Summary
문화 미생물에 사용되는 미디어 및 시약과 함께 작업할 경우 무균 기술은 오염을 최소화하기 위해 실천해야합니다. 도금 방법의 다양한 정기적으로, 고립 전파, 또는 열거 세균 및 파지, 실험 재료의 불임을 유지 절차를 포함 모두의하는 데 사용됩니다.
Abstract
미생물 실험실에서 가능한 오염의 유비 쿼터스 소스를 만들고 모든 생명이없는 표면에 존재한다. 실험 성공은 작업 표면 및 장비를 소독뿐만 아니라 비 멸균 표면 살균 장비와 솔루션의 접촉을 방지하기 위해 과학자의 능력에 의존하고 있습니다. 여기에서 우리는 정기적으로, 고립 전파, 또는 세균과 파지와 같은 미생물을 열거하기 위해 실험실에서 사용되는 여러 가지 도금 방법에 대한 단계를 제시한다. 다섯 가지 방법 무균 기술, 또는 실험 재료의 불임을 유지 절차를 포함. 설명된 절차는 단일 콜로니를 분리하기 (1) 탄력 - 도금 세균성 문화, (2) 붓다 - 도금 (3) 확산 도금 가능한 세균성 식민지를 열거하기 위해, 파지 및 열거 plaques를 분리하기 (4) 부드러운 한천 오버레이, 및 (포함 5) 복제 - 도금을 한 판에서 동일한 공간적 패턴에서 다른 세포를 전송할 수 있습니다. 이러한 절차는 t에서 수행할 수그는 실험실 벤치는 그들이 미생물의 비 병원성 변종을 (Biosafety 레벨 1, BSL-1) 참여 제공. BSL-2 생물과 협력한다면, 이러한 조작은 biosafety 캐비닛에서 개최한다. 생물 학적 분류는 물론 문제의 미생물에 필요한 안전 조치 및 억제 시설을 결정하는 감염성 물질에 대한 최신 미생물 및 바이오 메디컬 연구소의 Biosafety의 판 (BMBL)뿐만 아니라 재료 안전 데이터 시트 (MSDS)를 참조하십시오. 박테리아 변종과 파지 주식 같은 미국 유형 문화 수집 (ATCC)와 같은 특정 단체에 의해 관리 연구 조사관, 회사 및 컬렉션에서 얻을 수있다. 그것은 여러 가지 도금 방법을 배우고 비 병원성 종자를 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에서 설명한 절차에 따라, 학생들은 수 있어야합니다 :
- contaminati없이 도금 절차를 수행NG 미디어.
- 줄무늬-도금 방법으로 단일 세균성 식민지를 분리.
- 박테리아의 농도를 결정 부어 - 도금 및 확산 도금 방법을 사용합니다.
- 파지 작업시 부드러운 한천 오버레이를 수행합니다.
- 한 접시의 복제 - 도금 절차를 사용하여 다른 세균 세포를 전송합니다.
- 실험적인 작업을 감안할 때, 적절한 도금 방법을 선택합니다.
Protocol
1. 안전하고 무균 작업 영역 준비
- 미생물과 함께 작업할 때 주의할 모든 실험실 규칙과 안전 조치에 익숙한한다. 에 관계없이 생물 학적 분류, 미생물과 접촉 모든 자료는 전염성 폐기물로 간주되어 폐기 이전 소독해야합니다. 잠재적으로 오염된 물질의 즉각적이고 적절한 처리 (생물 학적)에 대한 적절한 폐기물 receptacles을 설정하는 제도적 환경 보건 및 안전 부서에서 제공하는 사람, 따라 안전 지침을 따르십시오.
- 모든 악기, 솔루션 및 사전 도금 절차를 위해 그들을 사용하는 미디어를 소독.
- 실험실 벤치에 작업 영역을 cluttering 모든 자료 치워.
- 가능한 오염을 최소화하기 위해 방역과 작업 영역을 청소하십시오.
- 분젠 버너를 설정하고 천천히 일을 신중하게, 그리고 신중하게 updra 만든 무균 필드 영역 내에서불꽃 피트
- BSL-2 생물과 협력하면 Biosafety 캐비닛에 작업 공간을 설정합니다. 화염의 열기가 그 기능에 필수적인 공기 흐름을 방해하기 때문에 분젠 버너는 캐비닛 안에서 사용할 수 없습니다.
- 멸균 현장 근처에 실험실 벤치에서 절차에 필요한 모든 소모품을 마련. 모든 자료가 제대로 분류되어 있는지 확인합니다. 업무의 효율성을 극대화하고 불필요한 움직임을 방지하기 위해 작업 영역을 구성하는 것은 대기 중의 오염 물질에 대한 실험 재료의 노출 시간을 최소화합니다.
- 벤치에 오른쪽에있는 분젠 버너를 놓습니다.
- 왼쪽 플레이스 한천 플레이트이나 배양 접시.
- 세포 배양, 튜브, flasks 및 벤치의 중심에있는 병을 마련.
- 튜브, flasks 및 병의 마개 그래서 그들은 쉽게 후속 조작하는 동안 한 손으로 열 수를 풀어.
- 살균 비누와 따뜻한으로 철저하게 손을 씻고미생물을 취급하기 전에 물.
2. 줄무늬 플레이트 절차 : 사분 방법을 사용하여 세균 콜로니의 분리
줄무늬-플레이트 절차는 단순한 기계적 분리하여 혼합 인구에서 순수 박테리아의 문화, 또는 식민지를 분리하도록 설계되었습니다. 단일 콜로니는 (그림 1)이나 한천 플레이트 내의 클러스터에 성장하는 세포의 수백만로 구성되어 있습니다. 식민지는 단일 세포와는 달리, 육안으로 볼 수 있습니다. 이론적으로, 식민지의 모든 세포는 처음에는 접시에 예금 하나의 박테리아에서 파생되며 따라서 클론, 또는 유전적으로 동일한 세포 클러스터라고합니다.
- 박테리아는 모양과 크기의 다양한 존재합니다. 연쇄상 구균 세포는 1 μm의의 평균 직경 구형 반면 예를 들어, 개별 대장균 세포는 2 μm의 및 0.5 μm의 폭의 평균 길이로 막대 모양입니다. 일부 박테리아 (쓰에E. 같은 채널 다른 협회의 독특한 패턴을 형성하면서. 연쇄상 구균은 예를 들어, 쌍 또는 양식 체인이나 세포 클러스터 성장 대장균)은 하나의 세포로 존재합니다. 그것은 일반적으로 하나의 식민지가 이진 분열을 겪고 단일 세포에서 발생하는 추정되고 있으나,이 가설은 자연스럽게 쌍, 체인, 또는 클러스터 또는 다른 메커니즘에 의해 그 격차로 존재 그 세균에 대해 사실이 아니에요. 너무 많은 박테리아가 도금 경우 또는 다음,이 세포 중복이 발생하고 단일 식민지로 보이는로 상승을주는 두 개 이상의 박테리아의 확률을 높일 수 있습니다. 고체 배지에서 성장하는 세균성 문화를 설명하거나 열거하면 이러한 합병증을 피하기 위해, 식민지 콜로니 형성 단위 (cfu)라고합니다.
줄무늬 도금 절차를 통해 세포의 혼합물은 배양 접시에있는 세미 솔리드, 한천 기반 영양소 매체의 표면 등 그 이하의와 적은 박테리아를 전염세포는 매체의 표면에 넓게 분리된 지점에서 예금되고, 부화 따라 식민지로 발전하고 있습니다. 세포의 혼합물로부터 단일 콜로니를 분리를위한 사분면 방법은 여기에서 설명한 것입니다.
- 줄무늬-도금은 다른 악기의 숫자 (그림 2)로 수행할 수 있습니다. 금속 루프는 여러 번 다시 사용할 수와 탄력-도금 루틴 연구실 종자 활용됩니다. 일회용 플라스틱 루프가 상업적으로 사용할 수 있으며 Biosafety 캐비닛에 BSL-2 계통으로 작업할 때 더 많이 사용됩니다. 많은 연구 과학자가 깨져-도금을위한 일회용, 사전에 소독을 나무 막대기 혹은 평면 이쑤시개를 사용하여 선호합니다. 이들은 일회용 플라스틱 루프에 대한 저렴한 대안이고 가능성이 포자 - 성형 박테리아를 포함하고 같은 토양 등 환경 시료와 함께 작업할 때 특히 유용할 수 있습니다.
- 일회용 사전 소독 막대기와 이쑤시개는 분젠 버너 목으로 골조 필요가 없다s의 포자 - 성형 세균 및 포자와 실험실 표면이나 한천 플레이트의 교차 오염의 불필요한 aerosolization을 방지.
- 최소한 귀하의 이름, 날짜, 성장 매체의 유형과 매체에 도금되는 유기체의 종류와 한천 플레이트의 하단 (안 뚜껑)의 가장자리 주위 라벨.
- 접시는 뚜껑과 탄력-도금 이전 실온에 미리 예열에 결로가없이 완전히 건조되어야합니다. 번호판이 4 ° C에 저장되어있다면, 그들에게 심지어는 몇 시간 또는 전날를 제거합니다. 더 이상 2-3 접시의 작은 정열 스택에 그들을 밖으로 벌리고 그들을 건조하실 수 있습니다.
- 줄무늬 도금이 주사됩니다있는 예제는 다른 한천 플레이트에서 국물의 세포의 정지 또는 기존의 식민지 중 하나가 될 수 있습니다. 시작하려면, 그것은 하나의 샘플이 하나의 접시를 예방하기 위해 사용하는 것이 좋습니다. 시간과 물질을 절약하기 위해 하나의 플레이트는 여러 samp 사용할 수 있습니다레하지만 한 번만 당신이 접시 하나씩 샘플을 줄이에서 실력이된다.
- 첫 번째 사분면의 경우 샘플을 포착하고 (그림 3의 패널) 빠른 부드러운 다시 앤 앞뒤 모션을 사용하여 매체의 표면의 1 분기에 대해서여 퍼졌다. 벤치에서 거꾸로 판의 아래쪽 절반을 올려요. 테두리에서 접시의 중앙에 한천 표면을 가로질러 앞뒤로 여러 번 루프, 스틱 또는 이쑤시개로 이동합니다.
- inoculum이 세포 현탁액 경우 micropipettor과 메탈 루프 또는 5-10 μl로 loopful를 구하십시오. 소용돌이 또는 와동 도금을위한 나누어지는를 제거하기 전에 세포 현탁액을해야합니다. 이전 inoculum 제거 후 루프뿐 아니라 병 또는 튜브의 가장자리뿐만 아니라 불타는,이 단계를 수행하는 동안 무균 기술을 사용합니다. 또한, micropipettor의 루프 또는 배럴로 튜브 또는 용기의 측면을 건드리지 않습니다. inoculum를 pipetting하면 approp에 세포 현탁액을 분배접시에 장소를 riate하면 다음 판의 첫 번째 사분면을 통해 그것을 확산 루프, 스틱이나 이쑤시개를 사용합니다.
