Summary
Här beskriver vi en metod för att leverera mänskligt blod från navelsträngen som härrör från endotel kolonibildande celler (ECFCs) och härledd från benmärg mesenkymala stamceller (MSC), inbäddade i en kollagen / fibronektin gel, subkutant i nedsatt immunförsvar möss. Denna cell / gel kombination skapar en human vaskulär nätverk som ansluter med musen kärlbädden.
Abstract
Framtiden för vävnadsteknik och cellbaserade terapier för vävnadsregenerering kommer sannolikt att lita på vår förmåga att generera funktionella vaskulära nätverk in vivo. I detta avseende är sökandet efter experimentella modeller för att bygga nätverk blodkärl in vivo av yttersta vikt 1. Möjligheten att nätverken bioteknik mikrovaskulära in vivo visades för första gången med mänsklig vävnad som härrör mogna endotelceller (EC) 2-4, dock så autologa endotelceller nuvarande problem för bred klinisk användning, eftersom de är svåra att få tag i tillräckliga mängder och kräver skörd från befintliga kärlbädden. Dessa begränsningar har inlett sökandet efter andra källor till ECS. Identifieringen av endotelceller kolonibildande celler (ECFCs) i blod presenteras en möjlighet att icke-invasivt få EC 5-7. Vi och andra författare har visat att vuxna och rep blodbaserade ECFCs har kapacitet att bilda fungerande vaskulär nätverk in vivo 7-11. Viktigare är att dessa studier också visat att för att få stabila och hållbara vaskulär nätverk, ECFCs kräver samarbete implantation med perivaskulär celler. Analysen vi beskriver här illustrerar det här konceptet: Vi visar hur mänsklig sladden blodbaserade ECFCs kan kombineras med härledd från benmärg mesenkymala stamceller (MSC) som en enda cell suspension i en kollagenhalt / fibronektin / fibrinogen gel för att bilda en funktionell människa vaskulära nätverk inom 7 dagar efter implantering i ett nedsatt immunförsvar mus. Förekomsten av mänskliga ECFC-fodrade lumen innehåller värd erytrocyter kan ses i hela implantaten visar inte bara bildning (de novo) av en vaskulär nätverk, men också utvecklingen av funktionella anastomoser med värdens cirkulationssystemet. Denna mus modell av genmanipulerad human vaskulär nätverk är perfekt för studier av cellulära och molekylära mekanismer av mänskliga vaskulär nätverk bildas och för utvecklingen av strategier för att vascularize konstruerad vävnader.
Protocol
1. Förberedelser
- Gör EGM-2 medelstora (500 ml)
- Tillsätt 100 ml fetalt bovinserum (FBS) till 395 ml Endothelial bassubstratets (EBM-2).
- Tillsätt 5 ml 100x Glutamin-penicillin-streptomycin lösning (GPS).
- Lägg till alla stämman-2 SingleQuots tillskott förutom hydrokortison (dvs, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, heparin, askorbinsyra, och GA-1000).
- Filtrera steriliseras med en 0,2-ìm porstorlek vakuumfilter.
- Gör MSCGM medelstora (500 ml)
- Tillsätt 5 ml 100x GPS för 440 ml mesenkymala stamceller bassubstratets (MSCBM).
- Lägg till alla innehållet i MSCGM SingleQuots kit.
- Lägg hFGF-B delprov från extra bolagsstämma-2 SingleQuots kosttillskott.
- Filtrera steriliseras med en 0,2-ìm porstorlek vakuumfilter.
- Gör DMEM medelstora (500 ml)
- Tillsätt 50 ml fetalt bovinserum (FBS) till 440 ml 1X höga glukos Dulbecco ändrade Eagle Medium (DMEM).
- Tillsätt 5 ml 100x GPS.
- Tillsätt 5 ml onödiga aminosyralösning.
- Filtrera steriliseras med en 0,2-ìm porstorlek vakuumfilter.
- Gör kollagen / fibronektin lösning (3,6 ml; gjorde samma dag som injektion)
- Tillsätt 0,4 mL 10x DMEM till 150 mikroliter destillerat H 2 O.
- Tillsätt 100 mikroliter av 1M HEPES (25 mm slutlig).
- Försiktigt, tillsätt 2,4 ml bovint kollagen (5 mg / ml lager, 3 mg / ml slutlig) och blanda försiktigt på is.
