Summary
ここで、我々は、ヒト臍帯血由来内皮コロニー形成細胞（ECFCs）と皮下免疫不全マウスへのコラーゲン/フィブロネクチンゲルに埋め込まれている骨髄由来間葉系幹細胞（MSCs）を、、実現する方法論を説明します。このセル/ゲルの組み合わせは、マウスの血管系に接続する人間の血管ネットワークを生成します。
Abstract
組織工学や組織再生のための細胞ベースの治療の未来は可能性が生体内で機能的な血管網を生成するために我々の能力に依存します。この点では、生体内で血管のネットワークを構築するための実験モデルの検索では、最も重要な1である。 in vivoでの生物工学の微小血管のネットワークの実現可能性は、最初のヒト組織由来の成熟内皮細胞（ECS）2-4を用いて示されたが、そのような自家内皮細胞広く臨床使用のための本問題は、彼らが十分な量で入手し、必要とすることが困難であるため、既存の血管から採取する。これらの制限は、ECの他の情報源の検索を扇動している。血液中の内皮コロニー形成細胞（ECFCs）の同定非侵襲的に取得する機会が提示さ5-7 ECは。我々と他の著者は、成人および臍帯血由来ECFCs は in vivo 7-11 で機能的な血管網を形成する能力を持っていることが示されている。重要なことは、これらの研究はまた、安定的かつ耐久性のある血管のネットワークを取得することが示されている、ECFCsは血管周囲の細胞と共移植を必要とする。我々はここで説明するアッセイは、この概念を示しています：我々は機能的な人間を形成するコラーゲン/フィブロネクチン/フィブリノーゲンゲル内の単一の細胞懸濁液として、骨髄由来の間葉系幹細胞（MSC）と組み合わせることができる方法のヒト臍帯血由来ECFCs表示免疫不全マウスに移植後7日以内に血管網。ホストの赤血球を含むヒトECFCライニング管腔の存在のみならず血管ネットワークの形成（ デノボ ）だけでなく、ホストの循環系との機能的吻合の発達を示すインプラントを通して見ることができます。遺伝子組み換えヒト血管ネットワークのこのマウスモデルは、理想的に人間の血管ネットワーク形成の細胞および分子メカニズムの研究のためにと設計された組織を血管が発達するための戦略の開発に適しています。
Protocol
1。準備
- EGM - 2培地（500mL）を行う
- 内皮基礎培地395 mLの（EBM - 2）にウシ胎児血清100mLの（FBS）を追加します。
- 100倍グルタミン - ペニシリン - ストレプトマイシン溶液（GPS）5 mLを追加します。
- ヒドロコルチゾン（すなわち、VEGF、hFGF - B、R - IGF - 1、hEGF、ヘパリン、アスコルビン酸、およびGA - 1000）を除くすべてのEGM - 2 SingleQuotsのサプリメントを追加。
- 0.2 -μmの孔径の真空フィルタで滅菌フィルター。
- MSCGMの培地（500 mL）を行う
- 間葉系幹細胞基礎培地（MSCBM）440 mLに100倍GPSの5 mLを追加します。
- MSCGM SingleQuotsキットの全内容を追加します。
- EGM - 2 SingleQuotsサプリメントからhFGF - Bのアリコートを追加。
- 0.2 -μmの孔径の真空フィルタで滅菌フィルター。
- DMEM培地（500 mL）を行う
- 1 ×高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）440 mLにウシ胎児血清を50 mLの（FBS）を追加します。
- 100倍GPSの5 mLを追加します。
- 非必須アミノ酸溶液5mlを追加。
- 0.2 -μmの孔径の真空フィルタで滅菌フィルター。
- コラーゲン/フィブロネクチンソリューションを行う（3.6 mLを、注射の同じ日に行われた）
- 蒸留H 2 Oを150μLに10倍DMEM 0.4 mlを追加する
- 1M HEPES（最終の25 mM）100μLを加える。
- 慎重に、ウシコラーゲンの2.4mLの（5 mg / mLの株、3 mg / mLの最終的な）を追加し、氷上で軽く混ぜる。
- 1N NaOH溶液（約30μL）を添加することにより、中性のpHを調整する。
- 中性pHを評価するために、フェノールレッドのインジケータを使用して、代わりに、pHを監視するためにpH試験紙を使用してください。
- ヒトフィブロネクチンの120μL（;最後の30μg/ mLの1 mg / mLのストック）を追加する
