Summary
여기서 우리는 인간의 코드 혈액 유래 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs) 및 골수 - 유래 subcutaneously immunodeficient 마우스로 콜라겐 / fibronectin 겔에 포함된 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)를,.을 제공하는 방법을 설명 이 셀 / 젤 조합은 마우스 vasculature와 연결하는 인간의 혈관 네트워크를 생성합니다.
Abstract
조직 공학 및 조직 재생을위한 세포 기반 치료법의 미래는 가능성이 생체내 혈관의 기능적 네트워크를 생성하는 능력에 의존합니다. 이 점에서, 생체내의 혈관 네트워크를 구축하기 위해 실험 모델에 대한 검색 가장 중요 하나입니다. 생체내에서 생체 공학의 microvascular 네트워크의 가능성은 최초의 인간 조직 파생 성숙 내피 세포 (내장 컴퓨터 시스템) 2-4 사용하여 표시되었다; 광범위한 임상 사용을위한 그러나, autologous 내피 세포는 현재의 문제가, 그들은 충분한 수량의 취득 및 요구하기가 어렵습니다 때문에 기존 vasculature에서 수확. 이러한 제한은 내장 컴퓨터 시스템의 다른 자원에 대한 검색 왔습니다 있습니다. 혈액의 내피 식민지 - 형성 세포 (ECFCs)의 신분이 아닌 invasively 얻을 수있는 기회를 제공하는 것은 5-7 항법. 우리와 다른 저자는 성인과 코드 혈액 파생 ECFCs은 생체내 7-11의 기능 혈관 네트워크를 형성하는 능력을 가지고 것으로 나타났습니다. 중요한 것은 이러한 연구는 또한 안정적이고 내구성이 혈관 네트워크를 얻는 것으로 나타났습니다, ECFCs는 혈관 주위 세포와 공동 주입을 필요로합니다. 우리가 여기서 설명하는 분석이 개념을 보여줍니다 : 우리는 기능적인 인간을 형성하는 콜라겐 / fibronectin / 피브리노겐 젤의 단일 세포 현탁액으로 골수 파생 mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)와 함께 할 수있는 방법을 인간이 코드 혈액 파생 ECFCs보기 immunodeficient 마우스에 주입 후 7 일 이내에 혈관 네트워크. 호스트 적혈구를 포함하는 인간 ECFC 늘어선 루멘의 존재는뿐만 아니라 혈관 네트워크의 형성 (드 노보)뿐만 아니라 호스트 순환 시스템 기능 anastomoses의 발전을 나타내는 이식을 통해 볼 수 있습니다. 새로 개발 했나 인간의 혈관 네트워크의 murine 모델은 이상적으로 인간의 혈관 네트워크 형성 세포와 분자 메커니즘에 대한 연구 및 엔지니어링 조직을 vascularize 전략의 개발에 적합합니다.
Protocol
1. 준비
- EGM - 2 미디어 (500 ML)를 확인
- 내피 기초 매체의 395 ML (EBM - 2) 태아 소 혈청 100 ML (FBS)을 추가합니다.
- 100x 글루타민 - 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션 (GPS)의 5 ML을 추가합니다.
- 하이드로코티손 (즉, VEGF, hFGF - B, R - IGF - 1, hEGF, 헤파린, 아스코르비 산, 그리고 GA - 1000)를 제외한 모든 EGM - 2 SingleQuots 보조를 추가합니다.
- 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터.
- MSCGM 매체 (500 ML)를 확인
- Mesenchymal 줄기 세포 기저 매체 (MSCBM)의 440 ML에 100x GPS의 5 ML을 추가합니다.
- MSCGM SingleQuots 키트의 모든 내용을 추가합니다.
- EGM - 2 SingleQuots 보조에서 hFGF - B의 나누어지는를 추가합니다.
- 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터.
- DMEM 매체 (500 ML)를 확인
- 1X 높은 포도당 Dulbecco의 수정 이글 중간 (DMEM)의 440 ML에 태아 소 혈청 50 ML (FBS)을 추가합니다.
- 100x의 GPS의 5 ML을 추가합니다.
- 불필요한 아미노산 솔루션의 5 ML을 추가합니다.
- 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터.
- 콜라겐 / fibronectin 솔루션 (; 사출로 만든 당일 3.6 ML)를 확인
- 소주 H 2 O. 150 μL에 10X DMEM의 0.4 ML 추가
- 1M HEPES 100 μL (최종 25 MM)를 추가합니다.
