Summary
यहाँ, हम एक मानव गर्भनाल रक्त व्युत्पन्न endothelial कॉलोनी के गठन कोशिकाओं (ECFCs) और अस्थि मज्जा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (MSCs), immunodeficient चूहों में subcutaneously एक जेल / कोलेजन fibronectin में एम्बेडेड. देने की पद्धति का वर्णन इस संयोजन / सेल जेल है कि माउस vasculature के साथ जोड़ता है एक मानव संवहनी नेटवर्क उत्पन्न करता है.
Abstract
ऊतक इंजीनियरिंग और ऊतक उत्थान के लिए सेल आधारित चिकित्सा के भविष्य की संभावना हमारे vivo में कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क उत्पन्न करने की क्षमता पर निर्भर करेगा. इस संबंध में, प्रयोगात्मक मॉडल के लिए खोज करने के लिए vivo में रक्त वाहिका नेटवर्क का निर्माण अत्यंत 1 महत्व की है . vivo में bioengineering microvascular नेटवर्क की व्यवहार्यता पहले मानव ऊतक व्युत्पन्न परिपक्व endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) 2-4 का उपयोग कर दिखाया गया था, तथापि, व्यापक नैदानिक इस्तेमाल के लिए ऐसे ऑटोलॉगस endothelial कोशिकाओं मौजूद समस्याओं, क्योंकि वे मुश्किल कर रहे हैं करने के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने और की आवश्यकता मौजूदा vasculature से कटाई. इन सीमाओं ईसीएस के अन्य स्रोतों के लिए खोज उकसाया है. रक्त में endothelial कॉलोनी के गठन कोशिकाओं (ECFCs) की पहचान गैर invasively प्राप्त करने के लिए एक अवसर प्रस्तुत 5-7 ईसीएस. हम और अन्य लेखकों से पता चला है कि वयस्क और गर्भनाल रक्त व्युत्पन्न ECFCs 7-11 vivo में कार्यात्मक संवहनी नेटवर्क के रूप में की क्षमता है. महत्वपूर्ण बात, इन अध्ययनों से यह भी पता चला है कि स्थिर और टिकाऊ संवहनी नेटवर्क प्राप्त करने के लिए, ECFCs perivascular कोशिकाओं के साथ सह आरोपण की आवश्यकता होती है. परख हम यहाँ वर्णन इस अवधारणा को दिखाता है: हम बताते हैं कैसे मानव रक्त व्युत्पन्न कॉर्ड ECFCs एक जेल कोलेजन / fibronectin / फाइब्रिनोजेन में एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में अस्थि मज्जा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) के साथ संयुक्त किया जा सकता है है एक कार्यात्मक मानव फार्म एक immunodeficient चूहे में आरोपण के बाद 7 दिनों के भीतर संवहनी नेटवर्क. मानव ECFC लाइन मेजबान एरिथ्रोसाइट्स युक्त lumens की उपस्थिति न केवल (डी Novo) एक संवहनी नेटवर्क के गठन, लेकिन यह भी मेजबान संचार प्रणाली के साथ कार्यात्मक anastomoses के विकास का संकेत है प्रत्यारोपण भर में देखा जा सकता है. Bioengineered मानव संवहनी नेटवर्क की इस murine मॉडल आदर्श मानव संवहनी नेटवर्क के गठन के सेलुलर और आणविक तंत्र पर अध्ययन के लिए और इंजीनियर के ऊतकों को vascularize रणनीतियों के विकास के लिए अनुकूल है.
Protocol
1. तैयार
- ईजीएम - 2 मध्यम (500 एमएल)
- Endothelial बेसल मध्यम के 395 एमएल (EBM-2) भ्रूण गोजातीय सीरम के 100 एमएल (FBS) जोड़ें.
- 100x समाधान Glutamine-पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन (जीपीएस) के 5 एमएल जोड़ें.
- Hydrocortisone (यानी, VEGF, hFGF बी आर IGF-1, hEGF, हेपरिन, ascorbic एसिड, और GA-1000) के लिए छोड़कर सभी ईजीएम-2 SingleQuots खुराक जोड़ें.