- FBS 0.4mLの（最後の10％）を追加する
- 使用するまで氷上で解決策を保つ。
- フィブリノーゲン溶液を加える（1 mLを、注射の同じ日に行われた）
- 0.9N塩化ナトリウム液（pH7.4）溶液（30 mg / mLの最終的な）を1 mLに粉末フィブリノーゲン30mgを追加します。
- 使用前に、37フィブリノーゲン溶液℃で30分間インキュベートする。
- 前のコラーゲン/フィブロネクチンゲルへの添加、ボルテックスすることなく、穏やかに混合する。
- トロンビン溶液（200mL）を行う
- 0.9％のNaCl生理食塩水（50 U / mL）を200mlに粉トロンビンの1 KUを追加。
- 使用するまで-20 ° Cで0.2μmの孔径のシリンジフィルターとストアとの滅菌フィルター。
- 使用前に、10 U / mlの最終濃度0.9％のNaCl生理食塩水で希釈する。
- 1％ゼラチン溶液（500 mL）を行う
- ダルベッコのリン酸塩の500mLに粉ゼラチン5gを追加するには、緩衝食塩水（PBS）。
- 121℃で30分間オートクレーブ。
- 0.2 -μmの孔径の真空フィルタで滅菌フィルター。
- 1％ゼラチンコーティング液でコーティング 100 - mm組織培養プレート
- 各100 mm組織培養プレートに1％ゼラチン溶液10 mLを追加。
- 37プレートをインキュベート° Cで60分間。
- 使用前に、ゼラチン溶液を除去し、PBSで一回プレートを洗浄。
2。ヒト臍帯血由来内皮コロニー形成細胞（ECFCs）の文化
このプロトコルは、ECFCの凍結バイアルは、この実験前に実験室で利用できると仮定しています。 ECFCは、以前は次の7を説明するように臍帯血または成人末梢血のどちらかの単核細胞分画から単離することができる。
- ECFCsの融解1バイアル（通常は凍結培地1 mLの0.5 × 10 6細胞）は、液体窒素貯蔵タンクから採取し、直ちにDMEM培地10 mLを含む15 mLコニカルチューブにその内容を希釈する。 5分間1200rpmでスピン。上清を取り出し、冷めないようにEGM - 2培地10mLで細胞ペレットを再懸濁します。
- ゼラチンでコーティングされた100 - mm組織培養プレートに1つの1には％ECFC懸濁液10mlを追加。 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーターでプレートを置きます。次の日、穏やかに結合していない細胞と培地を吸引除去し、新鮮なEGM - 2培地10mLで結合した細胞を養う。
- EGM - 2培地で毎年2〜3日プレートを養う。細胞がプレートがコンフルエント細胞の単層によって覆われるように拡張することができます。合流点に、次のように細胞を継代培養：
- 培地を吸引し、PBS 10 mLで細胞を洗浄。
- PBSを削除し、それぞれ100 mmプレートにトリプシン- EDTA溶液2 mlを加え。ゆっくりと均等にトリプシン- EDTA溶液を分散させるプレートを揺らし。 37 ° C、5％3〜5分のためのCO 2。静かに倒立顕微鏡下で懸濁液中の分離された細胞を確認するためにプレートをタップします。
- 細胞が完全にデタッチすると、EGM - 2培地を8mLを追加し、セルのソリューショ収集15 mLコニカルチューブに組み込んで。 haemocytometerで細胞をカウントし、採取された細胞の総数を動作するように10μLを取る。
- EGM - 2培地を用いてプレート5000細胞/ cmの播種密度で1％ゼラチンコート組織培養プレート中の細胞2。インキュベーターでプレートを配置し、EGM - 2培地ですべての2〜3日、それらを養う。
その後の継代に対して、この手順を繰り返します。細胞集団が展開されるように通路の数を追跡します。 ECFCsは通路4から8の間で使用されます。
3。ヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（MSC）の文化
このプロトコルは、人間のMSCの凍結バイアルは、この実験前に実験室で利用できると仮定しています。 MSCは、骨髄から単離することができるとして、以前に11を説明する吸引。
- MSCの融解1バイアル（1mLの凍結のメディアで、通常、0.50〜1 × 10 6細胞）は、液体窒素貯蔵タンクから採取し、直ちにDMEM培地10 mLを含む15 mLコニカルチューブにその内容を希釈する。 5分間1200rpmでスピン。上清を取り出し、冷めないようにMSCGMの培地10mlに細胞ペレットを再懸濁します。
