Summary
Здесь мы описываем методологию для доставки человека пуповинной крови эндотелиальных полученных колониеобразующих клеток (ECFCs) и костного мозга, полученные мезенхимальные стволовые клетки (МСК), внедренного в коллаген / фибронектина гель, подкожно в иммунодефицитных мышей. Эта ячейка / гель сочетание создает человека сосудистой сети, которая соединяется с мышью сосудов.
Abstract
Будущее тканевой инженерии и клеточной терапии для регенерации тканей, скорее всего, рассчитывать на нашу способность генерировать функциональный сосудистой сети в естественных условиях. В связи с этим поиск экспериментальных моделей для построения сетей кровеносных сосудов в естественных условиях имеет первостепенное значение 1. Возможности биоинженерии микрососудистых сетей в естественных условиях впервые был показан с использованием человеческих тканей полученных зрелых клеток эндотелия (ECS) 2-4, однако такие аутологичных клеток эндотелия проблемы для широкого клинического применения, так как их трудно получить в достаточных количествах и требуют уборки из существующих сосудов. Эти ограничения возбуждено искать другие источники ECS. Идентификации эндотелиальных колониеобразующих клеток (ECFCs) в крови представил возможность неинвазивно получать этике 5-7. Мы и другие авторы показали, что взрослые и пуповинной крови, полученных ECFCs имеют способность образовывать функциональные сосудистой сети в естественных 7-11. Важно, что эти исследования также показали, что для получения стабильных и прочных сосудистой сети, ECFCs требуют совместного имплантации периваскулярных клеток. Анализ описанных здесь иллюстрирует эту концепцию: мы покажем, как человека пуповинной крови полученных ECFCs могут быть объединены с костномозгового происхождения мезенхимальные стволовые клетки (МСК), как суспензии отдельных клеток в коллаген / фибронектина / фибриногена гель для формирования функциональной человека сосудистой сети в течение 7 дней после имплантации в иммунодефицитных мышей. Присутствие человека ECFC подкладке люмен содержащие хост эритроцитов можно увидеть во всем имплантатов указывает не только образования (заново) сосудистой сети, но и разработка функциональных анастомозы с кровеносной системы хозяина. Это мышиной модели биоинженерных человека сосудистой сети идеально подходит для исследований на клеточном и молекулярных механизмов человеческой сосудистой формирование сети и разработку стратегий vascularize инженерии тканей.
Protocol
1. Подготовка
- Сделать EGM-2 средних (500 мл)
- Добавить 100 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) до 395 мл эндотелиальной базальной среды (ДМ-2).
- Добавьте 5 мл 100x Глютамин-пенициллин стрептомицин решение (GPS).
- Добавить все EGM-2 SingleQuots добавки, за исключением гидрокортизона (то есть, VEGF, hFGF-B, R-ИФР-1, hEGF, гепарин, аскорбиновая кислота, и GA-1000).
- Фильтр стерилизуют 0,2-мкм поры фильтра вакуумной размера.
- Сделать MSCGM средой (500 мл)
- Добавьте 5 мл 100x GPS до 440 мл мезенхимальных стволовых клеток базальной среды (MSCBM).
- Добавьте все содержимое комплекта MSCGM SingleQuots.
- Добавить hFGF-B аликвоту из EGM-2 SingleQuots добавок.
- Фильтр стерилизуют 0,2-мкм поры фильтра вакуумной размера.
- Сделать DMEM среде (500 мл)
- Добавьте 50 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) до 440 мл 1x высокий уровень глюкозы в Дульбеко изменения Eagle Средняя (DMEM).
- Добавьте 5 мл GPS-100x.
- Добавьте 5 мл несущественные аминокислоты кислотный раствор.
- Фильтр стерилизуют 0,2-мкм поры фильтра вакуумной размера.
- Сделать коллаген / фибронектина решение (3,6 мл, сделал тот же день инъекции)
- Добавить 0,4 мл 10х DMEM до 150 мкл дистиллированной H 2 O.
- Добавить 100 мкл 1М HEPES (25 мМ финал).