- एक 0.2-सुक्ष्ममापी ध्यान में लीन होना आकार वैक्यूम फिल्टर के साथ निष्फल फ़िल्टर.
- MSCGM मध्यम (500 एमएल)
- Mesenchymal स्टेम सेल बेसल मध्यम (MSCBM) के 440 एमएल के लिए 100x जीपीएस के 5 एमएल जोड़ें.
- MSCGM SingleQuots किट की सभी सामग्री जोड़ें.
- ईजीएम-2 SingleQuots खुराक से hFGF - बी विभाज्य जोड़ें.
- एक 0.2-सुक्ष्ममापी ध्यान में लीन होना आकार वैक्यूम फिल्टर के साथ निष्फल फ़िल्टर.
- DMEM मध्यम (500 एमएल)
- 1x उच्च ग्लूकोज है Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 440 एमएल भ्रूण गोजातीय सीरम के 50 एमएल (FBS) जोड़ें.
- 100x जीपीएस के 5 एमएल जोड़ें.
- Nonessential एमिनो एसिड समाधान के 5 एमएल जोड़ें.
- एक 0.2-सुक्ष्ममापी ध्यान में लीन होना आकार वैक्यूम फिल्टर के साथ निष्फल फ़िल्टर.
- कोलेजन / fibronectin समाधान (, इंजेक्शन के एक ही दिन 3.6 एमएल)
- आसुत एच 2 ओ के 150 μL 10x DMEM 0.4 एमएल जोड़ें
- 1M HEPES के 100 μL (25 अंतिम मिमी) जोड़ें.
- ध्यान गोजातीय कोलैजेन की 2.4 एमएल (5 मिलीग्राम / एमएल शेयर, 3 अंतिम मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने और धीरे बर्फ पर मिश्रण.
- 1N NaOH समाधान जोड़ने (लगभग 30 μL) के द्वारा तटस्थ पीएच को समायोजित करें.
- Phenol लाल सूचक का प्रयोग करें तटस्थ पीएच का आकलन, विकल्प, पीएच परीक्षण कागज का उपयोग करने के लिए पीएच की निगरानी.
- (30 μg / एमएल अंतिम 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर) मानव fibronectin की 120 μL जोड़ें
- FBS की 0.4 एमएल (अंतिम 10%) जोड़ें
- उपयोग करें जब तक बर्फ पर समाधान रहते हैं.
- फाइब्रिनोजेन समाधान (, इंजेक्शन के एक ही दिन 1 एमएल)
- 0.9N NaCl के 1 एमएल (7.4 पीएच) समाधान (30 मिलीग्राम / एमएल अंतिम) पाउडर फाइब्रिनोजेन के 30 मिलीग्राम जोड़ें.
- पहले का उपयोग करने के लिए, 37 में फाइब्रिनोजेन समाधान सेते ° C 30 मिनट के लिए.
- धीरे से पहले जेल / कोलेजन fibronectin के अलावा vortexing, बिना, मिक्स.
- थ्रोम्बिन समाधान (200 एमएल)
- 0.9% NaCl सामान्य नमक (50 यू / एमएल) की 200 एमएल पाउडर थ्रोम्बिन के 1 कू जोड़ें.
- एक 0.2-सुक्ष्ममापी ध्यान में लीन होना आकार सिरिंज फिल्टर और उपयोग करें जब तक दुकान -20 डिग्री सेल्सियस के साथ निष्फल फ़िल्टर.
- पहले उपयोग करने के लिए 0.9% NaCl 10 यू / एमएल के एक एकाग्रता के लिए अंतिम सामान्य नमक के साथ पतला.
- 1% जिलेटिन समाधान (500 एमएल)
- Dulbecco फॉस्फेट के 500 एमएल के 5 ग्राम पाउडर जेलाटीन जोड़ें buffered खारा (पीबीएस).
- 121 ° 30 मिनट के लिए सी Autoclaved.
- एक 0.2-सुक्ष्ममापी ध्यान में लीन होना आकार वैक्यूम फिल्टर के साथ निष्फल फ़िल्टर.