- oneコーティングされていない100 - mm組織培養プレートにMSCの懸濁液10mlを追加。 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーターでプレートを置きます。次の日、穏やかに結合していない細胞と培地を吸引除去し、新鮮なMSCGMの培地の10mLで結合した細胞を養う。
- MSCGM培地ですべての2〜3日プレートを養う。細胞がプレートにコンフルエント細胞の単層の80％に達するように拡張することができます。 80％コンフルエントで、次のようにして細胞を継代培養：
- 培地を吸引し、PBS 10 mLで細胞を洗浄。
- PBSを削除し、それぞれ100 mmプレートにトリプシン- EDTA溶液2 mlを加え。ゆっくりと均等にトリプシン- EDTA溶液を分散させるプレートを揺らし。 37 ° C、5％3〜5分のCO2。静かに倒立顕微鏡下で懸濁液中の分離された細胞を確認するためにプレートをタップします。
- 細胞が完全にデタッチすると、MSCGMの培地8 mLを加え、15 mLのコニカルチューブに細胞溶液を収集する。 haemocytometerで細胞をカウントし、採取された細胞の総数を動作するように10μLを取る。
- プレート10,000細胞/ cm 2と MSCGMの培地を用いての播種密度でコーティングされていない組織培養プレート中の細胞。インキュベーターでプレートを置き、MSCGM培地ですべての2〜3日、それらを養う。
その後の継代に対して、この手順を繰り返します。細胞集団が展開されるように通路の数を追跡します。 MSCは、通路4から8の間で使用されます。
4。コラーゲン/フィブロネクチン/フィブリノーゲン溶液中の細胞の再懸濁（0日）
実験に先立って、文化の中で十分なECFCsとMSCがあることを確認してください。0.8 × 10 6 ECFCsと1.2x10 6 MSCを各インプラントとマウスが必要とされる。
- 各培養プレートの培地を吸引し、PBS 10 mLで細胞を洗浄。 PBSを削除し、それぞれ100 mmプレートにトリプシン- EDTA溶液2 mlを加え。ゆっくりと均等にトリプシン- EDTA溶液を分散させるプレートを揺らし。 3〜5分間インキュベートする。静かに倒立顕微鏡下で懸濁液中の分離された細胞を確認するためにプレートをタップします。
- 細胞が完全にデタッチすると、DMEM培地8mlを追加し、15 mLコニカルチューブに細胞溶液を収集する。 haemocytometerで細胞をカウントし、収穫ECFCsとMSCの合計数を動作するように10μLを取る。
- 転送型4x10 6 ECFCs（5 × 0.8 × 10 6個の細胞）と、単一の50 - mLコニカルチューブに一緒に6 × 6のMPC（5 × 1.2x10 6個の細胞）。これは、5つの個々のインプラントやマウスに必要な細胞の総量です。 1200rpmで遠心し上清を取り除く。
- 優しく、コラーゲン/フィブロネクチン溶液（3 mg / mLの最終フィブリノーゲン濃度）の0.9 mLにフィブリノーゲン溶液の100μLのを追加し、氷上で混合物を保持する。
- 氷冷コラーゲン/フィブロネクチン/フィブリノーゲン溶液1 mLに細胞ペレットを再懸濁し、泡を避けるために非常に穏やかに細胞を混合。 1 mLの滅菌注射器に混合物をロードし、シリンジの先端にはキャップで26ゲージの針を配置。注射まで氷上でロードされた注射器を保管してください。
5。免疫不全ヌードマウスへの注射（0日）
全ての動物実験は、6週齢無胸腺ヌード（NU / NU）マウスを用いて実施されます。
- 注入前に、イソフルラン提供するガス室にそれらを置くことによって、免疫不全マウスを麻酔。彼らは（検査によってそれらの心拍を監視）麻酔とつま先のピンチに反応しなくなるまで、マウスは約2分間イソフルランを吸入することができます。
- それぞれのマウスの場合は、皮下26ゲージの針を使用して、上部背側領域にトロンビン溶液50μL（10 U / mL）を注入する。
- 注入後は、快適さと暖かさのためにガーゼの層の上にマウスを置き、彼らは歩けるようになるまでそれらを観察。それから後、最初の3日間は毎日マウスを観察。
6。収穫（7日目）
- 一週間注射後に、圧縮されたCO 2ガスを供給ガス室にそれらを置くことによって、マウスを安楽死させる。