- Осторожно, добавить 2,4 мл бычьего коллагена (5 мг / мл состава; 3 мг / мл заключительный) и аккуратно перемешать на льду.
- Отрегулируйте рН к нейтральному, добавляя 1N NaOH раствора (примерно 30 мкл).
- Используйте фенол красный индикатор для оценки нейтральный рН, альтернатива, используйте бумагу рН тест для контроля рН.
- Добавить 120 мкл человеческого фибронектина (1 мг / мл состава; 30 мкг / мл окончательный)
- Добавить 0,4 мл ФБС (10% окончательный)
- сохранять раствор на льду до использования.
- Сделать фибриногена раствор (1 мл, сделал тот же день инъекции)
- Добавить 30 мг порошкообразного фибриногена в 1 мл 0.9N NaCl (рН 7,4) раствор (30 мг / мл, финал).
- Перед использованием, инкубировать фибриногена раствора при температуре 37 ° С в течение 30 минут.
- Осторожно перемешать, без вортексе до его помимо коллагена / фибронектина геля.
- Сделать тромбина решение (200 мл)
- Добавьте 1 КУ порошковых тромбина до 200 мл 0,9% физиологического раствора NaCl (50 ед / мл).
- Фильтр стерилизуют 0,2-мкм поры фильтра размера шприца и храните при температуре от -20 ° C до использования.
- Перед использованием разбавить 0,9% физиологическим раствором NaCl до конечной концентрации 10 ед / мл.
- Сделать 1% раствора желатина (500 мл)
- Добавить 5 г порошкового желатина 500 мл фосфатного Дульбеко солевым буфером (PBS).
- В автоклаве при 121 ° С в течение 30 мин.
- Фильтр стерилизуют 0,2-мкм поры фильтра вакуумной размера.
- Пальто 100-мм пластин культуре ткани с добавлением 1% раствора желатина покрытием
- Добавьте 10 мл 1% раствора желатина, чтобы каждый 100-мм пластины культуры ткани.
- Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 60 мин.
- Перед использованием удалите раствор желатина и промыть пластины сразу с PBS.
2. Культуры прав пуповинной крови-Производные Эндотелиальная колониеобразующих клеток (ECFCs)
Этот протокол предполагает, замороженных флаконов ECFC доступны в лаборатории до этого эксперимента. ECFC может быть изолирован от одноядерных фракции клеток либо пуповинной крови или взрослого периферической крови, как описано выше 7.
- Оттепель один флакон ECFCs (как правило, 0,5-1x10 6 клеток в 1 мл замораживания средств массовой информации), взятые из бака хранения азота и сразу же разбавлять его содержание в 15-мл коническую трубку, содержащую 10 мл среды DMEM. Спиновые при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл теплой EGM-2 среды.
- Добавить 10 мл ECFC подвески в один 1% желатина покрытием 100-мм пластины тканевой культуры. Место пластины в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. На следующий день, мягко аспирата из несвязанных клеток и среды, и кормить связаны клеток с 10 мл свежего EGM-2 среды.
- Поток пластины каждые 2-3 дня с EGM-2 среды. Разрешить клетки расширить так, что пластина покрыта сотовой сливающийся монослой. При слиянии, субкультура клетки следующим образом:
- Аспирацию из культуральной среды и промыть клетки с 10 мл PBS.
- Удалить PBS и добавьте 2 мл трипсина-EDTA раствора в каждую 100-мм пластины. Осторожно пластин, чтобы равномерно распределить трипсина-EDTA решение. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 3-5 минут. Аккуратно нажмите на пластину, чтобы увидеть отдельные клетки в суспензии под инвертированным микроскопом.
- Когда клетки полностью отделить, добавить 8 мл EGM-2 средних и собирать ячейки решенияции в 15-мл коническую трубку. Возьмите 10 мкл для подсчета клеток в гемоцитометра и выработать общее число клеток, полученных.
- Пластина клеток в 1% желатина покрытием культуре ткани пластин при плотности посева в 5000 клеток / см 2, используя EGM-2 среды. Место пластин в инкубаторе и кормить их каждые 2-3 дня с EGM-2 среды.
