Sham vs LFP (secondes ave ± SEM) 1 jour 34,21 ± 3,02 vs 38,64 ± 2,63; 2 jours 24,52 ± 2,84 vs 27,21 ± 2,11; 3 jours 22,47 ± 2,00 vs 22,08 ± 2,52 (1 ppp, n = 9 imposture, 10 LFP) . B) des souris soumises à LFP légers passent moins de temps dans le quadrant cible pendant le procès de sonde de 24 heures après le dernier entraînement dans le relatif MWM à des souris imposture (21 dpi, n = 10). C) des souris soumises à LFP doux tomber l'appareil rotarod plus tôt que les souris imposture (1, 7 et 21 ppp, n = 5 imposture, 8 LFP). Les barres d'erreur représentent SE.