- inoculum 다른 접시에서 식민지 경우 부드럽게 루프와 식민지 닿으면, 스틱이나 이쑤시개 다음 판의 첫 번째 사분면을 통해 그것을 확산. 금속 루프가 식민지를 만지기 전에 냉각되었는지 확인하십시오. 루프가 너무 더워하지 않도록하기 위해 아무런 줄이이 발생하지 않을 지정된 영역에 한천 플레이트에 가볍게 만져. 단지 몇 세포 식민지가 아닌 전체가 식민지에서 필요합니다.
- 금속 루프를 사용하는 경우, 불꽃이 그것 플레이트 (그림 3의 패널 B)에 대한 inoculum를 취득하기 전에 분젠 버너를 사용합니다. 푸른 원추, 불꽃의 가장 뜨거운 부분의 끝에있는 와이어와 함께, 루프 3~4인치에 대해 시작합니다. 금속은 따뜻한 붉은있게됩니다. 불꽃이 루프를 접근하도록 와이어를 이동합니다. 이 조작은 이전 사용량의 루프에 남아있는 세균의 aerosolization을 방지합니다.
- 불타는 것은 죽이기온수 공기에서 박테리아 (포자하지 않았지만)과 대류 흐름은 이후의 조작 중에 금속 와이어에 정착에서 다른 대기 중의 오염 물질을 방지.
- 멸균 평면 이쑤시개를 사용하는 경우 중간에로 10 20 ° 각도에서 엄지와 약지 사이에 부드럽게 좁은 끝부분을 보유하고 탄력 quadrants를 대한 폭넓은 엔드를 사용합니다. 루프 또는 나무 막대기를 사용하는 경우 동일한 각도로 연필처럼 들고있어. 루프, 스틱이나 이쑤시개 셋방 그 한천로 열심히 누르지 마십시오.
- 첫 번째 사분 완료 후 반전하고 벤치에서 플레이트 뒤쪽 뚜껑에 아래로 설정합니다. 단계 # 4에 설명된대로 스틱이나 이쑤시개 혹은 다시 불꽃의 금속 루프를 배출.
- 연속으로 두 번째 사분면에 대한 배양 접시 90 °를 돌립니다. 벤치에서 거꾸로 판의 아래쪽 절반을 들어올려하면 다음 마지막 행진의 끝에 가까운 첫 번째 사분면에 루프, 스틱이나 이쑤시개를 손대지. 백 앞뒤 패턴 사용 라스를 건너첫 번째 사분면에 줄무늬 t의 절반 후 빈 둘째 사분면으로 이동합니다. 반전하고 두 번째 사분면이 충만되면 벤치에 뚜껑으로 번호판을 다시 아래로 설정합니다.
- 루프, 스틱이나 이쑤시개는 대부분 원래 inoculum의가 예금되었다 첫 번째 사분면에 줄무늬 상반기로 돌아가지 않을 것입니다.
- 새로운 플라스틱 루프, 나무 스틱 또는 이쑤시개 각 사분면에 사용해야합니다.
- 세 번째와 네 번째 quadrants을위한 단계를 두 번 # 6을 반복합니다.
- 스틱이나 이쑤시개 또는 재가 화염 각 사분면 사이의 금속 루프 처분해야합니다.
- 4 분면을 줄이 때 첫 번째 사분면으로가는 피하십시오.
- 뚜껑에 축적 결로가 식민지에서 드립하지 않도록 거꾸로 접시를 품어.
3. 플레이트 절차를 부어 : 세균성 세포의 열거 혼합 샘플에
이 방법은 자주 사용이다혼합 시료에서 미생물의 수를 계산하는 D,이 과정은 이전의 응고에 녹은 한천 배지에 추가됩니다. 공정 균일하게 적절한 샘플 희석이 도금되어 고체 배지에 걸쳐 분산 식민지 결과. 이 기술은 한천 내와 한 접시에 한천의 표면에 콜로니 형성 단위의 총 개수가 열거되는 실행 가능한 플레이트 카운트를 수행하는 데 사용됩니다. 가능한 플레이트 카운트 과학자에게, 성장 곡선을 생성하는 예제가 도금되었다있는 튜브에 세포의 농도를 계산하고, 세균 세포의 생존이나 성장 속도에 관한 다양한 환경이나 성장 조건의 효과를 조사하기 위해 표준화된 수단을 제공합니다.
- 최소한 귀하의 이름, 날짜, 성장 매체의 유형, 그리고 녹인 한천 배지에 추가되는 유기체의 종류와 멸균하지만 비어있는 배양 접시의 바닥합니다 (뚜껑)의 가장자리 주위 라벨.
- 희석 요인 작은지면되는 경우를 포함시리얼 dilutions, 또는 샘플에서 세포의 농도에서 체계적인 감소시킨 결과가 반복 dilutions의 시리즈를 접근한. 샘플에서 세포의 수가 통계적으로 의미있는 범위가 30-300 cfu되는 한천 플레이트의 용량을 초과하는 경우에는 시리얼 dilutions을 준비하는 것이 필요합니다. 접시에 300 개 이상 cfu가있다면, 그때 식민지가 북적거리는와 중복 될 것입니다.
- 녹은 한천 배지 18 ML이 들어있는 튜브를 구합니다.
- 한천 배지는 테스트 튜브에 적절하고 압력솥에 미리 소독을해야한다. 그것은 실험을 위해 필요한 같은 날, 한천 그런 다음 55 ° C의 물을 욕조에 양도 30 분 기선에 녹아 있어야합니다. 그것은 다시 사용할 수 없으므로 실험을 위해 필요로 단만큼 한천이 녹아 있어야합니다.
- 십분 접시를 따르고 전에 녹인 한천의 튜브는 노동에 열 블록에 55 ° C의 물 목욕으로 전송하여야한다48에서 설정 atory 벤치 ° C. 한천이 온도에 도달하면, 그것은 붓다 준비가되어 있습니다. 한천이 너무 뜨거운 경우 샘플에서 박테리아가 죽을 수도 있습니다. 한천이 너무 시원하고 경우 매체는 한 경화 울퉁불퉁 수 있습니다.
- 국물 문화 또는 버퍼 또는 식염수로 식민지의 혼합 세포에 의해 생산된 세포 현탁액 중 하나이어야하는 샘플을 구합니다.
- 샘플은 하나의 샘플의 희석 일련의에서 파생됩니다.
- 도금되는 샘플 볼륨은 0.1 및 1.0 ML 사이 여야합니다.
- 비어있는 페트리 접시의 뚜껑을 열고 접시의 중간 (패널 그림 4)에 샘플을 분배. 뚜껑을 닫습니다.
- 이 절차에 걸쳐 무균 기술을 사용합니다.
- 플레이트에 샘플을 전송할 serological 피펫이나 micropipettor 중 하나를 사용하십시오. 그것이 판 밖으로 끼얹으하지 않도록 시료의 흐름을 제어합니다.
- 욕조의 마개를 제거합니다녹은 한천의 전자와 분젠 버너의 불꽃을 통해 개방형 튜브의 가장자리를 전달합니다.
- 샘플이 들어있는 페트리 접시의 뚜껑을 열고 조심스럽게 (그림 4의 패널 B)의 한천을 부어. 뚜껑을 닫고 그 다음 부드럽게 플레이트 소용돌이하여 한천과 함께 샘플을 섞는다.
- 한천이 완전히 부화를위한 반전 판 전에 응고하도록 허용합니다.
4. 확산 플레이트 절차 : 플레이트 계산, 농축, 선택, 또는 상영을위한 이산 세균성 식민지의 형성
이 기술은 일반적으로 세포의 적절한 농도가 도금 때 한천 표면에 걸쳐 균일하게 분산된 개별 콜로니 형성의 결과로, 한천 플레이트의 표면에 걸쳐있는 작은 샘플 볼륨에 포함된 별도의 미생물에 사용됩니다. , 가능한 플레이트 카운트에 대해이 방법을 사용뿐만 아니라 식민지의 총 개수는 노래에 단위를 형성하는르 플레이트가 열거되고 샘플은 도금했다있는 튜브에 세포의 농도를 계산하는 데 사용됩니다, 확산 도금은 정기적으로 농축, 선택하고, 선별 실험에 사용됩니다. 이 세 가지 실험에 대해 원하는 결과는 일반적으로 개별 식민지의 분포는 한천의 표면에 걸쳐 형성되는 플레이트 카운트에 대해 동일합니다. 그러나 목표는 모든 가능한 세포 콜로니를 형성하도록 아니다. 대신, 특정 유전자형을 가지고 인구 이내만이 세포가 성장해야합니다. 식민지 한천 표면에 accessibly 성장하기 때문에 최종 목표는 자세한 분석을 위해 식민지를 분리하는 경우 보급 플레이트 절차를 열거 실험 뭔가 뿌린 플레이트 기법을 통해 직업을 가지고있을 그들이 뭔가 뿌린 접시 절차와 한천에 포함되는 반면.
확산 판 절차에 대해 여기서 설명이 전략이있다. 첫 번째 (방법)은 턴테이블 및 유리 또는 금속 RO의 사용과 관련된D 하키 스틱 모양. , 'Copacabana 방법 "로 지칭, (방법 B) 두 번째 떨고 미리 멸균 유리 구슬을 포함한다. 모두도 한천 표면에 걸쳐 세포의 확산 촉진한다.
방법 : 턴테이블 및 유리 또는 금속 막대로 확산 도금
- 최소한 귀하의 이름, 날짜, 성장 매체의 유형과 매체에 도금되는 유기체의 종류와 한천 플레이트의 하단 (안 뚜껑)의 가장자리 주위 라벨.
- 희석 요인 시리얼 dilutions을 도금하는 경우를 포함합니다.
- 번호판 덮개와 확산 도금 이전 실온에 미리 예열에 결로가없이 완전히 건조되어야합니다. 번호판이 4 ° C에 저장되어있다면, 그들에게 심지어는 몇 시간 또는 전날를 제거합니다. 더 이상 2-3 접시의 작은 정열 스택에 그들을 밖으로 벌리고 그들을 건조하실 수 있습니다.
- 턴테이블의 센터 플레이트 (그림 5).
- 당신을 구합니다국물 문화 또는 버퍼 또는 식염수로 식민지의 혼합 세포에 의해 생산된 세포 현탁액되어야 R 샘플.
- 샘플은 하나의 샘플의 희석 일련의에서 파생됩니다.
- 도금되는 샘플 볼륨은 0.1과 0.2 ML 사이 여야합니다.
- 페트리 접시의 뚜껑을 열고 한천의 중심에 샘플을 분배. 뚜껑을 닫습니다.
- 이 절차에 걸쳐 무균 기술을 사용합니다.
- 플레이트에 샘플을 전송할 micropipettor을 사용합니다. 그것이 판 밖으로 끼얹으하지 않도록 시료의 흐름을 제어합니다.
- 70 % 비커 (V / V) 에탄올로 유리 막대 또는 금속 막대를 (또한 확장기라고도 함) 놈아.
- 주의 : 알코올의 비커에 따뜻한 확장기 찍어하지 마십시오.
- 에탄올은 확장기의 하단 부분과 줄기의 첫 인치 만지지해야합니다.
- 번스의 불꽃 통해 전달하여 드레인 및 초과 에탄올을 점화실내 버너.
- 불꽃 그러면 신속하게 소화 에탄올과 접촉 와서 확장기와 줄기의 길이를 여행한다.