- 신중하게, 보빈 콜라겐의 2.4 ML (5 MG / ML 주식, 3 MG / ML 최종)을 추가하고 얼음에 부드럽게 섞는다.
- (약 30 μL) 1N NaOH 용액을 추가하여 중립으로 산도를 조정합니다.
- 중성 산도를 평가하기 위해 페놀 빨간색 표시등을 사용하여, 대안, 산도을 모니터 산도 테스트 용지를 사용합니다.
- (; 30 μg / ML 최종 1 MG / ML 주식) 인간 fibronectin 120 μL 추가
- FBS의 0.4 ML (10 % 최종)를 추가
- 사용 전까지 얼음 솔루션을 유지.
- 피브리노겐 용액 (; 사출로 만든 당일 1 ML)을 확인
- 0.9N NaCl 1 ML (산도 7.4) 솔루션 (30 MG / ML 최종)에 분말 섬유소의 30 밀리그램을 추가합니다.
- 전에 사용, 37에서 피브리노겐 솔루션을 품어 ° C를 30 분.
- 이전 콜라겐 / fibronectin 겔하기 위해뿐만 아니라, vortexing없이 부드럽게 섞는다.
- 트롬빈 용액 (200 ML)를 확인
- 0.9 % NaCl 정상적인 생리 (50 U / ML) 200 ML에 가루 트롬빈의 1 구를 추가합니다.
- 사용하기 전까지 -20 ° C에서 0.2 - μm의 기공 크기 주사기 필터 및 매장과 소독 필터.
- 이전 10 U / ML의 최종 농도 0.9 % NaCl 정상 식염수에 희석 사용합니다.
- 1퍼센트 젤라틴 용액 (500 ML)를 확인
- Dulbecco의 인산염 500 ML에 가루 젤라틴 5g을 추가 호수 (PBS)를 버퍼.
- 121 ° C에서 30 분 Autoclaved.
- 0.2 - μm의 기공 크기 진공 필터 살균 필터.
- 1퍼센트 젤라틴 코팅 솔루션 코트 100 mm 조직 문화 플레이트
- 각 100 mm 조직 문화 판에 1% 젤라틴 용액 10 ML을 추가합니다.
- 37 접시를 품어 ° C를 60 분.
- 사용하기 전에, 젤라틴 용액을 제거하고 PBS로 한 접시를 씻으십시오.
2. 휴먼 코드의 문화 내피 콜로니 - 성형 전지 (ECFCs)를 피를 유래
이 프로토콜은 ECFC의 냉동 유리병이 실험 전에 실험실에서 사용할 수 있습니다 가정합니다. ECFC는 탯줄 혈액이나 이전에 7 설명된대로 성인 말초 혈액 중의 mononuclear 세포 분획으로부터 격리 수 있습니다.
- ECFCs의 해동 한 유리병 (일반적으로 동결 미디어 1 ML 0.5 - 1x10 6 전지)는 액체 질소 저장 탱크에서 가져온 즉시 DMEM 매체 10 ML을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브의 내용을 희석. 5 분 1,200 rpm으로 회전. 뜨는 제거하고 따뜻한 EGM - 2 중간 10 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- 젤라틴 - 코팅 100 - mm 조직 배양 플레이트 하나 1퍼센트에 ECFC 정지 10 ML을 추가합니다. 37 ° C와 5% CO 2에서 humidified 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 다음날, 부드럽게 언바운드 세포와 매체를 대기음, 신선한 EGM - 2 중간 10 ML로 묶인 세포를 공급.
- EGM - 2 미디어와 모든 2~3일 접시를 공급. 세포 접시가 합류 세포 monolayer로 덮여있다 이러한 확장하도록 허용합니다. 코플루엔스에서 다음과 같이 전지를 subculture :
- 문화 매체를 기음과 PBS의 10 ML로 세포를 씻어.
- PBS를 제거하고 각 100 mm 판에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 골고루 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 배포하는 번호판을 바위. 37 품어 ° C와 5% 3~5분에 대한 CO 2. 부드럽게 거꾸로 현미경으로 정지에서 분리 세포를 볼 수있는 접시를 누릅니다.
- 세포가 완전히 분리하면, EGM - 2 배지 8 ML을 추가하고 셀 solu를 수집15 ML 원뿔 관에 기. 혈구계에 세포를 세고 수확한 세포의 총 수를 해결 10 μL를 가져가라.
- 플레이트 EGM - 2 배지를 사용하여 5,000 세포 / cm의 시딩 밀도에 1퍼센트 젤라틴 코팅 조직 문화 접시에있는 세포 2. 인큐베이터에있는 접시를 놓고 EGM - 2 미디어와 모든 2-3일 그들을 먹여 살리지.
