1. Craniectomia Un sito chirurgico sterile è preparato anche uno strumento di allineamento stereotassico (Strumenti Kopf) per i topi con un supporto per mouse testa gas anestesia (Kopf Instruments) collegato ad una macchina per anestesia con O 2 a filo (Parkland scientifico) per consentire l'inalazione continua di isoflurano durante l'intervento chirurgico . Un blocco del riscaldamento a 37 ° C è posizionata sotto il mouse durante l'intervento. Un microscopio operatorio e la sorgente luminosa è necessario. Lo sperimentatore deve indossare un camice, mascherina, coprendo a piedi, guanti e copricapo. Tutti gli strumenti e materiali che contattare il sito chirurgico devono essere sterilizzati. Un hub lesioni, composto alla fine di una femmina luer-lok, viene creato tagliando la fine di metallo di una 20 g 1 ½ "ago (Becton Dickinson) con una lama di rasoio. L'hub dovrebbe essere tagliata con una distorsione leggera e hanno un'apertura di circa 3 mm di diametro interno. Il trapano (vedi punto 1.10) può essere utilizzato per misurare e fabbricare un hub lesione del diametro corretto. Un hub è richiesto per animale. L'hub sarà allegato al cranio e collegato alla LFP dispositivo per fornire il polso della pressione. Corda di nylon solido (1,7 mm di diametro, ad esempio, erbaccia linea trimmer) viene tagliata in dischi ~ 1 mm di spessore con una lama di rasoio. Ancora una volta, un disco è necessario per animale. Questo è utilizzato per stabilizzare il trapano durante l'esecuzione del craniectomia (vedere il punto 1.10). I topi possono essere di qualsiasi ceppo ed età (si utilizzano principalmente C57BL / 6 età 1-9 mesi). Il mouse viene pesato e anestetizzato in una camera di induzione di piccole dimensioni (pre-riempite con 4-5% isoflurano nel 100% O 2) per almeno 1 minuto. Per l'analgesia preventiva, una iniezione di buprenorphrine (0,1 mg / kg) è dato per via intraperitoneale e il mouse è posizionato nuovamente nella camera per un altro minuto. Regime analgesico deve essere confermata da una consultazione con l'utilizzo degli animali locali e comitato di cura. Il pelo sulla parte superiore della testa del mouse viene rifilato il più vicino alla pelle possibile. Il mouse è posizionato in uno strumento di allineamento stereotassico dotato di morso placcato progettato per amministrare anestesia volatili gas (Kopf Instruments). Il livello del gas isoflurano è ridotto al 2% o di effetto. Tasso di respirazione è monitorato visivamente durante l'intervento. Altri parametri fisiologici come il gas del sangue (p O 2, p CO 2), pH del sangue o della pressione arteriosa può essere misurata utilizzando attrezzature adeguate durante la procedura. Lacrime artificiali lubrificante unguento occhio è messo sugli occhi del mouse utilizzando un applicatore di cotone per evitare che l'essiccazione. Povidone-iodio viene applicato alla pelle tra gli occhi e il collo con un applicatore di cotone seguita da 70% di alcol. L'applicazione di povidone-iodio e alcol viene ripetuto per un totale di 3 volte. Una incisione del cuoio capelluto linea mediana è composta dagli occhi al collo con un bisturi (# 15 lama) e la pelle ritratta con un bulldog pinze di piccole dimensioni (strumenti di Scienze Belle # 18050-28) per esporre il cranio e fornire un chiaro campo chirurgico. I morsetti bulldog appendere i bordi laterali del cranio. Anestetico locale bupivacaina (0,025% in soluzione salina) viene applicata al cranio con un applicatore di cotone e la fascia è raschiato dal cranio con la punta di strumento dentali o raschietto osseo (per esempio, strumenti Scienza Fine, # 10075-16). Un pennarello indelebile è usato per marcare il cranio a metà strada tra bregma e lambda e tra la sutura sagittale e la cresta laterale sopra l'emisfero destro (~ 2 mm a destra della linea mediana). Una goccia di Loctite collante cianoacrilato (Loctite Tak Pak 454) è messo in una pinza di plastica pesa in barca e sul lato afferrare (Strumenti Scienza Fine, Dumont # 6) sono utilizzati per immergere un disco d'erba filo di