- 에탄올 캐치 화재의 비커, 정신 잃으면 안되 었어! 신속하게 화재를 소화합니다 비커 이상의 유리 커버를 놓습니다.
- 당신의 엄지와 검지로 왼손으로 뚜껑을 잡고, 한천 접시의 뚜껑을 엽니다. 가장자리 근처의 가장자리를 따라 한천로 만져서 확장기 시원한 시간을 보내세요.
- 세포가 추가되었습니다 한천를 만지지 마십시오. 뜨거운 살포기는 세포를 죽일 것이다.
- 왼손으로 (여전히 한천 접시의 뚜껑을 누른 상태) 천천히 턴테이블을 돌리다.
- 최고의 피할 비록 당신이 뚜껑을 내려놓고해야하는 경우, 그것이 분젠 버너의 멸균 분야 내에서 감염되지 않았소 표면에 내려 직면 놓습니다. 최대 직면 뚜껑으로, 객체 또는 손의 움직임에서 오염의 큰 기회가 원인이 공기 흐름을 만들고,이미생물과 먼지 입자는 뚜껑의 내부 표면에 내려합니다.
- 오른손으로 한천의 표면에 부드럽게 확장기를 개최하고 점차적으로 전체 판 걸쳐 균등하게 샘플을 퍼뜨린다. 턴테이블이 회전되면 접시에 걸쳐 앞뒤로 확장기로 이동합니다.
- 예제 인큐베이션위한 반전 플레이트 전에 (적어도 5 분) 철저하게 흡수하도록 허용합니다.
방법 B : 유리 구슬로 확산 도금 : "Copacabana 방법"
- 최소한 귀하의 이름, 날짜, 성장 매체의 유형과 매체에 도금되는 유기체의 종류와 한천 플레이트의 하단 (안 뚜껑)의 가장자리 주위 라벨.
- 희석 요인 시리얼 dilutions을 도금하는 경우를 포함합니다.
- 당신의 엄지와 검지로 왼손으로 뚜껑을 잡고, 한천 접시의 뚜껑을 엽니다. 그런 다음 미리 소독 GL을 포함 유리관이나 병을 열고엉덩이가 비즈. 오른손, 불꽃과 함께 튜브 또는 병 림 다음 조심스럽게 한천 플레이트쪽으로 10-12 멸균 유리 구슬 (그림 6) 분배. 뚜껑을 교체하고 별도로 설정하기 전에 다시 한 번 접시의 뚜껑과 불꽃 튜브 또는 용기의 테두리를 닫습니다.
- 구슬은 페트리 접시 밖으로 반사되지 않도록 부드럽게 한천 위 몇 센티미터에 관이나 병 밖으로 염주를 붓는다.
- 직경 4mm있는 유리 구슬을 사용합니다. 30 분 건조 사이클 (중력 설정)에서 121 ° C에서 압력솥에 유리병이나 테스트 튜브에서 그들을 소독.
- 대신 살포기의 구슬을 사용하는 장점 하나는 에탄올에 대한 열린 용기가 반복 불타는 위해 필요하지 않습니다 점이다.
- 한천 접시의 뚜껑을 열고 한천의 중심에 샘플을 분배. 뚜껑을 닫습니다.
- 이 절차에 걸쳐 무균 기술을 사용합니다.
- 판 당 샘플의 나누어지는 100-150 μl. 이음량도 전지의 보급 촉진합니다. 플레이트에 샘플을 전송할 micropipettor을 사용합니다. 그것이 판 밖으로 끼얹으하지 않도록 시료의 흐름을 제어합니다.
- 부드럽게 한천의 표면에 6-7 회 걸쳐 구슬을 흔들어하여 샘플을 벌리고. 세포가 균일하게 확산되도록하려면 가로 흔들림 모션을 사용합니다.
- 소용돌이 모양의 구슬 또는 다른 모든 세포가 접시 가장자리에 집중하지 마십시오.
- 힌트 : 제대로 수행하면 프로 시저가 "흔들림 maracas '처럼 들린다.
- 접시에 60 ° 회전 후 수평으로 다시 6-7 회 흔들어.
- 플레이트 60 ° 두 번 회전과 수평으로 다시 흔들. 지금까지, 심지어 한천 표면에 걸쳐 세포 확산 달성해야합니다.
- 확산 도금이 완료되면 시료가 흡수해야하고 한천의 표면은 건조해야합니다. 10 % 염소 표백제를 포함 표시된 컬렉션 비커에 오염된 구슬을 하거라.
- 마휴지통에 구슬을 버리고! 사용된 구슬은 반복 사용에 대한 다시 살균 그들, 씻어서 autoclaved됩니다.
- 참고 : 한천 표면이 세 번 흔들어 후 아직 젖어있다면, 플레이트 플레이트 표면이 건조 나타날 때까지 단계를 반복 # 4-6 후, 한천에 흡수되는 액체를 허용하는 데 몇 분 동안 앉을 수 있습니다.
- 인큐베이션위한 접시를 반전.
5. 소프트 한천 중첩 절차 : 파지의 분리 및 열거를위한 Plaques의 형성 (플라크 분석)
이 기술은 일반적으로 박테리오 파지 (파지) 또는 세균성 바이러스를 탐지하고 계량하는 데 사용되는 100-200 nm의에서 크기가 다양합니다. 전자 현미경은 개별 파지 입자를보고 필요합니다. 그러나 전염성 파지 입자의 존재는 한천 플레이트에 plaques (그림 7A)로 감지가 가능하다. Phages 자신의 호스트 세균 세포 밖으로 복제할 수 없으므로 전파D 검출은 도금 이전 믹싱 phages와 함께 호스트 세포를 필요로합니다. 부드러운 한천 중첩 프로 시저의 경우 파지 서스펜션 일반적으로 50 μl 200 μl의 범위에서 작은 볼륨, 골고루의 2.5-3.0 ML에 분산되어 8 10 대한 박테리아 (호스트 세포)를 포함하는 튜브에 적절하고 있습니다 소프트 (0.5-0.7 % [W / V]), 녹은 영양소 한천. 결과 혼합물은 영양 한천 플레이트 하드 ([W / V] 1.5-1.9 %)의 표면 위에 부어있다. 접시는 부드러운 한천이 하드 한천의 전체 표면을 커버하도록 충분히 누볐어있다. 최고 한천 레이어가 고체화 시간이 없었으며 이후 인큐베이터에 놓일 수있을 때까지 다음 판은 레벨의 표면에 배치됩니다.
시간이지나면서 박테리아 세포의 뿌연 현탁액은 잔디로 언급 부드러운 한천 배지 (그림 7B)에 걸쳐 표시됩니다. 파지가 박테리아 세포 중 하나를 감염시키는 경우 Plaques가 형성, 일 이내에 복제전자 셀은 다음과 같은 많은 100과 같은 자손의 phages (일명, 버스트 크기)을 방출 셀 lyses. 새로운 파지 입자 lysed 세균 세포를 둘러싼 지역에서 박테리아를 감염, 부드러운 한천으로 확산. 감염 및 용해의 여러 사이클 후, 부드러운 한천의 뿌연 세균성 세포 현탁액은 플라크라고 부르는 개간의 영역을 남기고 사라집니다. 각 플라크는 원래 전염성 파지 입자의 유전자와 동일 이상 10 9 파지 입자 모두 포함되어 있습니다. 상패 하나의 파지 입자로부터 발생하기 때문에, 플라크 형성 단위의 결과 수 (pfu)를 계산 수 있으며 파지 서스펜션의 원래 농도, 또는 titer가 계산됩니다. 상패 분석이라는 실험의이 유형은 또한 과학자들에게 한 단계 성장 곡선을 생성하기 위해 호스트 범위 특이성을 조사하고, 유전자 실험에 세균성 세포를 transduce하기 위해 표준화된 수단을 제공합니다.
- <strong>을 지표 세균을 준비 : 세균성 호스트 변형의 기하 급수적으로 증가하는 문화가 부드러운 한천 오버레이 실험 준비를해야합니다. 각 호스트는 자신의 성장 요구 사항을 가지고 있습니다. 0.3 ML 및 지표 세균의 현탁액 0.5 ML 사이는 각 플레이트가 필요합니다. 지표 세균의 술병이 (예, 25 ML) 준비가되면 문화가 교차 오염의 가능성을 최소화하기 위해 작은 aliquots (예 : 멸균 나사 뒤덮인 튜브에 적절 5 ML의 aliquots)로 나눌 수 있습니다. 실험에 사용할 때까지 튜브는 얼음 (4 ° C에서)에 보관됩니다. 멸균 영양 국물을 예방하기 위해 무균 기술을 사용하여 다음 세균성 변형의 사양에 따라 알을 품다. 남은 문화는 하루가 끝나는 시점 폐기되어야합니다.
- 흡착 튜브를 준비 : 랙에 두 멸균 microcentrifuge 튜브를 놓습니다. 최초의 튜브 '파지'와 두 번째 튜브 "제어"의 뚜껑의 뚜껑을 레이블.
- 전형적인파지의 lysates의 단조 시리얼 dilutions 준비 및 추가 microcentrifuge 튜브가 랙에 추가 희석 요인으로 표시됩니다 어떤 경우에는 도금있다.
- 파지 주식은 단일 plaques 신선한 제출 및 4 ° C.에 저장해야합니다 파지 입자를 disaggregate하려면 주식은 실험을 실행하기 전에 주위 온도로 예열한다.
- 파지 주식은 조심스럽게 다루어 져야합니다 - 와동 또는 pipet을 다해 않아요.
- 최초의 튜브로 파지 샘플의 50 μl를 추가 후 플라크 분석에 대한 부정적인 제어 역할을합니다 두번째 튜브로 파지 버퍼의 50 μl를 추가합니다.
- 파지와 세균의 모든 조작에 걸쳐 무균 기술을 사용합니다.
- 다음 각 흡착 관에 지표 세균 500 μl를 추가합니다.
- 오랜 기간 동안 얼음이나 벤치에 앉아 있으면 세균 세포는 튜브의 바닥에 정착됩니다. 문화가 혼합되지 않은 경우이전에 충분하지 세균성 세포 흡착 튜브로 전송됩니다, 실험 나누어지는 제거에 에드. plaques의 검출을위한 소프트 한천 (즉, 잔디)에 형성된 세균성 식민지의 충분한 숫자가 있어야합니다. 부드럽게 흡착 튜브에 aliquots을 전송하기 전에 균일한 현탁액으로 지표 균을 다시 정직 와동 믹서를 사용합니다.
- 부드럽게 튜브를 flicking하여 박테리아 세포와 파지를 섞습니다.
- 표시기 변형에 적합한 온도는 15-20 분 동안 파지 / 세균 혼합물을합니다 (이상 30 분) 품다.
- 영양 부드러운 한천과 하드 한천 플레이트를 준비 : 흡착이 발생하는 곳에있는 동안 실험실 벤치에서 가열 블록의 두 부드러운 한천 튜브는 (이전에 녹아 55 ° C에 보관) 46-48에서 설정 ° C.