- かつて安楽死させた、注射のエリア付近の皮膚を切開すると外科的ゲルプラグを取り外します。規模と取得したゲルプラグのデジタル写真をお勧めします。
- 組織学的カセットと10％中性にそれらを深いに収穫されたゲルプラグを置くことは、室温で一晩緩衝ホルマリン。
- 固定後、ニュートラルは蒸留H 2 Oと離れて緩衝ホルマリン10％を洗浄し、4℃組織カセットを配置° PBSでCまでの組織学的評価を。
7。評価：組織学（H＆E）と免疫組織化学（hCD31）
- 組織学的評価のために、インプラントは標準的な組織学的手順を用いてパラフィンと切片（7μmの厚さのセクション）に埋め込まれています。
- インプラントの中央部から採取したヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色した切片の評価によって微小血管密度を定量化する 。 H＆E染色のための標準プロトコルは、他の場所で見つけることができます。血管は赤血球を含む内腔構造として識別することができます。容器/ mm 2のように分析し、発現の分野からの赤血球で満たされた血管の平均数などのレポート微小血管密度。
- 微小血管、取得されたインプラントのセクションの人間性を実証するために免疫組織学的にヒト特異的CD31（hCD31）標準の染色プロトコールを用いて抗体で染色されるべきである。 1:100希釈で、我々は、DakoCytomation（猫＃M0823。クローンJC70A）からモノクローナルマウス抗ヒトCD31抗体を使用することをお勧めします。この抗体のヒトの特異性は、並列7,11で染色したマウスの組織切片の多様性で得られた負の反応によって確認されています。注目すべきは、マウスの血管は、しばしば（特に国境付近）インプラントの内部に見られるが、マウスの血管は、この抗体で陽性染色されません。さらに、人間のMSCの存在は、CD90またはα-平滑筋アクチン（α- SMA）に対するヒト特異的抗体による免疫組織化学的染色によって検出することができます。人間のMSCは、両方とも新しく形成された血管の血管周辺部で発見し、interstitiallyインプラント11に配置されています。
8。代表的な結果
図1。 ECFCとMSCの文化の典型的な外観 。位相差顕微鏡写真は、文化のECFCsとMSCの典型的な外観を表示。内皮細胞の特徴的な敷石石の形態を表示する臍帯血由来ECFCsの（A）コンフルエントな単層。 （B）人間の骨の紡錘形の形態を表示し、MSCを骨髄由来。スケーラーのバー、200ええと。
図2。 7日目での植プラグの外観 。ヒト臍帯血由来の骨髄由来MSCのECFCsと骨はコラーゲン/フィブロネクチン/フィブリンゲルに埋め込まれ、テキストで説明されているようにヌードマウスに皮下移植した。 （A）7日後、マウスを安楽死された後、注入のエリア付近の皮膚を切開すると皮膚を反転させる細胞/ゲルプラグを公開。 （B）プラグインの外観は、外科的にマウスとホルマリン固定前から削除されます。インプラントの赤い色は血管新生の指標です。
図3。外植プラグの血管網の組織学的同定 。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色した切片は、外植プラグの中央部から採取。 （A）周囲の宿主組織のコンテキスト（すなわち、脂肪組織や骨格筋）でインプラントを（黄色の破線で示す）が表示さ低倍率（10倍）顕微鏡写真。 （B）高倍率（40倍）プラグ内部の顕微鏡写真表示、複数の微小血管（黄色の矢印は、そのうちのいくつかを指す）、微小血管は赤血球を含む内腔構造として識別することができます。
図4。人間の免疫組織化学的同定ルーメン。植プラグの中央部から採取した免疫組織化学的染色切片。 1:100希釈で、染色がDakoCytomation（猫＃M0823。クローンJC70A）;からモノクローナルマウス抗ヒトCD31（hCD31）抗体を用いて実施された細胞核をヘマトキシリンで対比染色した。宿主組織を周囲の文脈でインプラントを（黒の破線で線引き）を表示する（A）低倍率（10倍）顕微鏡写真。人間固有の、CD31陽性の血管は、茶色（ペルオキシダーゼ染色）で染色されています。 （B）高倍率（40倍）顕微鏡写真は、プラグイン内で複数の人間の血管（黒い矢印がいくつかhCD31陽性ルーメンを指す）を表示します。
Discussion