Повторите эту процедуру для последующих проходов. Следите за пассаж как клеточной популяции расширяется. ECFCs будет использоваться между проходы 4-8.
3. Культуры прав костномозгового происхождения мезенхимальные стволовые клетки (МСК)
Этот протокол предполагает, замороженных флаконов человека MSC доступны в лаборатории до этого эксперимента. MSC может быть выделена из костного мозга всасывает, как описано выше 11.
- Оттепель один флакон МСК (как правило, 0,50-1x10 6 клеток в 1 мл замораживания средств массовой информации), взятые из бака хранения азота и сразу же разбавлять его содержание в 15-мл коническую трубку, содержащую 10 мл среды DMEM. Спиновые при 1200 оборотов в минуту в течение 5 мин. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 10 мл теплой среде MSCGM.
- Добавить 10 мл суспензии MSC в один без покрытия 100-мм пластины культуры ткани. Место пластины в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. На следующий день, мягко аспирата из несвязанных клеток и среды, и кормить связаны клеток с 10 мл свежей среды MSCGM.
- Поток пластины каждые 2-3 дня, со средним MSCGM. Разрешить клетки расширить так, что пластинка достигает 80% от сливной сотовой монослоя. У 80% слияния, субкультура клетки следующим образом:
- Аспирацию из культуральной среды и промыть клетки с 10 мл PBS.
- Удалить PBS и добавьте 2 мл трипсина-EDTA раствора в каждую 100-мм пластины. Осторожно пластин, чтобы равномерно распределить трипсина-EDTA решение. Инкубировать при 37 ° С и 5% СО2 в течение 3-5 минут. Аккуратно нажмите на пластину, чтобы увидеть отдельные клетки в суспензии под инвертированным микроскопом.
- Когда клетки полностью отделить, добавить 8 мл средней MSCGM и собирать ячейки раствор в 15-мл коническую трубку. Возьмите 10 мкл для подсчета клеток в гемоцитометра и выработать общее число клеток, полученных.
- Пластина клеток в ткани без покрытия пластин культуры в посевной плотностью 10000 клеток / см 2, используя MSCGM среды. Место пластин в инкубаторе и кормить их каждые 2-3 дня, со средним MSCGM.
Повторите эту процедуру для последующих проходов. Следите за пассаж как клеточной популяции расширяется. МСК будет использоваться между проходы 4-8.
4. Ресуспендирования клеток в коллаген / Фибронектин / фибриногена Решение (день 0)
До эксперимента, убедитесь, что Есть достаточно ECFCs и МСК в культуре; 0.8x10 6 ECFCs и 1.2x10 6 МСК будут необходимы для каждого имплантата и мышь.
- Аспирацию из среды каждая культура пластины и промыть клетки с 10 мл PBS. Удалить PBS и добавьте 2 мл трипсина-EDTA раствора в каждую 100-мм пластины. Осторожно пластин, чтобы равномерно распределить трипсина-EDTA решение. Инкубируйте в течение 3-5 минут. Аккуратно нажмите на пластину, чтобы увидеть отдельные клетки в суспензии под инвертированным микроскопом.
- Когда клетки полностью отделить, добавить 8 мл среды DMEM и собирать ячейки раствор в 15-мл коническую трубку. Возьмите 10 мкл для подсчета клеток в гемоцитометра и выработать общее количество ECFCs и МСК собраны.
- Передача 4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 клеток) и 6x10 6 ПДК (5x 1.2x10 6 клеток) в единую 50-мл коническую трубку. Это общее количество клеток, необходимых для пяти индивидуальных имплантатов и мышей. Центрифуга при 1200 оборотах в минуту и удалите супернатант.
- Осторожно, добавьте 100 мкл Фибриноген решение до 0,9 мл коллагена / фибронектина решения (3 мг / мл конечная концентрация фибриногена); держать смесь на льду.
- Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл ледяной коллаген / фибронектина / фибриногена решения; смешивать клетки очень осторожно, чтобы избежать пузырей. Нагрузка смесь в 1-мл стерильного шприца, и место 26-иглы с ее вершины на кончике шприца. Держите шприц загружается на льду до инъекции.