- कोट 1% जिलेटिन कोटिंग समाधान के साथ 100 मिमी टिशू कल्चर प्लेटें
- % 1 के प्रत्येक 100 मिमी ऊतक संस्कृति की थाली के लिए जिलेटिन समाधान के 10 एमएल जोड़ें.
- 37 में प्लेटें सेते ° C 60 मिनट के लिए.
- उपयोग करने के लिए पिछले है, जिलेटिन समाधान निकालने और प्लेटें पीबीएस के साथ एक बार धोने.
2. मानव गर्भनाल की संस्कृति Endothelial कालोनी बनाने कोशिकाओं (ECFCs) रक्त व्युत्पन्न
इस प्रोटोकॉल मानता है ECFC की जमी शीशियों में इस प्रयोग से पहले प्रयोगशाला में उपलब्ध हैं. ECFC या तो गर्भनाल रक्त या वयस्क परिधीय रक्त के रूप में पहले 7 में वर्णित के mononuclear सेल अंश से अलग किया जा सकता है .
- पिघलना ECFCs (आमतौर पर 0.5-1x10 1 ठंड मीडिया की एमएल में 6 कोशिकाओं) की एक शीशी तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक से लिया और तुरंत एक 15 एमएल शंक्वाकार DMEM माध्यम के 10 एमएल युक्त ट्यूब में अपनी सामग्री को कमजोर . 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गर्म मध्यम ईजीएम - 2 के 10 एमएल में सेल गोली resuspend.
- एक 1 जिलेटिन लेपित ऊतक 100 मिमी संस्कृति थाली% में ECFC निलंबन के 10 एमएल जोड़ें. Humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर थाली प्लेस. अगले दिन, धीरे अनबाउंड कोशिकाओं और मध्यम aspirate, और ताजा मध्यम ईजीएम - 2 के 10 एमएल के साथ ही कोशिकाओं फ़ीड.
- थाली फ़ीड हर 2-3 दिनों ईजीएम-2 मध्यम के साथ. कोशिकाओं जैसे कि थाली मिला हुआ सेलुलर monolayer द्वारा कवर किया जाता है का विस्तार करने के लिए अनुमति दें. संगम पर निम्नानुसार कोशिकाओं उपसंस्कृति:
- संस्कृति के माध्यम Aspirate और पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो.
- पीबीएस निकालें और प्रत्येक 100 मिमी प्लेट trypsin - EDTA समाधान के 2 एमएल जोड़ने. धीरे प्लेटें रॉक करने के लिए समान रूप से वितरित trypsin - EDTA समाधान. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस और 5% 3-5 मिनट के लिए सीओ 2. धीरे थाली नल के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत निलंबन में अलग कक्षों को देखने के.
- जब कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग, ईजीएम-2 मध्यम के 8 एमएल जोड़ने और सेल समाधान इकट्ठा15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में tion. Haemocytometer में कोशिकाओं की गिनती और बाहर काम काटा कोशिकाओं की कुल संख्या 10 μL लो.
- प्लेट 1% +५,००० सेल / सेमी की एक बोने घनत्व में जिलेटिन लेपित टिशू कल्चर प्लेटों में कोशिकाओं 2 ईजीएम - दो मध्यम का उपयोग है. इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस और उन्हें हर 2-3 दिनों फ़ीड ईजीएम-2 मध्यम के साथ.
बाद मार्ग के लिए इस कार्यविधि को दोहराएँ. बीतने संख्या का ट्रैक रखें के रूप में सेल की आबादी का विस्तार है. ECFCs मार्ग 4-8 के बीच उपयोग किया जाएगा.
3. मानव अस्थि की संस्कृति मज्जा व्युत्पन्न mesenchymal स्टेम सेल (MSCs)
इस प्रोटोकॉल मानता है मानव एमएससी के जमे हुए शीशियों में इस प्रयोग से पहले प्रयोगशाला में उपलब्ध हैं. एमएससी से अस्थि मज्जा रेस्पायरेट्रस के रूप में पहले 11 में वर्णित अलग किया जा सकता है.