- 녹은 부드러운 한천이 10~15분위한 가열 블록의 온도 equilibrated이어야합니다. 만약 녹은 소프트한천은 15 분 이상 앉아있다, 그것은 응고되기 시작합니다 그리고 하드 한천에 부어 때 대단히 짧은 시간을 형성합니다. 녹은 부드러운 한천은 10 분 미만에 앉아있다면, 그것은 이전 도금에 호스트 세포를 죽이고, 파지 / 세균 혼합물에 추가할 때 너무 더워 될 것입니다. 따라서 잔디가 형성되지 않을 수 및 적거나 없음 plaques가 감지 수 있습니다.
- 파지의 lysate의 시리얼 dilutions을 도금하는 경우 추가로 부드러운 한천 튜브를 준비합니다.
- 최소한 귀하의 이름, 날짜, 성장 매체의 종류, 그리고 "파지"또는 흡착 튜브에 대응하는 "제어"두 영양소 하드 한천 플레이트 플레이트의 하단 (안 뚜껑)의 가장자리 주위 라벨.
- 희석 요인 시리얼 dilutions을 도금면에 표시된 추가 번호판을 포함합니다.
- 하드 한천 플레이트는 뚜껑과 부드러운 한천을 추가로 전에 실온에 미리 예열에 결로가없이 완전히 건조되어야합니다. 번호판이 4 ° C에 저장되어있다면, 그들에게 몇 시간을 제거하거나 다Y 전에. 더 이상 2-3 접시의 작은 정열 스택에 그들을 밖으로 벌리고 그들을 건조하실 수 있습니다. 하드 한천 계층에 과도한 수분이 파지는 플라크 형성하는 동안 부드러운 한천을 통해보다 쉽게 주워 수 있도록 부드러운 한천의 희석을 초래하게됩니다. 따라서 플라크 크기가 증가합니다.
- 플레이트 흡착 튜브는 한 번에 하나는 다음과 같습니다 무균 후 빠르게 컨텐츠를 섞어 손을의 야자수 사이를 회전 부드러운 한천 튜브로 파지 / 세균의 혼합 (약 550 μl 함) 전송 P1000 micropipettor을 사용합니다. 공기 방울이 소개 있도록 튜브를 흔들지 마세요. 왼손에 튜브를 개최하는 것은, 오른손과 하드 한천 플레이트의 뚜껑을 열고 바로 하드 한천 플레이트의 표면에 튜브의 전체 내용을 붓는다. 뚜껑을 닫기 전에 부드럽게 플레이트를 흔들지만, 급속하게 접시의 전체 표면에 녹인 부드러운 한천을 확산그것은 응고 시간이되기 전에. 배양 접시의 측면에 녹인 부드러운 한천을 splashing 피하십시오. 뚜껑을 닫습니다.
- 모든 흡착 튜브를위한 단계 # 9을 한 번에 하나의 튜브를 반복합니다.
- 레벨 표면에 접시를 놓고 부드러운 한천이 확정되기 전까지 그들이 그대로 서 수 있습니다.
- 보통 30 분 충분합니다.
- 인큐베이션에 대한 번호판을 반전.
- 여러 접시는 스택과 부화를 위해 발명된 후 함께 녹화 수 있습니다.
부화 후, 접시는 plaques에 대해 검사됩니다. 부정적인 컨트롤은 세균만을 잔디 (plaques 나타내는 구멍)이 있어야합니다. Plaques은 크기, 모양 및 전반적인 외관의 측면에서 차이가 있습니다. 주어진 파지 유형은 신중하게 멸균 이쑤시개 하나의 플라크의 중심을 때리기와 멸균 microcentrifuge의 t에 inoculum을 전송하여 plaques의 이기종 혼합 가스로부터 격리 수ube는 국물이나 파지 버퍼 100-1000 μl를 포함. 이 lysate는 위에서 설명한 동일한 절차를 사용하여 도금 수 있습니다. 적어도 3-6 역대 단일 상패 isolations는 순수한 파지를 얻을되었는지 확인하는 데 필요한 있습니다. 종종 lysate는 접시에 비 중복 plaques를 생산 titer를 찾기 위해 넓은 범위 (10 -1 ~ 10 -10) 이상 희석해야한다. 숫자는 플라크의 크기에 따라 다릅니다.
6. 복제 플레이트 절차 : 상영 돌연변 Auxotrophs에 대한 세포의 양도
이 기술은 선택 가능한 표현형위한 화면 세포에 수단을 생성, 보조 플레이트에 기본 접시에 세포 성장의 비교를 허용합니다. 첫째 주, 또는 마스터, 원판이 중 하나의 식민지를 생산 희석을 확산 도금이나 격자 표시가 지정한 공간적 패턴의 접시로 전송하여 세포에 주사한다. 성장 inhib와 미디어를 포함하는 보조 플레이트특정 영양이 부족 itors 또는 미디어가 기본 접시 식민지에서 세포로 주사된다. 식민지의 공간적 패턴 기본 판에 벨벳 조각을 눌러서 첫번째 재현하고 있습니다. 그들은 한천보다는 벨벳에 대한 더 큰 친화력을 가지고 있기 때문에 세균 세포는 벨벳을 준수. 벨벳에있는 세포의 인쇄물 그런 다음 기본 판의 같은 식민지 패턴을 반영하는 세포 성장과 함께 여러 보조 플레이트로 전송됩니다. 즉, 다른 한 접시에서 성장 패턴을 복제, 고무 스탬프를 갖는 것과 같다. 그것이 식민지의 비교적 큰 번호가 하나의 실험에 많은 phenotypes에 대한 동시 상영을 허용하기 때문에이 기술은 유리입니다.
- 최소한 귀하의 이름, 날짜, 및 성장 매체의 종류와 한천 플레이트의 하단 (안 뚜껑)의 가장자리 주위에 레이블 : 기본 접시를 준비합니다.
- 함께 접시의 바닥에 격자를 표시적어도 두 개의 동등 간격의 수직 라인과 적어도 두 개의 동등 간격 수평 라인. 번호 결과 사각형합니다.
- 세포 샘플 각 사각형을 예방하기 위해 미리 소독 이쑤시개를 사용하십시오. 각 샘플의 경우, 명인 광장의 중심. 세포와 전체 사각형 (그림 8)를 포함하지 않거나 다른 예제는 incubated 때 자라다와 주변 광장을 오염시킬 것이다.
- 각 사각형은 다른 접시의 국물 문화 혹은 식민지에서 중 파생된 다른 샘플로 주사됩니다.
- 반전과 각종 보조 미디어를 예방하는 데 사용됩니다 기본 판을 품어.
- 차 번호판을 접종 : 기본 판과 모든 차 번호판을 쌓아. 마커로 접시의 측면에 방향 표시를합니다. 마크는 각각의 접시가 아니라 뚜껑의 하단 측면에 있는지 확인하십시오.
- 멸균 벨벳 입은 천으로을 확보하고 원통형 블록 (F에 배치igure 9). 홀더가있는 곳에 벨벳 입은 천으로 잠금. 블록에 방향 표시를합니다.
- 블록은 배양 접시의 바닥 (10.2 cm 직경)와 같은 크기이어야합니다. 그것은 잠금 고리와 함께해야 그 블록 당분간 복제 도금에 클램프는 벨벳 입은 옷감.
- 벨벳 입은 옷감 (15.2 X 15.2 cm 사각형) 미리 소독을해야합니다. 후 30 분간 건조 사이클 (중력 설정)에서 121 ° C에서 압력솥에 넣어 10 또는 12 깨끗한 사각형 그때 알루미늄 호일에 그들을 포장 스택. 복제 도금 실험에서 그들을 사용하기 전에, 그들은 몇 시간 동안 따뜻한 오븐에 그들을 배치하여 완전히 건조해야합니다. 벨벳 입은 사각형 전에 살균에 테이프를 마스킹과 드 linted해야 할 수도 있습니다.
- 벨벳 입은 사각형이 다시 사용할 수 있습니다. 사용되는 벨벳 입은 사각형은 압력솥에서 오염을 제거한 후, 그들은 일반 물에 씻어서해야하고 위에서 설명한 다시 소독.
- 원통형 블록K와 클램프는 (V / V) 에탄올 또는 10 %의 염소 표백제 70%의 린스 간단한와 용도 사이에 소독해야한다.
- 뚜껑을 제거하고 기본 플레이트로 바꾸란. 블록에 마크랑 접시에 방향 표시를 줄입니다. 한천의 표면은 원통형 블록에 벨벳 입은 천으로 접촉에되도록 번호판을 낮춥니다. 살짝하지만 균등 기본 판의 뒷면에 손가락 도움말을 눌러 다음 조심스럽게 블록에서 떨어져 기본 리프트 판. 접시에 뚜껑을 교체합니다.
- 기본 판에서 세포의 벨벳 노출로 만들 수있는 새로운 벨벳 요구 사항을 충족 인상 전에 약 7-8 차 번호판을 예방하는 데 사용할 수 있습니다.
- 보조 플레이트의 각 단계와 7 단계를 반복합니다.
- 긍정적인 컨트롤로서, 시리즈의 마지막 판 테스트 모든 변종이 성장해야하는 한천 배지 여야합니다. 그 세포를 확인할 수 있습니다이 방법은 모든 보조 PL로 전송된시리즈의 ates. 그렇지 않으면, 특정 시험 매체에 대한 성장의 부족은 부족 셀 전송보다는 변형의 표현형 관찰 작용의 수 있습니다.
- 잘못된 반응을 피하기 위해 보조 플레이트는 이상에서 가장 유리한 기판에 주문해야합니다. 그렇지 않으면, 영양분이 세포가 바람직하지 못한 매체에서 성장할 수 있도록 접시 사이에 전송할 수 있습니다.
- 접시와 부화를 반전.
- 참고 : 성장을위한 보조 번호판을 검사하면 성장 및 인쇄물 구분해야합니다. 후자는 부정적인 결과입니다.
7. 작업 공간을 정리하는
- 분젠 버너를 끄고 그 다음 번호판이나 튜브, 추가 미디어 및 기타 시약의 문화를 포함한 모든 물품을 치웠어.
- 실험실 벤치 또는 스토리지 분야에서 축적하는 접시이나 튜브의 여부 옛 문화를 허용하지 마십시오. 오염의 유명한 소스입니다이 샘플,금형 및 원치 않는 세균성 종 등은 즉시 그들이 더 이상 필요하지되면서 폐기되어야합니다.
- 장소는 적절한 처리 콘센트에 labware (장갑, 피펫 팁, kimwipes), 유리 제품 (튜브, flasks, 병) 및 유해 폐기물을 (세균성 문화 또는 파지 솔루션 사용 번호판) 오염. 비 병원성 E. 작업하는 경우 대장균 변형 (BSL-1)만이 아닌 전염성 유해 폐기물이 생성됩니다. 병원성 미생물 (BSL-2 이상)와 동일한 절차를 수행하면 전염성 유해 폐기물이 생성됩니다. 에 관계없이 생물 학적 분류, 유해 폐기물은 autoclaved거나 폐기되기 전에 소독해야합니다. BMBL에 설명된 지침 (5 일 에드.)뿐만 아니라 실험 도중 발생하는 생물 학적 공격의 즉각적이고 적절한 폐기에 대한 제도적 환경 보건 및 안전 부서에서 제공하는 이들을 따르십시오.
- 살균제로 소독 작업 영역을 청소하십시오.
- 손을 씻으십시오철저하게 실험실로 이동하기 전에 살균 비누와 따뜻한 물로.