5. Инъекция в иммунодефицитом, обнаженная Мышь (день 0)
Все эксперименты на животных, будет осуществляться с 6-недельных athymic ню (ню / ню) мышей.
- До инъекции, анестезия иммунодефицитных мышей, сгруппировав их в газовую камеру доставки изофлуран. Разрешить мышей вдохнуть изофлуран в течение примерно 2 минуты, пока они не под наркозом и не отвечает на носок щепотку (контроль за их бьется сердце, инспекции).
- Для каждой мыши, вводят 50 мкл раствора тромбина (10 Ед / мл) подкожно в верхней области спины использованием 26-иглы.
- После инъекции место мыши на слой марли для комфорта и тепла и наблюдать за ними, пока они не стали амбулаторно. Затем, после, наблюдать мышей в день в течение первых трех дней.
6. Сбор (День 7)
- Через неделю после инъекции, усыпить мышей, сгруппировав их в газовую камеру доставки сжатого CO 2 в газе.
- После эвтаназии, разрезать кожу вблизи области инъекции и хирургическим путем удалить гель пробки. Цифровые фотографии получены гель пробки с масштаба рекомендуется.
- Место собрано пробки геля в гистологических кассет и глубокого их в 10% нейтральном буферном растворе формалина в течение ночи при комнатной температуре.
- После фиксации, вымыть 10% нейтральный буферный формалин покончить с дистиллированной H 2 O и место гистологических кассет при 4 ° С в PBS до гистологического исследования.
7. Оценка: Гистология (H & E) и иммуногистохимии (hCD31)
- Для гистологического исследования, имплантаты в парафин и секционные (7 мкм толщиной секций) с использованием стандартных гистологических процедур.
- Количественная плотность микрососудов по оценке гематоксилином и эозином (H & E) окрашенных срезов, взятых из средней части имплантатов. Стандартные протоколы для H & E окрашивание может быть найден в другом месте. Микрососудов могут быть идентифицированы как lumenal структур, содержащих красные кровяные клетки. Доклад микрососудов плотности, как среднее количество красных кровяных клеток заполненных микрососудов с полей анализируются и в виде судов / мм 2.
- Чтобы продемонстрировать человеческую природу микрососудистых сосудов, участки получены имплантат должен быть иммуногистохимическое окрашивали человека конкретных CD31 (hCD31) антител с помощью стандартных протоколов окрашивания. Мы рекомендуем использовать мышь моноклональное анти-CD31 антител человека из DakoCytomation (Clone JC70A;. Кошка # M0823) в 1:100 разбавления. Человека специфику этого антитела было подтверждено негативную реакцию, полученные с разнообразием мыши срезах тканей, что были окрашены в параллельном 7,11. Следует отметить, что судами мыши крови часто видели внутри имплантатов (особенно в мире границу), но мышь суда, не запятнал положительным с этим антителом. Кроме того, присутствие человека MSC можно обнаружить с помощью иммуногистохимического окрашивания с деятельностью человека специфических антител против CD90 или α-актин гладких мышц (α-SMA). MSC человек находятся как в периваскулярные области новообразованных кровеносных сосудов и interstitially расположенных по всей имплантата 11.
8. Представитель Результаты
Рисунок 1. Типичный вид ECFC и MSC культур. Микрофотографии фазового контраста отображения типичных появление ECFCs и МСК в культуре. (А) Сливной монослой пуповинной крови полученных ECFCs отображения характерных булыжником морфологии клеток эндотелия. (Б) Человеческие костномозгового происхождения МСК отображения морфологии шпинделя формы. Scaler баров, 200 мкм.
Рисунок 2. Появление эксплантированных пробки на 7 день. Кровь человека полученных шнур ECFCs и костного мозга, полученных МСК были встроены в коллаген / фибронектина / фибрина гель и имплантированный под кожу безволосых мышей, как это описано в тексте. (А) Через 7 дней после того, как мыши были подвергнуты эвтаназии, разрезать кожу вблизи области инъекции и подвергать ячейки / гель плагин, щелкая кожи. (В) Внешний вид плагина удалены хирургическим путем от мыши и до формалина фиксации. Красный цвет имплантат указанием васкуляризации.