これは、生体工学、人間の血管のネットワークの実験的なモデルです。このモデルの主な特徴は次のとおりである：1）微小血管が出生後の組織（すなわち、血液と骨髄）から単離されたヒト細胞から形成される、2）血管が成体動物に形成されている、3）微小血管は、事前から発生していない-既存の（ホスト）の船舶ではなく、それらが適切なゲルに懸濁された単一細胞から、 デノボ 、形成される。
マウス血管系への接続が赤血球で満たされた容器、このアッセイの読み出し機能の一つを達成するために必要とされているため、血管新生は、このアッセイにおいて重要な役割を担っている。さらに、ホストの骨髄細胞は初期の日後の移植でインプラントに動員される、と彼らは新たな血管床12を形成するために必要です。
この実験モデルは、in vivoでヒト血管網の出生後の形成を研究するために、汎用性の定量化、および比較的単純なモデル系を提供しています。さらに、このアッセイは、実行するために簡単であり、切開や手術を必要としません。モデルは、ヒト内皮および血管周囲細胞の異なるソースのvasculogenic可能性を研究するために使用することができる。モデルは、抗および/またはプロvasculogenic化合物のスクリーニングに使用することができる。最後に、モデルは人間の内皮から構成される血管網の形成と機能における特定の遺伝子の役割（複数可）を研究するために使用することができます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作業は、部分的にJM - MにNIHの助成金K99EB009096 - 01A1によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial Basal Medium, EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot supplements | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin solution, 100x GPS | Mediatech, Inc. | 30-009-CI | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit, MSCBM/MSCGM | Lonza Inc. | PT-3001 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium, 1x DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| MEM Non-essential amino acid solution, 100x NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle, powdered DMEM | Invitrogen | 12100-046 | |
| HEPES Buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| Cultrex Bovine Collagen I solution | Trevigen Inc. | 3442-050-01 | |
| Cultrex Human Fibronectin | Trevigen Inc. | 3420-001-01 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F8630-1G | |
| Gelatin | Fisher Scientific | DF0143-17-9 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| Trypsin-EDTA solution, 1x | Invitrogen | 25300-054 | |
| Isoflurane, liquid for inhalation | Buxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | |
| Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD31 Antibody | Dako | M0823 | Clone JC70A |
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