8. 대표 결과
줄무늬 도금 기법. 탄력 도금을위한 샘플 응용 프로그램은 그림 1에 표시됩니다. 이 절차는 혼합 세포 배양에서 세균 콜로니를 분리에 사용되며 지금까지 미생물학과 분자 유전학의 마스터에 가장 중요한 기술 중 하나입니다. 각 식민지는 유전적으로 동일 세포의 인구를 나타냅니다. 여러 다운 스트림 애플 리케이션의 경우 그것은 하나의 식민지 또는 단일 콜로니 세포와 미디어를 inoculating에 의해 생성된 순수한 세균성 문화를 하나부터 시작 필수적입니다. 예를 들어, 식민지 내의 개별 세포의 형태는 빛을 현미경을 사용하여 검사를 할 수 있습니다. 유전자 정체성은 하나의 식민지로 시작 세포 배양으로부터 격리 게놈 DNA로부터 작은 subunit ribosomal RNA 유전자를 시퀀싱하여 할당할 수 있습니다.그리고 신진 대사 특성은 다양한 생화 학적 및 생리 assays에 전지를 쓰는하여 설명 할 수 있습니다. 오직 순수한 문화와 같은 실험을 수행하여 하나는 특정 미생물 관찰 작용의 속성의 일부가 될 수 있습니다. 결과는 문화가 오염되는 가능성으로 가려하지 않습니다. 줄무늬 판에 걸쳐 세포에 사용되는 악기의 불임이 절차 내내 유지되지 않을 경우 기술적인 오류가 발생할 수 있습니다. 불꽃 루프를 잊고하거나 quadrants 그것이 어려운 하나의 콜로니를 얻을 수 있도록 사이에서 신선한 이쑤시개를 검색합니다. 그들이 특정 성장 조건의 또 다른 세균 종과 협동 조합에 대한 의존으로 일부 세균 종은 순수 문화에 격리 수 없습니다. syntrophs로 언급,이 생물은 공동 배양 조건 하에서 재배 수 있으므로 식민지 (형성된 경우) 항상 두 개 이상의 수종으로 구성되어됩니다. 를 수행할 때 또 다른 과제는 연구실에서 발생환경 시료에서 파생된 세균과 탄력-플레이트 절차는 세포와 같은 E. 등 전통적인 실험실 종자를 이탈 성장 특성을 나타내는 것입니다 대장균. 이러한 박테리아 변종이 한천 플레이트의 큰 섹션에 걸쳐 지사와 (과 같은 세포의 꽉 클러스터의 반대 의미) filamentous있는 식민지를 만들 수 calcified과 탄력 도금 장비에 의한 침투에 따라서 내화물, 또는 끈적 캡슐로 둘러싸여 그래서 개별 식민지들이 분별 할 수 없습니다. 이러한 특성은 어렵게 행진 도금 기법에 의해 하나의 식민지를 정화합니다.
뭔가 뿌린 도금 기술은. 뭔가 뿌린 도금 기술을 통해 식민지는 한천 내에서뿐만 아니라 한천 배지는 따라서 샘플에서 가능한 세포의 수를 셀 수있는 편리한 수단을 제공 표면에 형성하고 있습니다. 이 절차는 산업용 다양한 어플 리케이션에서 사용됩니다. 예를 들어, 폐수 트레에 중요광범위한 정화 과정에 따라 물 샘플을 분석, 국내 상업 및 산업 시설뿐만 아니라 농업 관행에 의해 생성되는 (예, 하수, 실행 - 오프 폭풍에서 빼낸) 액체 폐기물을 청소를 담당 atment 공장. 농업 이외의 식량 작물 관개 용, 주택의 위생 내리는 동안, 산업 냉각 타워에서 - - 처리 폐수 (비 식수)은 다양한 방법으로 재사용되고 그래서 화학 및 미생물의 오염은 무료 여야합니다. 마시는 물 (식수)는 EPA 기준에 따라 정화하여야하고 특정 인간 병원균의 열거 허용 미생물 도금 방법을 사용하여 테스트됩니다. 그림 10과 같이 세균 세포에서 발생하는 세균성 식민지가 공개 음주 분수에서 수집 물 샘플에 존재한다. 그것이 식민지는 식수의 정화 대책을 주어 생산 가능성 세균성 병원균이다;하지만, 미생물은 모든 위치어디 심지어 비 병원성 종자에 의한 오염은 완전히 제거되지, 최소화 할 수 있습니다. 또 다른 예를 들자면, 제약 회사는 생산, 저장 및 수송하는 동안 새로운 약물의 미생물 오염, 또는 bioburden의 정도를 평가해야합니다. 프로세스와 뭔가 뿌린 철판 프로 시저를 사용하여 도금 샘플의 여러 단계 중에 마약을 샘플링함으로써, 미생물 부하, 또는 오염 박테리아의 숫자는 쉽게 확인할 수 있습니다. 예방책 그 후 미생물 오염을 최소화하거나 제거하기 위해 고안 수 있습니다. 뭔가 뿌린 도금 기법을 수행할 때 발생하는 가장 일반적인 기술 오류 중 하나는 덩어리로 녹인 한천의 원인이 식민지가 함께함으로써 플레이트 카운트가 정확하게있는 샘플의 혼합 부적당하다. 너무 뜨거운 경우에 또 다른 잦은 오류가 샘플에서 박테리아 세포의 대부분을 죽이고, 녹인 한천을하고 있는걸. 이러한 실수는 숫자 그 밑을 나타내는 주년을주는 플레이트 카운트의 정확성에 영향을줍니다샘플에서 콜로니 형성 단위의 전자 총 수입니다.
확산 판 기법 있습니다. 확산 플레이트 기술은 가능한 플레이트 카운트를 수행하는 수단으로서의 유틸리티에서 뭔가 뿌린 철판 절차 유사합니다. 확산 판 기법을 사용하여 형성 식민지가 고르게 한천 배지의 표면에 걸쳐 분산되기 때문에 그러나, 개별 식민지에서 세포 (예, 후속 실험 조작에 격리하고 사용할 수있는 탄력 도금 또는 대한 inoculum 등 국물 문화). 확산 판 기법이 중요한 구성 요소입니다 하는데는 3 일반적인 응용 프로그램 강화, 선택과 검진 실험입니다. 세 응용 프로그램에서 원하는 세포 유형은 혼합물 분리될 수 이상의 생화 학적, 생리적, 또는 유전자 검사의 숫자를 받게.
농축 실험은 중간에 혼합 문화를 도금이나 전자에서 번호판을 잠복기 포함원하는 신진 대사 특성, 성장 특성, 또는 행동을 보여주는 샘플 내에 이러한 미생물의 성장을 선호 nvironmental 조건. 이 전략은 문화의 다른 사람에 대한 상대 원하는 미생물의 수가 증가의 다른 생물지만, 결과의 성장을 방해하지 않습니다. 따라서 농축 접시에 형성 식민지 가능성이 원하는 유전자형을 반영 phenotypic 속성을 나타냅니다. 예를 들어, 목표는 다음 질소 결함 매체에 샘플을 도금, 1000 개 이상의 서로 다른 세균 종의 혼합물을 포함하는 환경 시료로부터 질소 고정 균을 배양하는 경우에서이 화합물을 생산할 수있는 이들 세균에 대해 풍부하게합니다 질소 고정에 필요한 유전자의 제품군에서 제공하는 신진 대사 기능을 사용하여 분위기.
선택 실험은 이러한 세포가 그 사기꾼에게 있습니다 매체 혼합 문화를 도금 포함성장 유전자의 특정 유전자 또는 세트를 주석박. 항생 - 저항 유전자를 포함하는 plasmids와 박테리아 변종를 변형하면 이런 유형의 실험은 분자 생물학 실험실에서 일반적입니다. 당신의 목표는 재조합 세포, 또는 성공적으로 다음 항생제의 적절한 농도로 보완되었습니다 중간에 샘플을 도금하는 것은이 특정 약물에 대한 저항력을 전시 이들 세포에 대한 플라스미드 선택합니다 안내한 이들을 육성하는 경우.
심사 실험은 모든 가능한 세포가 성장할 수있는 매체를 혼합 문화를 도금 포함되지만 원하는 유전자형과 세포들은 표현형을 바탕으로 다른 세포를 구분할 수 있습니다. plasmids으로 돌연변이 유발의 assays 또는 복제 유전자를 수행할 때 다시 이런 유형의 실험은 분자 생물학 실험실에서 일반적입니다. 고전적인 예제는 그림 11와 같이, lacZ 유전자 enco을 사용합니다딩 β-갈락토,이 효소는 세포에 자연 기판, 유당의 기판 아날로그, (5 - 브로모 -4 - 클로로 -3 - 인돌릴-β-D-galactopyranoside) X-걸을 잘 대사 수 있습니다. 불용성 블루 제품에 β-갈락토 결과에 의한 X-걸의 절단. 따라서 매체는 X-여자가 포함되어 있으며, 중 야생 유형 (기능적)이나 돌연변이 (비 기능적) lacZ 유전자와 세포를 포함하는 예제는 다음 기능 lacZ을 품고 부화 야생 형 세포에 따라,이 매체에 도금하는 경우 비 기능적 lacZ 유전자와 돌연변이 세포가 unpigmented ( "화이트") 식민지로 나타납니다 동안 유전자는 푸른 색소 식민지로 나타납니다.
기술적인 문제가 한천 표면을 가로질러 세포의 확산 확산 플레이트 기법을 수행하는 방법을 고르지 않습니다 배우는 때 먼저 가장 자주 발생했습니다. 턴테이블과 유리 봉을 사용하는 경우, 샘플은 너무 빨리 그러한 식민지에만 접시의 중앙 근처에 형성되는 흡수 수 있습니다. 승암탉은 "Copacabana 방법"을하고, 유리 구슬은 swirled보다는 한천 표면에 걸쳐 받았습니다. 따라서, 많은 콜로니가 접시의 바깥쪽 가장자리를 따라 성장. 두 경우 모두 콜로니 결과 분포는 세포가 함께 뭉치 수도과 셀 유형 unfeasible의 플레이트 카운트가 부정확하거나 구별하게 중복 식민지로 성장하므로 사용 가능한 전체 표면적을 이용하지 않습니다.