nylon solido (vedi 1.3) nel colla e quindi premere il disco sul segno sul cranio. Uno o due gocce di Loctite Accelerator è espresso il superiore del disco utilizzando una siringa da 1 ml e 26 3 / 8 ago G a causare l'indurimento della colla. Aderenza prova del disco al cranio prima di procedere. Posto da 3 mm diametro esterno trapano (Negozio Strumentazione Research, University of Pennsylvania) il disco e girare in senso orario fino a quando hanno tagliato attraverso cranio. Verificare i progressi del trapano è frequentemente per evitare di arrivare troppo lontano nel cranio e violazione della dura. Ci sarà un assottigliamento del cranio intorno al perimetro del disco e il lembo cranio si sentiranno sciolti quando viene premuto leggermente. Posizionare lo strumento dentale parallelo / orizzontale alla superficie del cranio per fare leva sotto il cranio e sollevare il lembo osseo in su. Staccare l'osso dal cranio con una pinza. Se c'è una piccola quantità di sanguinamento, senza compromessi della dura, utilizzare un applicatore di cotone per applicare una pressione fino a quando l'emorragia si ferma e evitare che la polvere delle ossa di ottenere sulla dura. Tuttavia, se vi è una breccia nella dura tale che ernia è visibile, l'animale deve essere eliminato dal esperimento eutanasia umano. Questa fase richiede una pratica sufficienteper raggiungere l'abilità chirurgica necessaria. Utilizzando pinze, mantenere l'hub lesioni in posizione sopra il craniectomia nel cranio in modo che il bias del mozzo sia allineato con la curvatura del cranio (cioè il bordo più lungo del mozzo si trova vicino al crinale laterale del cranio). Nel frattempo, usando un bastone di legno, tagliato ad un angolo con una lama di rasoio per avere una punta acuminata, applicare il gel super-colla intorno ai bordi esterni del mozzo con la mano opposta e stabilizzare il mozzo fino a quando non è apposta in posizione verticale sopra il foro. Bisogna fare attenzione a non ottenere colla sulla parte superiore della dura. Colla sulla durata causerà un'attenuazione del danno. Usando una piccola tazza di carta, mix metil-metacrilato acrilico dentale (Jet liquido acrilico con Perm Reline / riparazione in resina, Butler Schein) per creare una soluzione viscosa. Utilizzare una siringa da 1 cc senza ago inserito da applicare cemento in tutto il mozzo lesioni. Il cemento dovrebbe coprire il fondo 2 mm di mozzo danni così come il cranio circostante esposta. Le suture del cranio sono sigillati con il cemento per garantire che il bolo liquido dalla ferita rimane all'interno della cavità cranica. Riempire il mozzo con salina allo 0,9% di NaCl (soluzione fisiologica) utilizzando una siringa e l'ago smussati. La soluzione salina non mancherà di tenere umida la durata durante la fase di recupero. Inoltre, se l'hub infortunio non rimane piena, che indica una perdita nella connessione hub al cranio e un nuovo hub dovrebbe essere fissata. Il mouse deve essere dato un iniezione di 0,25 ml di soluzione fisiologica sterile IP, rimosso dallo strumento di allineamento stereotassica e messo in una gabbia vuota, senza coperchio filo bar su una piastra di riscaldamento. Mettere alcuni HydraGel sul fondo della gabbia e permettere al mouse di recuperare per 1-2 ore. 2. L'induzione di lesioni Accendere l'oscilloscopio (Tektronix TDS 1001B, due canali oscilloscopio a memoria Digi 40 MHz, 500Ms.s) e amplificatore (induttore Trauma amplificatore trasduttore di pressione) che è collegato al dispositivo LFP. Verificare che il dispositivo LFP (progettazione e produzione personalizzati, Virginia Commonwealth University) e l'alta pressione tubi (lunghezza 41 centimetri, volume 2 ml, Baxter # 2C5643) ad esso collegati sono riempite con acqua sterile e priva di bolle d'aria. Alla fine del tubo è un maschio Luer-lok pezzo. Con il Luer-lok un'estremità del tubo chiuso, fornire impulsi di prova rilasciando il pendolo. L'apparecchio deve essere innescato da consegnare circa 10 impulsi di prova. Verificare che pendolo dà segnale liscio