이후 구절에 대해이 절차를 반복합니다. 세포 인구가 확장으로 통과 번호를 추적할. ECFCs는 구절 4-8 사이에 사용됩니다.
3. 인간 뼈의 문화 골수 - 유래 Mesenchymal 줄기 세포 (MSCS)
이 프로토콜은 인간 MSC의 냉동 유리병이 실험 전에 실험실에서 사용할 수 있습니다 가정합니다. 골수가로 이전 11 설명한 aspirates에서 MSC는 격리 될 수 있습니다.
- MSCS의 해동 한 유리병 (일반적으로 1 ML 냉동 미디어에 0.50 - 1x10 6 전지)는 액체 질소 저장 탱크에서 가져온 즉시 DMEM 매체 10 ML을 포함하는 15 ML 원뿔 튜브의 내용을 희석. 5 분 1,200 rpm으로 회전. 뜨는 제거하고 따뜻한 MSCGM 매체 10 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- 한 uncoated 100 mm 조직 배양 플레이트에 MSC 서스펜션의 10 ML을 추가합니다. 37 ° C와 5% CO 2에서 humidified 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 다음날, 부드럽게 언바운드 세포와 매체를 대기음, 신선한 MSCGM 매체의 10 ML로 묶인 세포를 공급.
- MSCGM 매체와 모든 2~3일 접시를 공급. 세포 접시 합류 세포 monolayer의 80 %에 도달 이러한 확장하도록 허용합니다. 80 % 코플루엔스에서 다음과 같이 전지를 subculture :
- 문화 매체를 기음과 PBS의 10 ML로 세포를 씻어.
- PBS를 제거하고 각 100 mm 판에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 골고루 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 배포하는 번호판을 바위. 37 품어 ° C와 5% 3~5분을위한 CO2. 부드럽게 거꾸로 현미경으로 정지에서 분리 세포를 볼 수있는 접시를 누릅니다.
- 세포가 완전히 분리하면, MSCGM 매체 8 ML을 추가하고 15 ML 원뿔 튜브에 세포 솔루션을 수집합니다. 혈구계에 세포를 세고 수확한 세포의 총 수를 해결 10 μL를 가져가라.
- 플레이트 10,000 세포 / cm 2 MSCGM 매체를 사용 시딩 밀도에 uncoated 조직 문화 접시에있는 세포. 인큐베이터에있는 접시를 놓고 MSCGM 매체와 모든 2-3일 그들을 먹여 살리지.
이후 구절에 대해이 절차를 반복합니다. 세포 인구가 확장으로 통과 번호를 추적할. MSCS는 구절 4-8 사이에 사용됩니다.
4. 콜라겐 / Fibronectin / 피브리노겐 용액에 셀의 Resuspension (주 0)
0.8x10 6 ECFCs 및 1.2x10 6 MSCS 각 이식 및 마우스 필요합니다, 전에 실험, 문화에 충분한 ECFCs 및 MSCS가 있는지 확인하십시오.
- 각각의 문화 판의 매체를 기음과 PBS의 10 ML으로 세포를 씻으십시오. PBS를 제거하고 각 100 mm 판에 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션 2 ML를 추가합니다. 부드럽게 골고루 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 배포하는 번호판을 바위. 3~5분을위한 부화. 부드럽게 거꾸로 현미경으로 정지에서 분리 세포를 볼 수있는 접시를 누릅니다.
- 세포가 완전히 분리하면, DMEM 매체 8 ML을 추가하고 15 ML 원뿔 튜브에 세포 솔루션을 수집합니다. 혈구계에서 세포를 계산하고 ECFCs 및 MSCS 수확한의 총 수를 해결 10 μL를 가져가라.
- 전송 4x10 6 ECFCs (5 배 0.8x10 6 셀)과 하나의 50 ML 원뿔 관에 함께 6x10 6 MPCs (5 배 1.2x10 6 셀). 이 다섯 개인 이식과 생쥐에 필요한 세포의 총 금액입니다. 1,200 rpm으로 원심 분리기 및 뜨는을 제거하십시오.
- 부드럽게, 콜라겐 / fibronectin 솔루션 (3 MG / ML 최종 피브리노겐 농도)의 0.9 ML로 피브리노겐 용액 100 UL을 추가, 얼음의 혼합물을 유지.