- पिघलना MSCs (आमतौर पर 0.50-1x10 1 एमएल ठंड मीडिया में 6 कोशिकाओं) की एक शीशी तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक से लिया और तुरंत एक 15 एमएल शंक्वाकार DMEM माध्यम के 10 एमएल युक्त ट्यूब में अपनी सामग्री को कमजोर . 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें और गर्म MSCGM माध्यम के 10 एमएल में सेल गोली resuspend.
- एक uncoated ऊतक 100 मिमी संस्कृति की थाली में एमएससी निलंबन के 10 एमएल जोड़ें. Humidified इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर थाली प्लेस. अगले दिन, धीरे अनबाउंड कोशिकाओं और मध्यम aspirate, और ताजा MSCGM माध्यम के 10 एमएल के साथ बाध्य कोशिकाओं फ़ीड.
- प्लेट हर 2-3 दिनों फ़ीड MSCGM मध्यम के साथ. ऐसी है कि थाली मिला हुआ सेलुलर monolayer के 80% तक पहुँच का विस्तार करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति दें. 80% के संगम पर, निम्नानुसार कोशिकाओं उपसंस्कृति:
- संस्कृति के माध्यम Aspirate और पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो.
- पीबीएस निकालें और प्रत्येक 100 मिमी प्लेट trypsin - EDTA समाधान के 2 एमएल जोड़ने. धीरे प्लेटें रॉक करने के लिए समान रूप से वितरित trypsin - EDTA समाधान. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस और 5% 3-5 मिनट के लिए सीओ 2. धीरे थाली नल के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत निलंबन में अलग कक्षों को देखने के.
- जब कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग, MSCGM माध्यम के 8 एमएल जोड़ने और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल समाधान इकट्ठा. Haemocytometer में कोशिकाओं की गिनती और बाहर काम काटा कोशिकाओं की कुल संख्या 10 μL लो.
- प्लेट uncoated टिशू कल्चर प्लेटें में +१०००० सेल / 2 सेमी MSCGM माध्यम का उपयोग बोने घनत्व कोशिकाओं . इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस और उन्हें हर 2-3 दिनों फ़ीड MSCGM मध्यम के साथ.
बाद मार्ग के लिए इस कार्यविधि को दोहराएँ. बीतने संख्या का ट्रैक रखें के रूप में सेल की आबादी का विस्तार है. MSCs मार्ग 4-8 के बीच में इस्तेमाल किया जाएगा.
4. प्रकोष्ठों के समाधान में कोलेजन / fibronectin / फाइब्रिनोजेन Resuspension (0 दिन)
0.8x10 6 ECFCs और 1.2x10 6 MSCs प्रत्येक प्रत्यारोपण और माउस के लिए आवश्यक हो जाएगा, पहले प्रयोग करने के लिए, यकीन है कि वहाँ और संस्कृति में पर्याप्त ECFCs MSCs .
- प्रत्येक संस्कृति की थाली के माध्यम Aspirate और पीबीएस के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो. पीबीएस निकालें और प्रत्येक 100 मिमी प्लेट trypsin - EDTA समाधान के 2 एमएल जोड़ने. धीरे प्लेटें रॉक करने के लिए समान रूप से वितरित trypsin - EDTA समाधान. 3-5 मिनट के लिए सेते हैं. धीरे थाली नल के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप के तहत निलंबन में अलग कक्षों को देखने के.
- जब कोशिकाओं को पूरी तरह से अलग, DMEM माध्यम के 8 एमएल जोड़ने और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सेल समाधान इकट्ठा. Haemocytometer में कक्षों की गणना के लिए और बाहर काम ECFCs और MSCs काटा की कुल संख्या 10 μL लो.