Рисунок 3. Гистологическая идентификация сосудистой сети в эксплантированных зажигания. Гематоксилином и эозином (H & E) окрашенных срезов, взятых из средней части эксплантированных зажигания. () Низкая увеличением (10x) микрофотография отображения имплантата (отмечены желтым пунктиром) в контексте окружающих тканей хозяина (то есть, жировой ткани и скелетных мышц). (В) Высокое увеличение (40x) микрофотография отображение нескольких микрососудов (желтые стрелки указывают на некоторые из них) внутри плагина; микрососудов могут быть идентифицированы как lumenal структур, содержащих красные кровяные клетки.
Рисунок 4. Иммуногистохимическое идентификации человеческихлюмен. иммуногистохимическое окрашенных срезов, взятых из средней части эксплантированных зажигания. Окрашивание проводили с использованием моноклональных мыши анти-CD31 человека (hCD31) антитела из DakoCytomation (Clone JC70A;. Кошка # M0823) в разведении 1:100; клеточных ядер были контрастно гематоксилином. () Низкая увеличением (10x) микрофотография отображения имплантата (выделенном черный пунктир) в контексте окружающих тканях хозяина. Человек конкретный, CD31-положительных микрососудов окрашиваются в коричневый (пероксидаза окрашивание). (В) Высокое увеличение (40x) микрофотография отображение нескольких человек микрососудов (черная стрелка указывает на некоторые hCD31-положительных люмен) внутри вилки.
Discussion
Это экспериментальная модель биоинженерии человеческой сосудистой сети. Основными характеристиками этой модели являются: 1) микрососудов формируются из человеческих клеток, выделенных из послеродовой тканей (например, крови и костного мозга), 2) микрососудов образуются в взрослого животного, и 3) микрососудов не возникают из предварительно существующие (хоста) судов, но вместо этого они формируются, De Novo, от отдельных клеток, взвешенных в подходящий гель.
Ангиогенез играет важную роль в этом анализе, поскольку подключение к мышиной сосудистой необходимы для достижения эритроцитов заполненные кровеносных сосудов, один из функциональных считывания в этом анализе. Кроме того, клетки-хозяева миелоидной вербуются для имплантата в начале трансплантации сообщение дней, и они необходимы для формирования нового сосудистого русла 12.
Это экспериментальная модель предлагает универсальные, количественные, а также сравнительно простую модель системы для изучения послеродовой формирование человеческого сосудистой сети в естественных условиях. Кроме того, этот анализ будет прост в исполнении и не требует разреза или хирургического вмешательства. Модель может быть использована для изучения vasculogenic потенциал различных источников человеческих эндотелиальных и периваскулярных клеток. Модель может быть использована для выявления анти-и / или про-vasculogenic соединений. Наконец, модель может быть использована для изучения роли (ы) определенных генов в формировании и функционировании сосудистой сети состоят из человеческого эндотелия.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана NIH грант K99EB009096-01A1 к JM-М.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial Basal Medium, EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot supplements | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin solution, 100x GPS | Mediatech, Inc. | 30-009-CI | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit, MSCBM/MSCGM | Lonza Inc. | PT-3001 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium, 1x DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| MEM Non-essential amino acid solution, 100x NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle, powdered DMEM | Invitrogen | 12100-046 | |
| HEPES Buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| Cultrex Bovine Collagen I solution | Trevigen Inc. | 3442-050-01 | |
| Cultrex Human Fibronectin | Trevigen Inc. | 3420-001-01 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F8630-1G | |
| Gelatin | Fisher Scientific | DF0143-17-9 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| Trypsin-EDTA solution, 1x | Invitrogen | 25300-054 | |
| Isoflurane, liquid for inhalation | Buxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | |
| Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD31 Antibody | Dako | M0823 | Clone JC70A |
References
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Koike, N. Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels. Nature. 428, 138-139 (2004).
- Schechner, J. S. In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).
- Nö, r, E, J. Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice. Lab Invest. 81, 453-463 (2001).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-1305 (2008).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Traktuev, D. Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells. Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo. Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).