- Justera pH till neutrala genom att lägga 1N NaOH-lösning (cirka 30 mikroliter).
- Använd fenolrött indikator för att bedöma neutralt pH, alternativt, använda papper pH-test för att kontrollera pH.
- Tillsätt 120 mikroliter av mänskliga fibronektin (1 mg / ml materiel, 30 mikrogram / ml slutlig)
- Tillsätt 0,4 ml FBS (10% slutlig)
- hålla lösningen på is tills det ska användas.
- Gör fibrinogen (1 ml, gjorde samma dag som injektion)
- Tillsätt 30 mg pulver fibrinogen till 1 mL 0.9N NaCl (pH 7,4) lösning (30 mg / ml slutlig).
- Före användning, inkubera fibrinogen lösning vid 37 ° C i 30 minuter.
- Blanda försiktigt, utan att vortexa innan det förutom kollagen / fibronektin gel.
- Gör trombin-lösning (200 ml)
- Tillsätt 1 KU av pulveriserad trombin till 200 ml 0,9% NaCl fysiologisk koksaltlösning (50 U / ml).
- Filtrera steriliseras med en 0,2-ìm porstorlek sprutfilter och förvara vid -20 ° C fram till användning.
- Före användning, späd med 0,9% NaCl fysiologisk koksaltlösning till en slutlig koncentration på 10 U / mL.
- Gör 1% gelatin-lösning (500 ml)
- Tillsätt 5 g pulvriserat gelatin till 500 ml Dulbecco är fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Autoklaveras vid 121 ° C i 30 min.
- Filtrera steriliseras med en 0,2-ìm porstorlek vakuumfilter.
- Coat 100-mm vävnadsodling plattor med 1% gelatin TÄCKLÖSNING
- Tillsätt 10 ml 1% gelatin-lösning till varje 100-mm vävnadskultur plattan.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i 60 min.
- Före användning, ta bort gelatin lösningen och tvätta plattorna en gång med PBS.
2. Kultur för mänskliga Cord blodbaserade Endothelial kolonibildande celler (ECFCs)
Detta protokoll förutsätter frysta flaskor ECFC finns på laboratoriet före detta experiment. ECFC kan isoleras från det mononukleära celler bråkdel av antingen navelsträngsblod eller vuxna perifert blod som tidigare beskrivits 7.
- Tina en flaska ECFCs (typiskt 0,5-1x10 6 celler i 1 ml frysning medier) som tagits från flytande kväve cistern och omedelbart försvaga dess innehåll i en 15-ml konisk tub innehåller 10 ml DMEM medium. Spin vid 1200 rpm i 5 min. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml varmt EGM-2 medium.
- Tillsätt 10 ml ECFC suspensionen i en 1% gelatin-belagd 100-mm vävnadskultur plattan. Placera plattan i en fuktig inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2. Nästa dag, försiktigt aspirera ut obundna celler och medium och foder bundna celler med 10 ml rent EGM-2 medium.
- Mata plattan var 2-3 dagar med EGM-2 medium. Låt cellerna att expandera så att plattan täcks av ett sammanhängande cellulära monolager. Vid sammanflödet, subkultur cellerna som följer:
- Sug ut odlingsmedium och tvätta cellerna med 10 mL PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 2 mL trypsin-EDTA-lösning till varje 100-mm plåt. Skaka plattorna att fördela trypsin-EDTA-lösning. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 i 3-5 minuter. Knacka försiktigt på plattan för att se fristående celler i suspension i ett inverterat mikroskop.
- När celler helt bort, lägga till 8 ml EGM-2 medium och samla cellen lösningarning till ett 15-ml konisk tub. Ta 10 mikroliter för att räkna cellerna i en haemocytometer och räkna ut det totala antalet skördade celler.
- Plate cellerna i 1% gelatin-plåt vävnadsodling på en seedning densitet på 5000 celler / cm 2 med EGM-2 medium. Placera plattorna i inkubatorn och mata dem var 2-3 dagar med EGM-2 medium.
Upprepa denna procedur för senare passager. Håll koll på passagen nummer som cellpopulation utökas. ECFCs kommer att användas mellan passager 4-8.
3. Kultur för mänskliga härledd från benmärg mesenkymala stamceller (MSC)
Detta protokoll förutsätter frysta flaskor av mänskliga MSC finns på laboratoriet före detta experiment. MSC kan isoleras från benmärg aspirat som tidigare beskrivits 11.