sull'oscilloscopio e amplificatore. Un segnale rumore indica aria nel sistema che deve essere rimossa prima di fornire l'impulso di lesioni. La durata dell'impulso dovrebbe essere di circa 20 msec. L'amplificatore trasduttore in dotazione con il dispositivo LFP è calibrato in modo tale che 10 mV = 1,0 libbre per pollice quadrato (PSI). Un atmosfera (ATM) = 14.7 PSI. Pressioni lesioni consegnati sono tipicamente nel range di 0,9-2,1 atmosfere di produrre una gamma di raddrizzamento tempi di riflesso e di un aumento della mortalità associato con edema polmonare. Lieve lesione è considerata un tempo riflesso di raddrizzamento di 2 – 4 minuti e un 0 – tasso di mortalità del 5%. Lesioni non gravi è considerato un tempo riflesso di raddrizzamento di 6 – 10 min e 10 – tasso di mortalità del 20%. Se necessario, regolare l'angolo del pendolo per aumentare o diminuire l'intensità del polso. L'angolo della posizione di partenza del pendolo è di circa 10 gradi. Dopo aver regolato il dispositivo LFP, assicurarsi di aprire la Luer-Lok un'estremità del tubo. Il mouse si trova nella camera di anestesia 4-5% isoflurano (precaricata) fino a quando un aereo chirurgico di anestesia viene raggiunto. Il mouse è posizionato su una piattaforma accanto alla periferica LFP e l'hub è pieno di soluzione salina sterile. Il tubo del dispositivo LFP con un maschio Luer-Lok è attaccato alla femmina Luer-Lok montaggio del mozzo. L'animale viene posto su un lato e una volta alla normale riprende la respirazione, ma prima che l'animale ha ripreso coscienza completa (~ 2 min), il pendolo del dispositivo LFP viene rilasciato per causare un singolo impulso di lesioni. E 'importante non indurre la lesione, mentre l'animale è troppo anestetizzata in quanto potrebbe causare insufficienza respiratoria e morte. La pressione esatta del polso deve essere registrato. Illeso, gli animali farsa subiscono tutte le stesse procedure con l'eccezione degli impulsi fluido reale per indurre lesioni. L'animale deve essere immediatamente rimosso dal dispositivo LFP e collocato sul dorso di monitorare il tempo riflesso di raddrizzamento. Dopo il mouse si è raddrizzato, è poi brevemente anestetizzato di nuovo e il cemento e mozzo rimosso insieme dal cranio a mano. Il cuoio capelluto è poi chiuso con tessuto adesivo Vetbond (3M), sutura o graffette. Qualsiasi ernia della dura o occlusione del mozzo è notata. Un hub occluso produrrà un infortunio attenuato di grandezza sconosciuta. L'animale è reinserito nella gabbia su un blocco riscaldamento fino ambulatoriale e poi tornò a casa sua gabbia. 3. Valutazione del motore, gli esiti cognitivi e istologici Il motor deficit causato dalla LFP può essere determinata utilizzando il test rotarod, un indicatore di vestibulomotor integrato e la funzione sensomotoria 21. Tutti gli animali devono essere testati prima di lesioni per determinare una lettura di base e per acclimatare i topi al paradigma. I topi sono addestrati sul dispositivo rotarod 3 volte al giorno con intervalli tra le prove di 1 ora per i due giorni precedenti l'infortunio. La latenza di equilibrio su un 36 mm di diametro esterno, ruotando asta, che ha una superficie di gomma è misurato. La velocità aumenta 4-40 giri in un intervallo di 180 sec. Ogni processo si conclude quando l'animale cade il rotarod. In diversi momenti dopo un trauma (tipicamente 1, 7 e 21 giorni), i topi sono di nuovo testati sul dispositivo rotarod. Valutazione dei test rotarod dopo l'infortunio si basa sui punteggi individuali relativi alla loro latenze di base 22. La latenza media di caduta di topi feriti è confrontata con quella di topi farsa. LFP funzione cognitiva seguenti possono essere testato su un gruppo separato di topi usando il Morris water maze (MWM), una misura sensibile post-traumatico di memoria spaziale di apprendimento e di lavoro nei roditori 23. I topi sono acclimatati al paradigma e testati per la risposta di base utilizzando una prova visibile piattaforma 4 giorni prima per infortunio. Una piscina circolare bianco (1 m