소프트 한천 오버레이 기법. 세균성 식민지를 계산하는 데 사용 확산 판 기법 유사 절차를 집계하여 파지의 숫자로 사용할 수 있습니다. 30 세 사이의 300 세균성 세포 플레이트 카운트 (cfu / ml) 쇼핑을 위해 한천 표면에 걸쳐 반면, 100 사이 400 전염성 파지 입자는 레이어 내에서 상패 카운트를위한 10월 8일에서 10월 9일까지 호스트 세포 (pfu / ml) 쇼핑과 함께 혼합되어 부드러운 한천의 하드 영양 한천의 표면을 가로질러 확산. 별도로 입증하지 않는 한, 그것은 일반적으로 T를 가정합니다모자 하나의 세균 세포는 식민지라는 단일 클러스터에 유전적으로 동일한 세포의 큰 숫자를 구분하고 축적. 이전에 설명한 바와 같이 세포 (즉, 쌍, tetrads, 체인, 또는 클러스터) 움큼 성장 단일 콜로니 형성을 방해 캡슐 등 성장 특성을 표시할 때,이 가설이 유효하지 않습니다. 유사한 가정이 플라크 형성을 위해 만들어진, 그 각 플라크는 단일 파지의 활동을 나타냅니다. 한 파지 하나의 박테리아를 감염하는 경우에만이 문장은 사실입니다. 여러 파지 입자가 하나의 세균을 감염하면 어떻게됩니까? 감염 (방어)의 다수 - - 예제에서 호스트 세포의 개수에 전염성 파지 입자의 비율을 설명하는이 문제는 파지와 실험을 수행할 때 고려되어야하는 중요한 통계적 매개 변수와 관련이 있습니다. 다른 세포 adsorb 오직 하나없이 파지면서, 호스트 세포의 인구는 낮은 입니다만 (≤ 1) T는 일부 세포의 adsorb 하나 이상의 파지에 감염되어야하기 때문에세포 하나 파지 입자 이상에 의해 감염됩니다 가능성을 최소화 O. 파지 주식의 titer를 계산하는 상패 카운트를 수행할 때 기능적 정의로서 플라크 형성 단위 (pfu)를 채택하면 이러한 합병증을 방지합니다.
그림 12에 나타난 바와 같이, 플라크의 형태는 다른 파지을위한 다릅니다. 다른 대형 plaques (패널 B)을 야기할 동안 일부 파지 작은 plaques을 (패널) 생성합니다. 변수의 번호는 플라크 크기에 영향을 미칩니다. 이 다양성에 기여하는 기술적인 이유가 있습니다. 예를 들어, 전체 미디어와 큰 plaques의 두꺼운 하드 한천 지원 개발은 호스트 세포는 시간이 더 긴 기간 동안 파지의 성장을 유지할 수 있기 때문입니다. 호스트 세포의 높은 도금 밀도 (접시 당> 10 9 cfu) 플라크 크기의 감소를 초래하게됩니다. 부드러운 한천의 낮은 농도를 사용하면 부드러운 한천에 파지 입자 확산의 속도를 높이고함으로써 plaques의 크기를 증가합니다. 일 지인하드 한천 플레이트 완전히 오버레이의 부드러운 한천을 dilutes 접시에 그러한 그 결로이나 과도한 수분을 건조하지 않는 경우이 증가된 확산 속도 실수로 발생할 수 있습니다. 이 기술 감독은 특정 파지를위한 플라크 크기에 대하여 일관성없는 결과를 얻을 것입니다.
플라크 크기는 흡착의 효율성, 잠재 기간 (숙주 세포의 용해에 대한 파지 흡착의 기간)의 기간, 그리고 버스트 크기 (가 발표한 자손의 수를 포함하여 숙주 세포 행사의 숫자와 관련되어 단일 감염). 파지 입자들이 박테리아 성장의 다른 단계에 호스트 세포를 감염시킬 경우 플라크 크기의 이종 혼합을 관찰 수 있습니다. 예를 들어, 초기 지수 단계 동안 이들 그 adsorb 그보다 더 많은 자손의 파지와 큰 plaques을 그리 늦은 시간이 기하 급수 단계에서 adsorb. 일반적으로, lytic의 파지는 파지 lysogenic 양식 흐린의 plaques 동안 명확한 plaques를 생성합니다. 호wever 어떤 lytic 파지는 그림 12B에 나타난 '명사수'상패와 같은 흥미로운 패턴을 생산하고 있습니다. 플라크의 가장자리에서 그 세포가 완전히 lysed되지 않거나 감염을 파지에 내성이 될 수 있으므로 이러한 명확한 plaques은 흐린 후광으로 둘러싸여있다. 온대 파지와 관찰 "명사수"패턴은 분명 반지에 둘러싸인 짙은 센터가있는 명판입니다. 이러한 형태 입니다만과 용해-lysogeny 결정에 관하여 숙주 세포의 생리를 반영합니다. 세포를 처음 파지에 감염되면 방어가 부족하고 영양분이 풍부하기 때문에 세포가 빠르게 성장 결합이 lytic 성장을 용이하게합니다. 점점 더 많은 세포를 lysed대로 방어가 증가하고 맑은 플라크 형성. 그들이 흐린 센터와 맑은 상패로 상승을주는 용해 반응 때문에 플라크의 중앙에 Lysogens 그러나, 성장을 계속합니다.
오버레이 기법은 진핵 바이러스와 상패를 assays에 대해 수정할 수 있습니다. 에부드러운 한천의 세균 세포의 잔디에서 동일한 방식으로 박테리오 파지 양식 plaques는 진핵 바이러스 겔이 적용 세포 단일층에 plaques를 형성하고 있습니다. 단일층은 문화 접시의 표면에 나란히 성장하고 서로를 만지지만, 서로의 위에 성장하지 세포 합류 시트입니다. 플라크 분석의이 유형을 수행하기 위해 바이러스의 aliquots는 진핵 세포 감염될 monolayers에 추가됩니다. 그러면 단일층는 아가로 오스 기반 영양소 매체로 덮여 있습니다 -이 젤은 단일층에 인접한 세포에 감염된 세포에서 풀려나는 자손 바이러스의 확산을 제한합니다. 따라서 구형 영역 또는 상패는 virions의 릴리스에 의해 손상된 세포를 포함하는 생산됩니다. 얼룩은 살아있는 세포가 감염과 감염되지 않은 세포 사이의 대조를 제공 세포 배양에 적용할 수있는 plaques, 염료의 시각화에 도움한다.
소프트 한천 오버레이 기법은 플라크의 assays 이외의 실험에 사용됩니다. 첫째, 그것은 s입니다하드 영양 한천은 박테리아의 성장을 허용하는 지원 매트릭스는 것을 기억하기 ignificant. 둘째, 오버레이에 사용되는 소프트 한천은 하드 한천과 다른 영양 성분을 가질 수 있습니다. 이러한 방법으로 부드러운 한천은 다양한 성장 특성이나 신진 대사 특성에 대한 분석 박테리아 변종에 대한 수단이 될 수 있습니다. 예를 들어, 오버레이 기술은 셀룰로오스를 (Teather와 우드 1982) 저하될 수있는 능력을위한 화면 세균으로 사용됩니다. 단일 콜로니 그런 다음 부드러운 한천 카르복시 메틸 셀룰로오스 (CMC)은 하드 한천의 표면에 걸쳐있다 0.1 % (W / V)를 포함하는 비 선택적 하드 한천 배지에서 재배됩니다. 배양 후 플레이트는 부드러운 한천의 식민지 주위에 개간의 영역의 시각화를 허용하는 그 얼룩들로 넘쳐 나고 있습니다. 개간은 매체에서 셀룰로오스를 부셔 세균에 의해 분비 가수 분해 효소에 의해 발생합니다. 최근 오버레이 기술은 methanoge의 성장을 억제 박테리아를 검색하는 데 사용되었습니다NIC의 Archaea는 가축의 제일위 (길버트 외. 2010)에서 발견. 환경 시료로부터 세균의 분리 그러면 식민지가 부드러운 한천 methanogens의 문화를 포함하는으로 overlayed되는 하드 한천 영양 배지에서 재배됩니다. 배양 후 플레이트는 식민지 주변의 성장 억제의 영역에 대한 검사를하고 있습니다. 이 방법은 부드러운 한천의 methanogens의 저해제 생산 세균의 변종을 식별합니다.
너무 뜨겁거나 너무 멋져요 어느 때 부드러운 한천 오버레이 기법으로 발생하는 가장 일반적인 기술 오류가 녹은 부드러운 한천를 따르고있다. 너무 뜨거운 경우 세균성 세포가 중간에 섞인은 도금 이전에 죽게됩니다. 너무 멋져요 경우 하드 한천에 부어 때 다음 부드러운 한천이 대단히 짧은 시간을 형성합니다. 기껏해야 두 경우 모두 결과는 모호하거나 읽을 수 있습니다.
복제 판 절차. 영양소 매체의 한 종류에서 문화를 전송하기몇 가지 변종이 이상이 있는지 다른 성장 요구 사항을 테스트하는 것은 매우 힘드는된다. 복제 도금은 미생물의 수많은 동시 심사를 허용하는 방법입니다. 예를 들어, 야생 형 세포의 문화를 mutagenizing 후, 하나는 확산 판 수있는 문화의 dilutions을 하나의 식민지로 번호판을 얻을 수 있습니다. 차 번호판은 성장을위한 필수적인 특정 화합물을 합성하여 그들이없는 렌더링 biosynthetic 경로에서 유전자 변이를 가지고 야생 형 성장에 필요한 모든 화합물을 합성 prototrophs, 그리고 돌연변이 auxotrophs 포함한 모든 세포의 성장을 지원하는 매체가 포함되어 있습니다. 전체 매체 진입 세포의 혼합물을 도금하여 누락된 영양분 환경에서 최대 취할 수 있습니다. prototrophs 및 auxotrophs 구별하기 위해 식민지는 최소한의 매체에 복제하실 수 있습니다. 오직 prototrophs은 성장 할 수 있습니다. 기본 접시의 공간적 패턴이 보존되기 때문에 comparis기본 판과 보조 접시에 돌연변이 식민지의 식별이 가능합니다. 돌연변이가 더 이상 합성 수없는 어떤 화합물 확인하려면 식민지는 특정 화합물 (예, 아미노산, 탄소 소스, 비타민 등) 보충 최소한 미디어에 복제할 수 있습니다. 이러한 방법으로 식민지 수백 복제 판 프로 시저를 사용하여 동시에 검사 할 수 있습니다. 발생할 수있는 하나의 기술적인 오류가 식민지가 함께 얼룩 판의 모든 문화를 오염에 원인이, 너무 무리입니다 한천 플레이트를 사용하고 있습니다. 이것은 전적으로 신뢰할 수있는 결과를 생산하고 있습니다. 보조 번호판의 벨벳 입은로부터 세포를 전송할 때 다른 기술적인 오류가 너무 많은 압력을 적용하고 있습니다. 다시 말하지만, 보조 번호판을 잠복기 후, 결과 식민지 오히려 auxotrophy보다 오염에 의한 성장 phenotypes 생산 겹칠 수 있습니다.
모든 야생 타입의 미생물 종은 prototrophs 있으므로 복제-P늦은 절차는 동시에 특색있는 성장 요구 사항에 대해 다른 야생 형 변종 차단하는 데 사용할 수 있습니다. 마찬가지로 그림 13과 같이, (패널) YTA라는 완벽한 미디어를 포함하는 그리드 표시된 접시에 중복으로 도금했다 네 가지 모나스 박테리아 변종 세포 "dabs". 변종은 그로부터 3 차 번호판에 복제 (패널 B, C 및 D) 다른 탄소 소스 (acetamide, 유당, 그리고 글리신, 각각)와 보충 최소한 중간 (MSA)으로 구성되었다. 결과는 네 가지 모나스 변종 두 가지 (P. 박테리아와 P. stutzeri)은이 세 가지 탄소 소스에서 재배 수가 없다는 것을 보여줍니다. 컨트롤로서, 종자는 세포가 프로 시저에 걸쳐 전송된 확인 YTA 매체와 사분의 일 판에 복제되었습니다. 네 가지 변종이 YTA 제어 접시에 성장하기 때문에, 성장 결함이 시리즈의 지난 3 접시에 전시되어도 믿을만. 복제 - 도금 결과는 표 1에서 표로하고 있습니다. 일반적으로 만들어진 하나의 오류는 긍정적인 결과로 보조 접시에 성장의 인쇄물을 해석하고 있습니다. 예를 들어, P.의 표현형을 비교 P.의 그것과 박테리아 MSA에 stutzeri + acetamide (패널 B). 후자는 부정적인 결과 성장의 인쇄물을 표시하고, 이전 판의 영양소는 부모 세포로 전송하는 경우 발생할 수 있습니다. 누락된 영양소가 자손 세포에 사용할 수 없기 때문에 어떤 새로운 세포 성장은 발생하지 않습니다. 그것은 실제 성장과 인쇄물을 혼동하기 쉽습니다. 의혹의 경우, 실험 보조 미디어 진입 차 판의 행진 - 도금 세포와 같은 다른 방법을 사용하여 반복해야합니다.