- 얼음 차가운 콜라겐 / fibronectin / 피브리노겐 용액 1 ML에있는 세포 펠렛을 Resuspend, 거품을 피하기 위해 매우 부드럽게 세포를 섞는다. 1 - ML 멸균 주사기에 혼합로드하고, 주사기의 끝에 그 모자와 26 게이지 바늘을 놓으십시오. 사출까지 얼음에 로드된 주사기 보관하십시오.
5. Immunodeficient 누드 마우스에 주입 (주 0)
모든 동물 실험은 6 주 오래된 athymic 누드 (뉴 / 뉴) 생쥐와 함께 진행됩니다.
- 전에 주사로, isoflurane 제공 가스실에 그들을 배치하여 immunodeficient 생쥐를 마취. 그들은 (검사하여 심장 박동을 모니터) anesthetized과 발가락 핀치에 응답하기 전까지는 생쥐가 약 2 분 동안 isoflurane을 흡입하도록 허용합니다.
- 각 마우스, subcutaneously 26 게이지 바늘을 사용하여 상부 등의 영역으로 트롬빈 용액 50 μL (10 U / ML)를 주입.
- 주사 후, 편안함과 따뜻함에 대한 거즈의 레이어에 마우스를 배치하고 그들이 외래 될 때까지 그들을 관찰합니다. 그런 후, 첫 번째 사흘 동안 매일 생쥐를 관찰합니다.
6. 수확 (주 7)
- 한 주 주사 후, 압축 CO 2 가스를 제공 가스실에 그들을 배치하여 쥐를 안락사.
- 일단 euthanized, 사출 영역 근처에 피부를 열고 잘라 수술 겔 플러그를 제거합니다. 규모로 검색 겔 플러그의 디지털 사진을하시기 바랍니다.
- histological 카세트에 수확 겔 플러그를 삽입하고 깊이 10%로가 중립은 실온에서 하룻밤 포르말린을 버퍼.
- 고정 후, 중립은 소주 H 2 O와 함께 거리에 포르말린 버퍼 10 % 씻고 4 histological 카세트를 삽입 ° PBS에서 C까지 histological 평가합니다.
7. 평가 : 조직학 (H & E)와 Immunohistochemistry (hCD31)
- histological 평가를위한, 임플란트는 파라핀 및 표준 histological 절차를 사용하여 (7 μm의 두께 부분) sectioned에 포함됩니다.
- 임플란트의 중간 부분에서 가져온 Hematoxilin과 Eosin (H & E) 스테인드 섹션의 평가에 의해 microvessel 밀도를 계량. H & E의 얼룩 표준 프로토콜이 다른 곳으로 찾을 수 있습니다. Microvessels은 적혈구를 포함 lumenal 구조로 확인할 수 있습니다. 적혈구의 평균 수를 셀 가득한 선박 / mm 2로 분석 및 표현 분야에서 microvessels로 microvessels 밀도보고합니다.
- microvascular 선박, 검색된 보형물의 섹션의 인간의 본성을 설명하는 immunohistochemically 인간 특정 CD31 (hCD31) 표준 얼룩 프로토콜을 사용하여 항체 물들일해야합니다. 1:100 희석에, 우리는 DakoCytomation (CAT # M0823. 클론 JC70A)에서 단클론 마우스 안티 - 인간 CD31 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 이 항체의 인간의 특이성은 병렬 7,11의 스테인드되었습니다 마우스 조직 섹션의 다양성과 함께 얻은 부정적인 반응에 의해 확인되었습니다. 지폐, 마우스 혈관이 자주 (특히 국경 주변) 임플란트 안에 볼 수 있지만, 마우스 선박이 항체와 긍정적인 얼룩이되지 않습니다. 또한, 인간 MSC의 존재는 CD90 또는 α - 평활근의 굴지 (α - SMA)에 대한 인간의 특정 항체와 immunohistochemical 얼룩에 의해 감지하실 수 있습니다. 인간 MSC는 새로 형성된 혈관의 혈관 주위의 지역에서 interstitially 보형물 11 전역에 모두 볼 수 있습니다.
8. 대표 결과
그림 1. ECFC 및 MSC 문화의 전형적인 모습. 위상 콘트라스트 micrographs는 ECFCs과 문화에 MSCS의 전형적인 모양을 표시. 내피 세포의 특성 코블 - 스톤 형태를 표시하는 코드 혈액 파생 ECFCs의 (A) 콘플루앙 monolayer. (B) 인간 뼈 MSCS는 스핀들 모양의 형태를 표시하는 골수 - 유래. 스케일러 바 200 음.