- Tina en flaska med MSC (typiskt 0,50-1x10 6 celler i 1 ml frysning medier) som tagits från flytande kväve cistern och omedelbart försvaga dess innehåll i en 15-ml konisk tub innehåller 10 ml DMEM medium. Spin vid 1200 rpm i 5 min. Avlägsna supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml varmt MSCGM medium.
- Tillsätt 10 ml av MSC suspensionen i ett obestruket 100-mm vävnadskultur plattan. Placera plattan i en fuktig inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2. Nästa dag, försiktigt aspirera ut obundna celler och medium och foder bundna celler med 10 ml rent MSCGM medium.
- Mata plattan var 2-3 dagar med MSCGM medium. Låt cellerna att expandera så att plattan når 80% av sammanhängande cellulära monolager. Vid 80% sammanflödet, subkultur cellerna som följer:
- Sug ut odlingsmedium och tvätta cellerna med 10 mL PBS.
- Ta bort PBS och tillsätt 2 mL trypsin-EDTA-lösning till varje 100-mm plåt. Skaka plattorna att fördela trypsin-EDTA-lösning. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 i 3-5 minuter. Knacka försiktigt på plattan för att se fristående celler i suspension i ett inverterat mikroskop.
- När celler helt bort, lägga till 8 ml MSCGM medelstora och samla cellen lösningen i en 15-ml konisk tub. Ta 10 mikroliter för att räkna cellerna i en haemocytometer och räkna ut det totala antalet skördade celler.
- Plate cellerna i obestrukna plattor vävnadsodling på en seedning täthet av 10.000 celler / cm 2 med MSCGM medium. Placera plattorna i inkubatorn och mata dem var 2-3 dagar med MSCGM medium.
Upprepa denna procedur för senare passager. Håll koll på passagen nummer som cellpopulation utökas. MSC kommer att användas mellan passager 4-8.
4. Resuspension av celler i kollagen / Fibronectin / Fibrinogen Solution (Dag 0)
Innan experimentet, se till att det finns tillräckligt ECFCs och MSC i kulturen, 0.8x10 6 ECFCs och 1.2x10 6 MSC kommer att krävas för varje implantat och mus.
- Sug ut mediet för varje kultur platta och tvätta cellerna med 10 mL PBS. Ta bort PBS och tillsätt 2 mL trypsin-EDTA-lösning till varje 100-mm plåt. Skaka plattorna att fördela trypsin-EDTA-lösning. Inkubera i 3-5 minuter. Knacka försiktigt på plattan för att se fristående celler i suspension i ett inverterat mikroskop.
- När celler helt bort, lägga till 8 ml DMEM medelstora och samla cellen lösningen i en 15-ml konisk tub. Ta 10 mikroliter för att räkna cellerna i en haemocytometer och räkna ut det totala antalet ECFCs och MSC skördas.
- Överför 4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 celler) och 6x10 6 Medelhavsländerna (5x 1.2x10 6 celler) i en enda 50-ml konisk tub. Detta är den totala mängd celler som behövs för fem enskilda implantat och möss. Centrifugera vid 1200 rpm och avlägsna supernatanten.
- Försiktigt, tillsätt 100 uL av Fibrinogen lösning på 0,9 ml av kollagen / fibronektin lösning (3 mg / ml slutlig fibrinogen koncentration), hålla blandningen på is.
- Resuspendera cellpelleten den 1 ml iskall kollagenhalt / fibronektin / fibrinogen lösning, blanda cellerna mycket försiktigt för att undvika bubblor. Ladda blandningen i en 1-ml steril spruta, och placera en 26-nål med locket på toppen av sprutan. Förvara den laddade sprutan på is tills injektion.
5. Injektion i nedsatt immunförsvar nakna Mouse (Dag 0)
Alla djurförsök kommer att genomföras med sex veckor gamla athymic naken (NU / NU) möss.
- Före injektionen Bedöva immundefekta möss genom att placera dem i en gaskammare leverera isofluran. Låt mössen att andas in den isofluran i cirka 2 minuter tills de är sövda och okänslig till tå nypa (övervaka sina hjärtslag genom inspektion).
- För varje mus, injicera 50 mikroliter av trombin-lösning (10 U / ml) subkutant i övre ryggen regionen med hjälp av en 26-nål.