- स्थानांतरण 4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 कोशिकाओं) और 6x10 6 (5x 1.2x10 6 कोशिकाओं) में एक साथ एक एकल 50-एमएल शंक्वाकार ट्यूब MPCs. यह पांच अलग - अलग प्रत्यारोपण और चूहों के लिए आवश्यक कक्षों की कुल राशि है. 1200 rpm पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- धीरे, / कोलेजन fibronectin समाधान (3 मिलीग्राम / एमएल अंतिम फाइब्रिनोजेन एकाग्रता) के 0.9 एमएल फाइब्रिनोजेन समाधान के 100 उल जोड़ने, बर्फ पर मिश्रण रखें.
- बर्फ के ठंडे समाधान कोलेजन / fibronectin / फाइब्रिनोजेन के 1 एमएल पर कक्ष गोली का Resuspend, कोशिकाओं को बहुत धीरे मिश्रण करने के लिए बुलबुले से बचने. एक 1 एमएल बाँझ सिरिंज में मिश्रण लोड, और सिरिंज की नोक पर अपनी टोपी के साथ एक 26 गेज सुई जगह. इंजेक्शन जब तक बर्फ पर लोड सिरिंज रखें.
5. Immunodeficient नंगा माउस में इंजेक्शन (0 दिन)
सभी पशु प्रयोगों 6 सप्ताह पुरानी athymic (/ परमाणु परमाणु) नग्न चूहों के साथ किया जाएगा.
- इंजेक्शन के लिए पहले उन्हें एक गैस चेंबर में isoflurane पहुंचाने रखकर immunodeficient चूहों anesthetize. चूहों लगभग 2 मिनट के लिए isoflurane श्वास जब तक वे anesthetized और पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए अनुत्तरदायी रहे हैं (निरीक्षण द्वारा उनके दिल धड़क रहा है की निगरानी) की अनुमति दें.
- प्रत्येक माउस के लिए, ऊपरी पृष्ठीय एक 26 गेज सुई का उपयोग कर क्षेत्र में subcutaneously थ्रोम्बिन समाधान के 50 μL (10 यू / एमएल) इंजेक्षन.
- इंजेक्शन के बाद, धुंध की एक परत पर आराम और गर्मी के लिए चूहों और जगह उन्हें निरीक्षण जब तक वे चल हो. फिर उसके बाद, चूहों दैनिक निरीक्षण पहले तीन दिनों के लिए.
6. फसल काटने वाले (7 दिन)
- इंजेक्शन के बाद एक सप्ताह, उन्हें एक गैस चेंबर में संकुचित सीओ 2 गैस पहुंचाने रखकर चूहों euthanize.
- एक बार euthanized, इंजेक्शन के क्षेत्र के निकट त्वचा को खोलने में कटौती और शल्य चिकित्सा जेल प्लग हटायें. एक पैमाने के साथ पुनः प्राप्त जेल प्लग के डिजिटल तस्वीरों की सलाह दी जाती है.
- Histological कैसेट में काटा जेल प्लग प्लेस और उन्हें 10% में गहरी तटस्थ formalin कमरे के तापमान पर रातोंरात buffered.
- निर्धारण के बाद, 10% आसुत एच 2 हे के साथ तटस्थ formalin दूर buffered धोने और 4 में histological कैसेट जगह ° पीबीएस सी जब तक histological मूल्यांकन.
7. मूल्यांकन: (एच एंड ई) प्रोटोकॉल और immunohistochemistry (hCD31)
- Histological मूल्यांकन के लिए, प्रत्यारोपण आयल और (7 वर्गों सुक्ष्ममापी मोटी) sectioned प्रक्रियाओं का उपयोग कर मानक histological में एम्बेडेड रहे हैं.
- Hematoxilin और Eosin (एच एंड ई) दाग प्रत्यारोपण के मध्य भाग से लिया वर्गों के मूल्यांकन के द्वारा microvessel घनत्व यों. एच एंड ई धुंधला के लिए मानक प्रोटोकॉल कहीं और पाया जा सकता है. Microvessels lumenal संरचनाओं युक्त लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में पहचाना जा सकता है है. लाल रक्त की औसत संख्या सेल विश्लेषण और जहाजों / 2 मिमी के रूप में व्यक्त क्षेत्रों से भरे microvessels के रूप में रिपोर्ट microvessels घनत्व.