di diametro) è riempito di acqua e non tossico vernice bianca. La piattaforma è reso visibile con una bandiera o marker e senza segnali visivi sono sulle pareti. Più di 4 prove, il mouse è posizionato nel quadrante opposto a quello della piattaforma visibile, e la latenza per trovare la piattaforma viene misurato. Cronometro massimo è di 60 secondi e il mouse rimane o viene posizionato sulla piattaforma per 15 secondi alla fine di ogni prova. L'intervallo tra le prove è di 5 minuti durante il quale viene riscaldato il mouse su una piastra elettrica. La piattaforma è spostato in un quadrante diverso per ogni prova e quattro le prove vengono eseguite. Per valutare l'apprendimento, i topi sono addestrati sul MWM utilizzando una piattaforma fissa nascosta in uno dei 4 quadranti in vari momenti dopo un trauma (in genere 1, 7 e 21 giorni). Spunti in bianco e nero sono posti sulle pareti. Il quadrante in cui è collocato il mouse è pseudorandomly varia per tutta la formazione e il tempo per individuare la piattaforma è registrato. Cronometro massimo è di 60 secondi e il mouse rimane o viene posizionato sulla piattaforma per 15 secondi e riscaldato per 5 minuti tra le prove. I topi sono sottoposti a 8 prove / die per 3 giorni consecutivi. Per valutare la conservazione della memoria, gli animali sono sottoposti ad una prova di 60 sec sonda il giorno successivo la formazione all'ultimo. Durante il processo della sonda, la piattaforma viene rimosso per determinare il tempo trascorso e la distanza nuotato nel quadrante in cui la piattaforma di una volta. Infine, un test piattaforma visibile è fatto per escludere possibili motori e deficit visivo che si sono sviluppate dopo la lesione. Per determinare le conseguenze di lesioni istologiche LFP, il tessuto è fissato per perfusione intracardial nello 0,9% di NaCl, seguito da 4% paraformaldeide in punti di tempo desiderato dopo l'infortunio. Tessuto è postfixed notte a 4 ° C e poi crioprotetti nel 10% e 30% di soluzione di saccarosio e incorporamento. Congelati sezioni seriali sono tagliati su un criostato e trattati con varie tecniche immuohistochemical e istologici. 4. Rappresentante dei risultati: Il danno indotto dal dispositivo LFP è riproducibile da animale ad animale, in particolare con sufficiente formazione chirurgica. Per mantenere la consistenza del pregiudizio, la quantità di pressione consegnato la dura dal dispositivo viene monitorata. Il pendolo colpisce un cilindro pieno d'acqua acrilico ad alta pressione e tubi di raccordo Luer-lok che è collegato al mozzo lesioni apposta sul sito craniectomia sull'animale (Figura 1A). Per una ferita lieve a moderata, l'angolo del pendolo è impostato per generare una pressione che va dal 0,9-2,1 atm e un oscilloscopio collegato ad un amplificatore è usato per visualizzare l'impulso di pressione (Figura 1B). Lesione produce una gamma di raddrizzamento volte reflex e una mortalità maggiore associata con edema polmonare. Lieve lesione è considerata un tempo riflesso di raddrizzamento di 2 – 4 minuti e un 0 – tasso di mortalità del 5%. Lesioni non gravi è considerato un tempo riflesso di raddrizzamento di 6 – 10 min e 10 – tasso di mortalità del 20%. Inoltre, i topi sottoposti a LFP possono mostrare atteggiamenti tonico che può essere indicativo di sequestro. Il sequestro è spesso associato ad un compromesso dura. Insieme, questi risultati suggeriscono che il danno sta provocando danni neurologici. Animali Sham sono collegati al dispositivo LFP, ma il pendolo non viene rilasciato. Per visualizzare i danni indotti dalla LFP, abbiamo svolto immunocitochimica con anticorpi che riconoscono gli astrociti e macrofagi che sono entrambi tipi di cellule associate con una risposta al danno. Proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) colorazione rivela gliosi rafforzate in tutta la corteccia nella regione di lesioni whereas topi sham non vengono visualizzati astrocitosi aumentato nel sito equivalente al di sotto del craniectomia (Figura 2A, B). Allo stesso modo, MAC1 colorazione