- Efter injektionen, placera mössen på ett lager av gasväv för komfort och värme och iaktta dem tills de blir ambulatorisk. Sedan efter, observera möss dagligen de första tre dagarna.
6. Skörd (Dag 7)
- En vecka efter injektioner, euthanize möss genom att placera dem i en gaskammare leverera komprimerad CO 2-gas.
- När avlivas, skära upp huden nära det område av injektion och kirurgiskt avlägsna gelen kontakten. Digitala fotografier av hämtas gel pluggar med en skala rekommenderas.
- Placera skördade gelen ansluts till histologiska kassetten och djupt in dem i 10% neutral buffrad formalin över natten i rumstemperatur.
- Efter fixering, tvätta 10% neutral buffrad formalin undan med destillerat H 2 O och placera den histologiska kassetter vid 4 ° C i PBS tills histologiska utvärderingen.
7. Utvärdering: Histologi (H & E) och immunohistokemi (hCD31)
- För histologisk utvärdering, är implantat inbäddade i paraffin och snittades (7 ìm tjocka sektioner) med hjälp av vanliga histologiska metoder.
- Kvantifiera microvessel täthet genom utvärdering av Hematoxilin och eosin (H & E) färgade snitt tas från den mellersta delen av implantaten. Standardprotokoll för H & E färgning kan hittas någon annanstans. Mikrokärl kan identifieras som lumenal strukturer som innehåller röda blodkroppar. Rapportera mikrokärl densitet som det genomsnittliga antalet röda blodkroppar fyllda mikrokärl från fälten analyseras och uttryckt som fartyg / mm 2.
- För att visa den mänskliga naturen av mikrovaskulära fartyg, delar av hämtas implantatet bör immunhistokemiskt färgas med ett mänskligt specifika CD31 (hCD31)-antikroppar med hjälp av vanliga färgning protokoll. Vi rekommenderar att du använder monoklonala mus-anti-humant CD31 antikropp från DakoCytomation (Klon JC70A;. Katten # M0823) vid en 1:100 spädning. Den mänskliga specificitet denna antikropp har bekräftats av den negativa reaktionen erhålls med en mångfald av sektioner mus vävnad som färgades parallellt 7,11. Att notera är musen blodkärl ofta inuti implantat (speciellt runt kanten), men musen fartyg kommer inte fläcken positiva med denna antikropp. Dessutom kan förekomsten av mänskliga MSC detekteras med immunhistokemisk färgning med människa-specifika antikroppar mot CD90 eller α-Smooth muscle aktin (α-SMA). Mänskliga MSC finns både i perivaskulär regionen nybildade blodkärl och interstitially över hela implantatet 11.
8. Representativa resultat
Figur 1. Typiskt utseende ECFC och MSC kulturer. Faskontrast micrographs visar det typiska utseendet på ECFCs och MSC i kulturen. (A) konfluenta monolager av navelsträngsblod som härrör ECFCs visar den karakteristiska lappa-sten morfologi endotelceller. (B) Människa härledd från benmärg MSC visar en morfologi spindel form. Scaler barer, 200 um.
Figur 2. Utseende av explanterade pluggar på dag 7. Mänskliga navelsträngsblod som härrör från ECFCs och härledd från benmärg MSC var inbäddade i kollagenhalt / fibronektin / fibrin gel och implanteras subkutant i nakna möss som beskrivs i texten. (A) Efter 7 dagar, när musen har avlivas, skära upp huden nära det område av injektion och utsätta cellen / gel kontakten genom att bläddra i huden. (B) Utseende av pluggen avlägsnas kirurgiskt från mus och före formalin fixering. Den röda färgen av implantatet är ett tecken på vaskularisering.
Figur 3. Histologisk identifiering av vaskulära nätverket explanterade pluggar. Hematoxilin och eosin (H & E) färgade snitt tagna från mitten delen av explanterade pluggar. (A) låg förstoring (10x) mikroskop visar implantatet (markerad med en streckad gul linje) i samband med omgivande värd vävnader (dvs fettväv och skelettmuskulatur). (B) Hög förstoring (40x) mikroskop visar flera mikrokärl (gul pil som pekar på några av dem) inne i kontakten, mikrokärl kan identifieras som lumenal strukturer som innehåller röda blodkroppar.