그림 2. 일 7 explanted 플러그의 모양. 인간의 코드 혈액 골수 파생된 파생 MSCS ECFCs과 뼈가 콜라겐 / fibronectin / 섬유소 겔에 포함된하고 텍스트에서 설명한대로 누드 생쥐에 subcutaneously 이식되었다. (A) 7 일 후에 마우스가 euthanized되면 사출 영역 근처에 피부를 열고 잘라 피부를 틀지하여 셀 / 젤 플러그를 노출. (B) 플러그의 모양은 수술 마우스와 포르말린 고정하기 전에에서 삭제되었습니다. 보형물의 붉은 색은 vascularization의 표시입니다.
그림 3. explanted 플러그의 혈관 네트워크의 Histological 식별. Hematoxilin과 Eosin (H & E) 스테인드 섹션 explanted 플러그의 중간 부분에서 가져온. (A) 주변 호스트 조직의 컨텍스트 (즉, 지방 조직과 골격근)의 이식 (노란 점선으로 표시) 표시 낮은 배율 (10X) 현미경. (B) 높은 배율 (40x) 플러그인 내부 현미경 표시 여러 microvessels (노란색 애로 그들 중 일부를 겨누고); microvessels은 적혈구를 포함 lumenal 구조로 확인할 수 있습니다.
그림 4. 인간 Immunohistochemical 식별루멘. Immunohistochemically 스테인드 섹션 explanted 플러그의 중간 부분에서 가져온. 1:100 희석에, 얼룩이 DakoCytomation (CAT # M0823. 클론 JC70A)에서 단클론 마우스 안티 - 인간 CD31 (hCD31) 항체를 사용하여 실시되었다 세포 핵은 hematoxilin와 counterstained되었습니다. (A) 호스트 조직을 둘러싼 상황에서 이식 (검은 점선으로 delineated) 표시 낮은 배율 (10X) 현미경. 인간의 특정, CD31 양성 microvessels은 갈색 (퍼옥시데이즈의 얼룩)에 물들어 있습니다. (B) 높은 배율 (40x) 현미경은 플러그 내부에 여러 인간 microvessels (블랙 애로 일부 hCD31 - 긍정적인 루멘 겨누고)를 표시.
Discussion
이것은 생체 공학 인간의 혈관 네트워크의 실험 모델입니다. 이 모델의 주요 특징은 다음과 같습니다 1) microvessels는 이후 나탈 조직 (즉, 혈액 및 골수)에서 분리된 인간의 세포에서 형성되며 2) microvessels가 성인 동물로 형성하며, 3) microvessels 사전에서 발생하지 - 기존의 적당한 젤에 정지 단일 세포에서 드 노보 (호스트) 혈관 대신 그들은 형성,.
murine vasculature에 연결 적혈구 세포 가득한 선박이 분석에서 읽을 아웃 기능 중 하나를 달성하는 데 필요한 때문에 Angiogenesis이 분석에서 중요한 역할을합니다. 또한, 호스트 골수양 세포는 초기 게시물 이식에서 이식을 모집하고, 그들은 새로운 혈관 침대 12의 형성에 필요한 있습니다.
이 실험 모델은 생체내 인간의 혈관 네트워크의 사후 나탈 형성을 연구하는 다용도, 같지는하고, 비교적 간단한 모델 시스템을 제공합니다. 또한이 분석은 수행하는 간단하고 그것은 절개하거나 수술을 필요로하지 않습니다. 모델은 인간의 내피와 혈관 주위 세포의 서로 다른 소스의 vasculogenic 가능성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 모델은 방지 및 / 또는 프로 vasculogenic 화합물에 대한 화면으로 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 모델은 인간의 내피로 구성된 혈관 네트워크의 형성과 기능에서 특정 유전자의 역할 (들)을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 부분적으로 JM - M에 NIH 부여 K99EB009096 - 01A1에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial Basal Medium, EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot supplements | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin solution, 100x GPS | Mediatech, Inc. | 30-009-CI | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit, MSCBM/MSCGM | Lonza Inc. | PT-3001 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium, 1x DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| MEM Non-essential amino acid solution, 100x NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle, powdered DMEM | Invitrogen | 12100-046 | |
| HEPES Buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| Cultrex Bovine Collagen I solution | Trevigen Inc. | 3442-050-01 | |
| Cultrex Human Fibronectin | Trevigen Inc. | 3420-001-01 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F8630-1G | |
| Gelatin | Fisher Scientific | DF0143-17-9 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| Trypsin-EDTA solution, 1x | Invitrogen | 25300-054 | |
| Isoflurane, liquid for inhalation | Buxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | |
| Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD31 Antibody | Dako | M0823 | Clone JC70A |
References
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