- Immunohistochemically microvascular वाहिकाओं, पुनः प्राप्त प्रत्यारोपण के वर्गों के मानव स्वभाव का प्रदर्शन एक मानव विशिष्ट (hCD31) प्रोटोकॉल का उपयोग कर मानक धुंधला एंटीबॉडी CD31 के साथ दाग होना चाहिए. एक 1:100 कमजोर पड़ने पर, हम DakoCytomation (बिल्ली M0823 # क्लोन JC70A) से मोनोक्लोनल माउस मानव विरोधी CD31 एंटीबॉडी का उपयोग करने की सलाह देते हैं. इस एंटीबॉडी के मानव विशिष्टता नकारात्मक माउस ऊतक वर्गों है कि समानांतर 7,11 में दाग थे की विविधता के साथ प्राप्त प्रतिक्रिया द्वारा पुष्टि की गई है . ध्यान से, माउस रक्त वाहिकाओं अक्सर प्रत्यारोपण के अंदर देखा जाता है (विशेष रूप से सीमा के आसपास), लेकिन माउस वाहिकाओं इस एंटीबॉडी के साथ सकारात्मक दाग नहीं होगा. इसके अलावा, मानव एमएससी की उपस्थिति CD90 या α चिकनी पेशी actin (α-SMA) के खिलाफ मानव विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunohistochemical धुंधला हो जाना द्वारा पता लगाया जा सकता है. मानव एमएससी दोनों नवगठित रक्त वाहिकाओं के perivascular क्षेत्र में और interstitially 11 प्रत्यारोपण भर में स्थित पाए जाते हैं.
8. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. ECFC और एमएससी संस्कृतियों की विशिष्ट उपस्थिति. चरण विपरीत micrographs ECFCs और संस्कृति में MSCs की विशिष्ट उपस्थिति प्रदर्शित. (ए) गर्भनाल रक्त प्राप्त endothelial कोशिकाओं की विशेषता पक्की सड़क पत्थर आकारिकी प्रदर्शित ECFCs मिला हुआ monolayer. (बी) मानव हड्डी MSCs एक धुरी आकार आकारिकी प्रदर्शित मज्जा व्युत्पन्न. Scaler सलाखों, 200 उम.
चित्रा 2. Explanted प्लग के रूप 7 दिन में. मानव गर्भनाल रक्त व्युत्पन्न ECFCs मज्जा व्युत्पन्न MSCs और हड्डी कोलेजन / fibronectin / आतंच जेल में एम्बेडेड थे और नग्न चूहों में प्रत्यारोपित subcutaneously पाठ में वर्णित के रूप में. (ए) 7 दिनों के बाद एक बार माउस euthanized किया गया है, इंजेक्शन के क्षेत्र के निकट त्वचा को खोलने में कटौती और त्वचा flipping द्वारा प्लग / जेल सेल का पर्दाफाश. (बी) प्लग के रूप शल्य चिकित्सा में माउस और formalin निर्धारण करने के लिए पहले से हटा दिया. प्रत्यारोपण के लाल रंग vascularization का एक संकेत है.
चित्रा 3. Explanted प्लग में संवहनी नेटवर्क के histological पहचान. Hematoxilin और Eosin (एच एंड ई) दाग वर्गों explanted प्लग के मध्य भाग से लिया. (ए) कम बढ़ाई (10x) प्रत्यारोपण (पीले लाइन धराशायी द्वारा चिह्नित) आसपास के मेजबान के ऊतकों (यानी, वसा ऊतकों और कंकाल की मांसपेशी) के संदर्भ में प्रदर्शित माइक्रोग्राफ. (बी) उच्च (40x) बढ़ाई माइक्रोग्राफ प्रदर्शित प्लग अंदर एकाधिक (पीले arrowhead उनमें से कुछ पर ओर इशारा करते हुए) microvessels, microvessels lumenal लाल रक्त कोशिकाओं से युक्त संरचनाओं के रूप में पहचाना जा सकता है.