그림 1. 접시 단일 콜로니의 예. 접시의 중앙 부근 핑크 분야는 Serratia marcesc의 식민지입니다엔터 프라이즈 네트워크, 가족 Enterobacteriaceae의 그람 음성, 막대 모양의 Proteobacterium. 축축한 환경에 대한 선호로 인해,이 미생물은 일반적으로 타일 접착제에, 그리고 샤워 커튼에 싱크 분지에서 욕조의 구석에서 성장 발견된다. S.은 marcescens는 prodigiosin이라는 붉은 색소를 생산하고 있기 때문에 인식하기 쉽습니다. 이 접시에 식민지는 24 시간 동안 30 ° C에서 4 분면에 따라 부화에 나타나는 단일 콜로니 함께 행진 도금 기법을 사용하여 생성되었습니다. 다른 세 quadrants은 세포가 중복 식민지로 발전 한천 표면에 입금되는 합류 성장을 보여줍니다.
그림 2. 인스 트루먼 트가 깨져 도금 기술을 위해 사용됩니다. 아래로 위로부터, 이쑤시개 (원형 아니라 평평), 와이어 루프, 일회용 플라스틱 루프, 그리고 나무 막대기가 표시됩니다. 이쑤시개는 일반적으로 전송됩니다사용하기 전에 소독하는 autoclaved 때 다운 후 포일로 덮여 넓은 끝에있는 작은 유리 비커 있습니다. 나무 막대기 그런 다음 사용하기 전에 소독하는 autoclaved 18mm 테스트 튜브로 전송됩니다.
그림 3. 사분 방법을 사용하여 () 탄력 도금 기술. 사전 멸균 루프는 스틱이나 이쑤시개는 접시의 중앙에 가장자리에서 급속한 부드러운, 뒤로 - 및 - 넷째 모션과 한천 표면의 1 분기에 걸쳐 샘플을 확산하는 데 사용됩니다. 이 작업은 접시의 네 quadrants 각각에 대해 반복됩니다. 배양 후, 세포 성장은 접시에 세포를 입금하는 데 사용되는 악기의 경로를 따라 나타납니다. 이 기법을 사용하여 혼합 샘플에있는 세포의 기계적 분리는 (예를 들어, 그림 1 참조) 4 분면에있는 하나의 식민지가 발생한다. 싱글 식민지 (cfu 콜로니 형성 단위이라고합니다). (B) 금속 루프가 탄력-도금에 사용되는 경우, 그것은 inoculum이나 한천 배지와 연락하여 사전에 분젠 버너의 불꽃을 사용하여 소독을해야합니다. 화염의 가장 뜨거운 부분은 푸른 원추형의 일각임을 기억합니다. 악기의 손잡이 지주, 루프 3-4인치 약 성화 속에 전선을 넣습니다. 레드 핫 될 와이어만큼 오랫동안 그것을 둡니다. 불꽃이 루프를 접근하도록 와이어를 이동합니다. 금속 루프가 inoculum를 만지기 전에 냉각되었는지 확인하십시오.
그림 4. 붓고 도금 기술. () 시료의 작은 볼륨 (ML 1.0-0.1 사이) 5.0 ML serological 피펫을 이용하여 비어 있지만 멸균 페트리 접시에 무균 적절합니다. (B) 약 48의 온도 equilibrated 녹아 한천 ° C ~ 그때 샘플로 페트리 접시에 부어있다. 뚜껑을 닫은 후 접시 부드럽게 샘플을 혼합하고 swirled합니다녹은 한천. 한천 나서 접시는 인큐베이션위한 반전되어 약 30 분 동안 응고하도록 허용됩니다.
5 그림. 확산 플레이트 기법 턴테이블과 유리 확장기로. 한천 플레이트가 턴테이블에 배치되면 샘플의 작은 볼륨 (0.1-0.2 ml) 쇼핑 micropipettor을 사용하는 접시의 중앙에 무균 적절합니다. 살포기는 다음 여분의 에탄올을 점화하기위한 분젠 버너의 불꽃을 통해 그것을 통과 에탄올의 비커에 그 파일을 찍기 소독을하고 있습니다. 샘플과 접촉하기 전에, 확장기는 접시의 가장자리 근처 한천로 만져하여 냉각한다. 턴테이블이 천천히 회전하는 동안 확장기는 부드럽게 접시에 걸쳐 샘플을 통해 앞뒤로 이동합니다. 이 작업은 점진적이지만조차 한천 표면에 걸쳐 샘플의 확산 수 있습니다. 뚜껑을 닫은 후 번호판은 벤치 맨 U에 설정해야합니다예제 인큐베이션위한 반전 판 이전 한천에 완전히 흡수 수 있도록 적어도 5 분 ndisturbed.
그림 6. 유리 구슬 (Copacabana 방법)와 확산 판 기법. 압력솥에 미리 소독되어 유리 구슬이 벤치 위에 앉아 한천 플레이트의 표면에 부어있다. 샘플의 작은 볼륨 (100-150 μl) micropipettor를 사용하여 한천의 중심에 무균 적절합니다. 접시의 뚜껑 감으면, 수평 떨고 움직임이 부드럽게 판을 가로질러 앞뒤로 6-7 번 구슬을 이동하는 데 사용됩니다, 샘플을 확산. 이 작업은 접시 60 ° 회전 후 반복됩니다. 떨고 움직임은 다른 60 ° 회전에 따라 세 번이나 반복됩니다. 시료가 완전히 한천 배지에 흡수되면, 구슬은 10 % 표백제가 들어있는 비커로 내려 부어있다.접시 그러면 인큐베이션위한 반전됩니다.
그림 7. plaques의 형성 (또한 상패 분석)에 따라 파지를 분리하고 열거하는 데 사용되는 소프트 한천 오버레이 기법. () 파지의 존재는 부드러운 한천으로 성장하는 세균성 식민지의 합류 정지에 개간의 영역, 또는 plaques으로 감지가 가능하다. T4 파지는 숙주 세포는 자손의 파지를 lyse하고 공개 원인은 호스트, 대장균을 감염시키는 악성를 두 번 좌초된 DNA의 파지입니다. 감염 및 용해, 이웃 중에 여러 회진 후 원래 감염된 숙주 세포를 둘러싼이 지역에서는 대장균 세포는 T4 파지 입자 수십억을 포함하는 상패를 떠나는 사라. T4 파지는 직경 약 1mm입니다 plaques을 생산하고 있습니다. 본 실험에서는 파지의 2 X 10 8 pfu / ML 재고 10 -5 희석 200 μl T4중에 약 300 μl와 혼합되었다 대장균 표시기 전지는 37 ° C.에 기하 급수적으로 성장하고, aerated 문화로 준비 파지와 세균 모두 다음 EHA 하드 한천 플레이트의 표면에 부어 혼합 EHA 부드러운 한천 튜브, 추가되었습니다. 그것이 파지와 세균이 경우에 도금하기 전에 adsorb 수 있도록하기 위해 필요한 아니라고합니다. 부드러운 한천은 20 분 동안 그대로 응고 있도록하면 플레이트는 24 시간 동안 37 ° C에서 반전과 incubated되었다. (B) 이산 식민지가 보이지 않는있는 부드러운 한천의 셀 흐림 중지 파지 입자, 박테리아의 성장 결과를 감염의 부재합니다. 대신,이 경우에는 세균의 세포에도 잔디는 E. 전체 부드러운 한천 계층에 걸쳐 대장균, 양식.
그림 8. 세균 샘플과 기본 플레이트 (마스터)의 작성. 조직 표본을 유지하려면, 접시의 바닥은 격자로 표시하고 발생하는 사각형 번호하실 수 있습니다. 각 예제는 그리드에 사각형을 할당할 수 있습니다. 표시는 정확한 대 잘못된 접종 패턴의 예입니다. 이상적으로, 세포의 작은 숫자가 같은 "명인"예제로 이쑤시개 (세포 # 4)로 멸균 접종 도구를 사용하여 사각형의 중앙으로 전송됩니다. 이러한 세포 # 5 ( "패치")와 셀 # 6 ( "채우기")에 묘사된 것과 같은 일반적인 접종의 실수, 부화에 따라 세균 샘플을 전면에 자라난의 결과, 따라서 오염 인접한 사각형.
그림 9. 표현형 스크린을위한 보조 플레이트 말고도에서 세포를 전송하는 데 사용되는 복제본 도금 기술. 기본 접시 마크 후 벨벳 입은 보상 블록 로우에 마르크에 부합되는 한천 표면 옷감에게 문의할 수 있도록 빨강. 전지는 가볍게하여 판에서 벨벳 입은로 전송되지만 균등하게 손가락 팁을 기본 플레이트를 밟아야한다. 이 작업은 기본 플레이트와 동일한 공간적 패턴의 벨벳 입은에서 세포 샘플 인쇄물을 벗어나게됩니다. 동일한 절차는 벨벳 입은에서 보조 플레이트로 세포를 전송하는 데 사용됩니다. 많은 7-8과 같은 보조 플레이트는 벨벳 입은에서 동일한 기본 플레이트 감동을 이용하여 주사 수 있습니다. 벨벳 입은에서 주사 마지막 판은 긍정적인 제어 역할을한다. 그것은 접시 시리즈 전체에 걸쳐 발생 충분한 셀 전송을 보장, 모든 테스트 변종의 성장을 지원하는 매체이어야합니다. 부화 후, 차 번호판이없이 성장 대 성장을위한 검사 및 채점 수 있습니다. 따라서, 여러 박테리아 변종은 하나의 실험에서 여러 성장 매체에 동시 상영 할 수 있습니다.
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10 그림. 뭔가 뿌린 도금 기법을 사용하여 예제 결과를. 공공 마시는 분수에서 모은 물을 1.0 ML 샘플 멸균 빈 배양 접시에 적절했다. 그렇다면 녹아 있지만 냉각 YTA는 예제와 함께 그릇에 부어되었다. 한천은 또한 100 μg / 물 샘플에 존재했을 수 있습니다 효모 및 곰팡이의 성장을 막기 위해 ML의 cycloheximide가 포함되어 있습니다. 부드럽게 섞어 소용돌이 후 플레이트는 평평한 표면 위에 설정된과 한천이 완전히 응고 허락되었다. 플레이트는 48 시간 동안 37 ° C에서 incubated되었다. 표시된는이 실험의 결과입니다. 경화 매체 하위 표면에 확산 식민지를 억제하기 때문에 아주 작은하며 부정기 형성하는 표면 형태로 대형 원형입니다 식민지, 대 하위 표면 식민지의 모양의 차이를 확인합니다.