dimostra più macrofagi che circondano il luogo della ferita rispetto ai topi sottoposti a chirurgia farsa. Inoltre, vi è un danno fisico frequentemente al tessuto corticale visibile nei topi sottoposti a LFP ma non nei topi sham (Figura 2C, D). Test comportamentali seguenti LFP mite possono essere usati per valutare sia gli esiti cognitivi e motori. MWM viene utilizzato per determinare gli effetti sull'apprendimento e la memoria. Utilizzando segnali visivi in sala prove, i topi sham rapidamente diventato più efficiente a localizzare la piattaforma con ogni giorno successivo di formazione nel labirinto d'acqua. I topi sottoposti a LFP mite richiedere più tempo per individuare la piattaforma nascosta nei primi due giorni di test rispetto a topi farsa, ma poi sembrano imparare il compito entro il terzo giorno (Figura 3A). Questi risultati suggeriscono che la lesione riduce la velocità con cui i topi in grado di acquisire apprendimento spaziale. Per determinare l'effetto di lesioni sulla conservazione della memoria, un processo sonda viene eseguita 1 giorno dopo l'ultimo allenamento. Topi Sham trascorrere più tempo nel quadrante target rispetto ai topi sottoposti a LFP mite suggerendo che la lesione ha colpito la capacità dei topi a recuperare la posizione in cui la piattaforma utilizzata per residenza (Figura 3B). Per valutare la funzionalità dell'apparato locomotore, i topi sono stati testati sul dispositivo rotarod. I topi sottoposti a LFP mite hanno più breve latenza media di cadere rispetto ai topi farsa a 1, 7 e 21 giorni dopo l'infortunio (dpi) (Figura 3C). Questi dati suggeriscono che i topi feriti hanno alterato vestibulomotor integrato e la funzione senso-motoria. Figura 1. LFP dispositivo e una traccia rappresentante dall'oscilloscopio ottenuto durante lesioni. A) I componenti del dispositivo sono LFP: il pendolo fissato ad un supporto e fissato in un angolo predeterminato per fornire la forza desiderata, un cilindro pieno d'acqua acrilico con tubi ad alta pressione e un maschio Luer-lok montaggio allegate, un amplificatore, e un oscilloscopio. B) traccia rappresentante di impulso di pressione da oscilloscopio. Il picco-picco valore è 2,16 volt che indicano una pressione di 1,47 atm. Figura 2. Gliosi avanzata e una risposta infiammatoria a seguito LFP dimostra l'entità della lesione. Congelati sezioni trasversali (20μm) attraverso il cervello di un topo sottoposto a intervento chirurgico farsa (A, C) o lesioni LFP (B, D) 7 giorni dopo l'infortunio (dpi). Corticale immagini sono prese a l'epicentro della craniectomia. (A, B) del tessuto è colorato con un anticorpo per identificare gli astrociti. Proteina acida gliale fibrillare (GFAP) anticorpi (MAB360, Chemicon, 1:400) rivela un maggior numero di astrociti in tutta la corteccia del mouse sottoposto a lesioni LFP (frecce) rispetto alla chirurgia farsa. Anticorpo secondario è capra anti-topo 594 (1:1000). (C. D) del tessuto è colorato con un anticorpo per identificare i macrofagi. MAC1 anticorpi (MAC1-alfa catena CD11b, BD Biosciences, 1:50) rivela più macrophges e / o microglia attivata attorno al sito di lesione della corteccia (frecce) rispetto alla chirurgia farsa. Anticorpo secondario è ratto capra anti CY3 (1:50). Barra di scala = 200μm in A e B, 100μm in C e D. Figura 3. Test comportamentali seguenti LFP mite dimostra deficit feriti rispetto ai topi farsa. A) I topi sottoposti a LFP mite richiedere più tempo per imparare il compito di trovare la piattaforma nel MWM rispetto ai topi farsa. Sham vs LFP (secondi ave ± SEM) 1 giorno 34,21 ± 3,02 vs 38,64 ± 2,63; 2 giorni 24,52 ± 2,84 vs 27,21 ± 2,11; 3 giorni 22,47 ± 2,00 vs 22,08 ± 2,52 (1 dpi, n = 9 farsa, 10 LFP) . B) I topi sottoposti a LFP mite spendere meno tempo nel quadrante bersaglio durante la sonda di prova 24 ore dopo l'ultimo allenamento nel relativo MWM ai topi sham (21 dpi, n = 10). C) I topi sottoposti a LFP mite cadere il dispositivo rotarod prima di topi sham (1, 7, e 21 dpi, n = 5 farsa, 8 LFP). Barre di errore rappresentano SE.