चित्रा 4. मानव के immunohistochemical पहचानlumens Immunohistochemically. दाग वर्गों explanted प्लग के मध्य भाग से लिया. धुंधला DakoCytomation (क्लोन JC70A, बिल्ली M0823 #) से एक मोनोक्लोनल मानव विरोधी CD31 एंटीबॉडी (hCD31) माउस का उपयोग कर एक 1:100 कमजोर पड़ने पर बाहर किया गया, सेल नाभिक hematoxilin साथ counterstained थे. (ए) कम बढ़ाई (10x) प्रत्यारोपण (एक काले डैश्ड लाइन द्वारा चित्रित) मेजबान के ऊतकों के आसपास के संदर्भ में प्रदर्शित माइक्रोग्राफ. मानव विशिष्ट, CD31 पॉजिटिव microvessels भूरे रंग (peroxidase धुंधला) में दाग रहे हैं. (ख) उच्च बढ़ाई माइक्रोग्राफ (40x) प्लग के अंदर कई मानव microvessels (काला arrowhead कुछ hCD31 सकारात्मक lumens तरफ इशारा करते हुए) प्रदर्शित.
Discussion
इस bioengineering मानव संवहनी नेटवर्क के एक प्रयोगात्मक मॉडल है. इस मॉडल की मुख्य विशेषताएं हैं: 1) प्रसवोत्तर ऊतकों (यानी रक्त और अस्थि मज्जा) से अलग मानव कोशिकाओं से microvessels का गठन कर रहे हैं; 2) microvessels एक वयस्क जानवर में गठन कर रहे हैं, और 3) microvessels पूर्व से ही नहीं उठता मौजूदा वाहिकाओं (मेजबान), लेकिन बजाय वे का गठन कर रहे हैं, एकल एक उपयुक्त जेल में निलंबित कोशिकाओं से डी Novo.
Angiogenesis इस परख में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है क्योंकि murine vasculature के लिए कनेक्शन के लिए लाल रक्त कोशिका भरे जहाजों, एक कार्यात्मक इस परख में पढ़ने को प्राप्त करने की जरूरत है. इसके अलावा, मेजबान माइलॉयड कोशिकाओं के शुरुआती दिनों के बाद प्रत्यारोपण में प्रत्यारोपण के लिए भर्ती कर रहे हैं, और वे नए संवहनी 12 बिस्तर के गठन के लिए आवश्यक हैं.
यह प्रयोगात्मक मॉडल एक बहुमुखी, quantifiable, और अपेक्षाकृत सरल मॉडल के लिए vivo में प्रसवोत्तर मानव संवहनी नेटवर्क के गठन का अध्ययन प्रणाली प्रदान करता है . इसके अतिरिक्त, इस परख प्रदर्शन करने के लिए सरल है और यह एक चीरा या शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं है. मॉडल मानव endothelial और perivascular कोशिकाओं के विभिन्न स्रोतों की vasculogenic क्षमता का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. मॉडल विरोधी और / या समर्थक vasculogenic यौगिकों के लिए स्क्रीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. अंत में, मॉडल के लिए विशिष्ट जीन की (ओं) और एक संवहनी मानव endothelium के बना नेटवर्क के गठन समारोह में भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम आंशिक रूप से जेएम एम एनआईएच K99EB009096-01A1 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial Basal Medium, EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot supplements | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin solution, 100x GPS | Mediatech, Inc. | 30-009-CI | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit, MSCBM/MSCGM | Lonza Inc. | PT-3001 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium, 1x DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| MEM Non-essential amino acid solution, 100x NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle, powdered DMEM | Invitrogen | 12100-046 | |
| HEPES Buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| Cultrex Bovine Collagen I solution | Trevigen Inc. | 3442-050-01 | |
| Cultrex Human Fibronectin | Trevigen Inc. | 3420-001-01 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F8630-1G | |
| Gelatin | Fisher Scientific | DF0143-17-9 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| Trypsin-EDTA solution, 1x | Invitrogen | 25300-054 | |
| Isoflurane, liquid for inhalation | Buxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | |
| Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD31 Antibody | Dako | M0823 | Clone JC70A |
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