Figur 4. Immunhistokemiska identifiering av mänskligalumen. immunhistokemiskt färgade snitt tagna från mitten delen av explanterade pluggar. Färgning genomfördes med hjälp av en monoklonal mus-anti-humant CD31 (hCD31) antikroppar från DakoCytomation (Klon JC70A;. Katten # M0823) vid en 1:100 utspädning, cellkärnor var counterstained med hematoxilin. (A) låg förstoring (10x) mikroskop visar implantatet (avgränsas av en streckad svart linje) i samband med omgivande värd vävnader. Mänskliga specifika, CD31-positiva mikrokärl färgas i brunt (peroxidas färgning). (B) Hög förstoring (40x) mikroskop visar flera mänskliga mikrokärl (svart pil pekar på några hCD31-positiva lumen) inuti kontakten.
Discussion
Detta är en experimentell modell av bioteknik human vaskulär nätverk. De viktigaste egenskaperna för denna modell är: 1) mikrokärl bildas från mänskliga celler isolerade från postnatala vävnader (dvs blod och benmärg), 2) mikrokärl bildas i ett vuxet djur, och 3) mikrokärl inte uppkommer från förskola -existerande (host) fartyg utan de bildas, de novo, från enstaka celler suspenderas i en lämplig gel.
Angiogenes spelar en viktig roll i denna analys eftersom anslutningar till murina kärlsystemet behövs för att uppnå röda blodkroppar fyllda kärl, en av de funktionella läsa ut i denna analys. Dessutom är värd myeloida celler rekryteras till implantatet under de första dagarna efter transplantation, och de är nödvändiga för bildandet av nya blodkärl sängen 12.
Denna experimentella modell erbjuder en mångsidig, kvantifierbara och relativt enkla modellsystem för att studera postnatala bildandet av human vaskulär nätverk in vivo. Dessutom är denna analys enkel att utföra och det kräver inte ett snitt eller kirurgiska ingrepp. Modellen kan användas för att studera vaskulär potentialen av olika källor till mänskliga endotelceller och perivaskulär celler. Modellen kan användas för att screena för anti-och / eller pro-vaskulär föreningar. Slutligen kan modellen användas för att studera vilken roll (er) av specifika gener i bildandet och funktionen av en vaskulär nätverk bestående av mänskliga endotelet.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har delvis stöd av NIH bevilja K99EB009096-01A1 till JM-M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Endothelial Basal Medium, EBM-2 | Lonza Inc. | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot supplements | Lonza Inc. | CC-3162 | |
| Glutamine-penicillin-streptomycin solution, 100x GPS | Mediatech, Inc. | 30-009-CI | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit, MSCBM/MSCGM | Lonza Inc. | PT-3001 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle Medium, 1x DMEM | Invitrogen | 11995-073 | |
| MEM Non-essential amino acid solution, 100x NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| High glucose Dulbecco’s Modified Eagle, powdered DMEM | Invitrogen | 12100-046 | |
| HEPES Buffer solution | Invitrogen | 15630-080 | |
| Cultrex Bovine Collagen I solution | Trevigen Inc. | 3442-050-01 | |
| Cultrex Human Fibronectin | Trevigen Inc. | 3420-001-01 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F8630-1G | |
| Gelatin | Fisher Scientific | DF0143-17-9 | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline, PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| Trypsin-EDTA solution, 1x | Invitrogen | 25300-054 | |
| Isoflurane, liquid for inhalation | Buxter Healthcare Corporation | NDC 10019-360-40 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | |
| Formalin Solution, Neutral Buffered | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Monoclonal Mouse Anti-Human CD31 Antibody | Dako | M0823 | Clone JC70A |
References
- Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis. Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).
- Koike, N. Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels. Nature. 428, 138-139 (2004).
- Schechner, J. S. In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).
- Nö, r, E, J. Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice. Lab Invest. 81, 453-463 (2001).
- Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood. J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).
- Ingram, D. A. Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood. Blood. 104, 2752-2760 (2004).
- Melero-Martin, J. M. In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells. Blood. 109, 4761-4768 (2007).
- Au, P. Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels. Blood. 111, 1302-1305 (2008).
- Yoder, M. C. Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals. Blood. 109, 1801-1809 (2007).
- Traktuev, D. Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells. Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).
- Melero-Martin, J. M. Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells. Circ Res. 103, 194-202 (2008).
- Melero-Martin, J. M. Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo. Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).