11 그림. </ strong>을 확산 플레이트 기법을 사용하여 결과 예. "Copacabana 방법은"판 선별 실험 E. 대장균 세포의 혼합에 사용되었다. 이 경우, 성장 매체 (LB)는 X-걸이 포함되어 있으므로 기능성 β-갈락토 효소 양식 파란 식민지를 표출 이들 세포 중에는 lacZ 유전자의 돌연변이로 셀 및 기능성 β-갈락토 효소 양식을 표현할 따라서 없습니다 백인 식민지. 종종 "화이트 / 블루 스크린"라고, 콜로니의 두 종류가 즉시 동일한 접시에 서로 구분할 수 있습니다.
그림 12. 소프트 한천 오버레이 기법을 사용하여 플라크 분석의 결과 예. 표시된 두 개의 다른 산도에 의해 호스트 변형은 Mycobacterium smegmatis MC 2 155 (ATCC 700084)에 형성된 plaques입니다나이 : () Mycobacteriophage 파괴자, (B) Mycobacteriophage의 MSSS. 이러한 파지는 봄, 2010 년 UCLA 실험실 코스 MIMG 103L의 학생들이 고립되었습니다. M. smegmatis는 비 병원성 Actinobacterium이며 이러한 결핵 (M. 결핵, M. africanum, M. bovis)와 나병 (M. leprae)와 같은 심각한 질병을 일으키는 것으로 알려진 몇 가지 병원균을 포함 mycobacteria의 가족에 속한다. 디스트로 이어의 10 -2 희석하고 MSSS 각 10 -3 희석의 약 50 μl은 M. 500 μl와 incubated되었습니다 37 20 분 smegmatis ° C에서 다음 MBTA (부드러운 한천)과 함께 섞어 접시 (하드 한천) MHA에 부어. 부드러운 한천은 20 분 동안 그대로 응고있게되면 번호판은 48 시간 동안 37 ° C에서 반전과 incubated되었다. 각 파지에 의해 생산된 별개의 플라크의 morphologies를 적어 둡니다. 디스트로이 (A) 소형 형성 (약 1 mm의 평균 직경), lytic 파지의 명확한 plaques이 특징MSSS (B)는 흐린의 후광 (약 3.2 mm의 평균 직경)에 의해 둘러싸인 맑은 센터와 대형 "명사수"plaques을 개발하는 동안. 헷갈리는 고리는 감염을 파지에 강한 있습니다 박테리아로 구성되어있을 수 있습니다. 이 패턴은 흐린 plaques를 생산 lysogenic의 파지에 의해 형성와는 별개입니다.
그림 13. 복제 판 절차를 사용하여 결과 예. acetamide, 락토 오스 및 글리신 : 네 모나스의 변종은 (P. 박테리아, P. putida, P. fluorescens와 P. stutzeri) 세 가지 탄소 소스에 성장을 위해 중복으로 테스트되었습니다. () 기본 판은 표시된 네 가지 변종과 함께 주사 완전한 매체 (YTA)입니다. 24 시간 동안 30 ° C에서 부화에 따라, 네 명 모두 변종이 YTA에서 성장. 기본 플레이트가 날 최소로 복제 판으로 사용되었다dium (MSA)는 하나의 탄소 소스와 보충 : acetamide (B), 유당 (C)과 글리신 (D). 시리즈의 마지막 판은 긍정적인 제어 YTA 플레이트 (E)였다. 과 같이 변종은 보조 플레이트에 부화에 따라 가변적인 성장 패턴을 보여줍니다. 그것이 때로는 성장과 세포의 인쇄물을 구별하기 어렵다 있습니다. 예를 들어, P. 의해 생성된 인쇄물을 비교 P. 의해 같은 3 접시에없이 성장하기위한 세 MSA 플레이트에 stutzeri 박테리아. 모두 P.으로 출전 성장 패턴에 비해 부정적인 결과입니다 putida와 P. fluorescens. 그러나 모든 종자는 긍정적인 제어 플레이트 확인 세포에 성장이 시리즈의 모든 보조 플레이트로 전송되었습니다. 본 실험의 결과는 표 1에서 표로하고 있습니다.
| YTA (주) | MSA + acetamide | MSA + 락토 오스 | MSA + 글리신 | YTA (제어) | |
| P. 박테리아 | + | - | - | - | + |
| P. putida | + | + | + | + | + |
| P. fluorescens | + | + | + | + | + |
| P. stutzeri | + | - | - | - | + |
복제 도금 결과 표 1. 요약. (-) 성장 더하기 기호 (+) 및 빼기 기호로 표현없이 성장으로 지적했다. YTA은 완전한 매체 (효모 tryptone 한천)이며 MSA는 최소한의 매체 (최소한의 소금 한천)입니다. 표시된대로 MSA 판은 단일 탄소 소스와 보충되었다.
Discussion
Culturing의 미생물 무균 기술은 세포와 미디어의 조작에 걸쳐 유지하는 것이 필요한 모든 중 도금 방법의 수를 포함한다. 다섯 가지 절차는이 프로토콜에서 설명되었다. 이러한 도금 기법은 일상적으로 세균과 파지를 조작하는 데 사용하고 있지만, 그들은 또한 (일반적으로 같은 효모 (즉, Saccharomyces의 cerevisiae, 칸디다 albicans, Schizosaccharomyces의 pombe), 해조류 등 분자 유전학에서 사용하고 원생 동물문 포유 동물 세포 배양 및 진핵 미생물에 적용할 수 즉, Volvox, Chlamydomonas, 아메바, Paramecium) 및 nematodes (즉, Caenorhabditis elegans). 또한 연구 미만 실험 목표 또는 유기체에 따라 각각의 도금 방법의 다양한 (그리고 훨씬 더 정교한) 차이가 있습니다. 그러므로, 그것은 단지 방법론 같은 T를 주어진 실험 또는 대상 미생물에 가장 적합한 기술을 선택할뿐만 아니라 봉제에하지하는 것이 중요모자 실험 결과는 적절한 연구 질문이나 문제를 해결합니다.
이 프로토콜에서 언급한 도금 기술의 최신 애플 리케이션 중 일부는 선별 및 약물 발견 실험에 대한 높은 처리량 결과를 얻을 기술 진보를 포함. 예를 들어, 게놈 시퀀싱 센터 E.되는, 확산 도금 클론 라이브러리에 대해 "Copacabana 방법"을 사용 대장균 세포는 미생물의 게놈으로부터 파생된의 DNA 조각을 포함하는 plasmids으로 바꾸었다. 큰 접시 수십개이 (bioassay 트레이라고도 함) 한번에 준비가되어 있기 때문에, 자동 번호판 뿌리는 쟁반의 전체 배치를 위해 유리 구슬을 떨쳐낼하는 데 사용됩니다. 또한, 부화에 따라 다음과 접시에서 콜로니를 선택할 때, 로봇 식민지 따는 사람은 384 잘 microplates의 LB의 국물을위한 inoculum 따라 식민지에서 세포를 수집하는 데 사용됩니다. 이러한 높은 처리량 심사 분석, 확산-P의 절차적 원칙에 대한늦은 기법이 적용될 수 있지만 기술은 여러 단계가 자동화되어 있으며 동시에 짧은 시간 내에 분석해야 할 시료의 큰 숫자를 허용하도록 조정 수 있습니다.
생명 공학 및 제약 회사들은 미생물학과 분자 유전학의 가장 기본적인 기술에 대한 높은 처리량 기술 개발에 상당한 자원을 투자합니다. 예를 들어, 최대 한번에 8 또는 12 샘플에 대해 볼륨 전송을 수행하는 멀티 채널 micropipettors가 없습니다. 심지어 로봇 워크 스테이션 그 책략 96 채널 피펫 머리가있다! 이러한 노력은 실험과 관련된 기계적인 작업을 수행하기 위해 필요한 장비를 개발할 수 있습니다 엔지니어와 컴퓨터 프로그래머가 방법론적인 전문 지식을 가진 생물학 자 페어 링, 과학자의 멀티 징계 팀을 포함됩니다. 에 관계없이 연구에 응용 프로그램의 이러한 기술을 개발 회사에 의해 공동 목표는 동일 - laborato를 자동화공예 프로세스, 도구, 시스템 및 악기, 그들 집중 적은 노동과 더 효율적인.
Disclosures
나는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
샘플 문화권을 설정하고 그림과 함께 지원을 위해 그림을 준비하고 크리스 Reddi와 UCLA의 Bhairav 샤에 대한 Iroc 설계에서 Cori 샌더스에 대한 특별 감사합니다. 이 프로젝트에 대한 자금 지원은 HHMI (HHMI 그랜트 번호 52006944)에 의해 제공되었다.
Materials
1. Yeast Tryptone Agar (YTA)
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C. If preparing tubes for the pour-plate procedure, allow the agar to cool to ~55°C then add 2.0 ml of 50 mg/ml cycloheximide. Aseptically dispense 18.0 ml of the melted agar per 18 mm tube then store at 4°C. The agar will solidify and will need to be melted in a steamer or microwave prior to use. 2. Minimal Salts Agar (MSA) + 0.1% (w/v) carbon source
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C. * Carbon sources used for experiments presented in Figure 13 include acetamide, lactose, and glycine. ** Trace salts solution is prepared in 0.1 N HCl as follows. It is added to the base before sterilization (autoclave at 121°C for 20 minutes).
3. EHA soft agar (0.65 % w/v)
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C. 4. EHA hard agar (1.2% w/v)
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C. 5. 1X Middlebrook Top Agar (MBTA soft agar, 0.5% w/v)
Melt 50 ml of 2XTA and allow it to cool to ~55°C. Using aseptic technique, add the CaCl2 and 7H9 broth to the melted agar. Aseptically dispense 4.5 ml of the mixture per 13 mm tube and store in a 55°C incubator ≤7 days. Cooling MBTA to room temperature or 4°C will cause the CaCl2 to precipitate out of solution. * 100 mM CaCl2. stock must be stored at room temperature to prevent CaCl2 from precipitating out of solution. ** 7H9 liquid medium: Neat
Mix the base with water then add the glycerol while stirring. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Store at 4°C. *** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1.0% w/v)
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Dispense 50 ml aliquots into 100 ml bottles and store at 4°C. 6. Middlebrook 7H10 Agar Plates (MHA hard agar, 1.9% w/v)
Mix the agar base with water then add the glycerol while stirring. Heat the solution to boiling then stir for one minute to completely dissolve the base powder. Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add the following reagents:
* AD supplement
Filter-sterilize this solution; do not autoclave. Store at 4°C. ** Filter-sterilize and store these solutions at 4°C for ≤60 days. 7. LB agar (1.5% w/v) + X-Gal (60 μg/ml)
Autoclave at 121°C for 20 minutes to sterilize. Allow the agar to cool to ~55°C then aseptically add 3.0 ml of 20 mg/ml X-Gal solution. Freshly prepare X-gal stock by dissolving 400 mg X-Gal in 20 ml dimethylformamide (DMF). Table of specific reagents:
Table of specific equipment:
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