Summary
Um protocolo para a canulação do mouse glândula salivar submandibular via ducto de Wharton, é descrito. Para este experimento, a solução de azul de tripano é usado como um tintureiro para demonstrar como esta técnica efetivamente oferece infusões na glândula alvo, e sugerir a confiabilidade dessa nova abordagem como uma potencial terapia medicamentosa / célula clínicos para a regeneração das glândulas salivares.
Abstract
Hipofunção da glândula salivar é grave freqüentemente encontrados em pacientes com síndrome de Sjögren e aqueles que recebem a irradiação terapêutica em sua cabeça e pescoço para tratamento de câncer. Ambos os grupos de sintomas dos pacientes experiência como xerostomia (boca seca), disfagia (deficiente mastigação e deglutição), grave cárie dentária, alteração do paladar, oro-faringe infecções (candidíase), dor, mucosite e desconforto.
Uma abordagem inovadora da medicina regenerativa para o tratamento da glândula salivar hipo-função é especulado no RS Redman, E Mezey et al 2009:. Células-tronco pode ser depositado diretamente pela canulação para a glândula como um método potente em reviver as funções do deficiente órgão. Presumivelmente, a migração de células-tronco estrangeiros irão se diferenciar em células glandulares funcionar como parte da glândula salivar anfitrião. Além disso, esta técnica de canulação é um método de entrega expeditos e eficazes para a aplicação clínica de transferência de genes.
Aqui nós ilustrar as etapas envolvidas na realização do procedimento canulação do mouse glândula salivar submandibular via duto de Wharton (Fig. 1). C3H camundongos (Charles River, Montreal, Quebec, Canadá) são utilizados para este experimento, que foram mantidos sob condições convencionais limpa no centro de recursos McGill University animal. Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade e estavam de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care.
Para este experimento, uma solução de azul de tripano é infundida a glândula através da abertura do ducto de Wharton, utilizando uma seringa com uma agulha de insulina 29-gauge encerrado dentro de um tubo de polietileno. Posteriormente, o mouse é dissecado para mostrar que as infusões migraram para a glândula com sucesso.
Protocol
1. Descrição processuais
- Por via subcutânea injetar 1 ml / g de peso corporal de 0,5 monohidratada sulfato mg / ml atropina (Cat # 11330, Fluka, EUA) em cada um mouse para evitar que a secreção salivar de interromper o movimento das infusões.
- Anestesiar cada rato com um peso corporal mL / g de ketamina a 100 mg / ml e 20 mg / ml solução xilazina (Phoenix Scientific, AR, EUA) injetou intra-peritoneal (IP)
- Posicione o mouse sobre uma plataforma de plástico feito sob medida na posição ventral: os incisivos superiores estão bloqueados em um fio de metal, e os incisivos inferiores são viciadas em um fio elástico, a fim de manter a boca aberta.
- Use uma seringa de insulina com uma agulha de calibre 29 (Cat # 600145, Tyco Healthcare, MA, EUA), colocado dentro de um tubo de polietileno 0,58 mm de diâmetro (Cat # 427410, Becton Dickinson, MD, EUA; Fig. 2). O tubo de polietileno inserido é 5 milímetros sobre a ponta de uma agulha de 29 gauge. A agulha é usada como um guia rígido para mover o tubo de polietileno em duto de Wharton. O tubo de polietileno é inserido 3-5 mm dentro do duto. Note que apenas o tubo de polietileno entra no ducto da glândula salivar, enquanto a agulha permanece fora do duto. Injetar 50uL de filtrado 0,4% solução de azul de tripano mancha (Cat # 15250, Gibco, EUA) na glândula submandibular via duto de Wharton, que está localizado logo abaixo da língua. A infusão é entregue de forma constante com pressão positiva sobre o pistão da seringa; o dedo permanece no pistão, mesmo depois de todos os infusão tenha sido entregue à glândula, a fim de evitar um refluxo da infusão intra-oral. A solução de azul de tripano é usado no vídeo como um corante para demonstrar a técnica.
- epois a injeção da solução de azul de tripano, o rato foi sacrificado antes da dissecção. A glândula salivar é cirurgicamente expostas, a fim de determinar quanto das infusões realmente permaneceu na glândula.
2. Resultados representativos:
Após as infusões foram injetados, o rato foi dissecado para expor cirurgicamente a glândula salivar pós-canulados. Como mostrado na imagem-2, a coloração escura do ducto de Wharton fornece evidências de que a solução de azul de tripano foi infundida com sucesso.
Figura 1. Canulação da glândula submandibular do rato.
Figura 2. Tubo de polietileno é envolto em torno da ponta de uma agulha de 29 gauge. A agulha da seringa é usada como um guia rígido para mover o tubo de polietileno em duto de Wharton. O tubo de polietileno está inserido (canulados) mm 3-5 no interior do duto. Note que apenas o tubo de polietileno entra no ducto da glândula salivar, enquanto a agulha permanece fora do duto.
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Discussion
A dificuldade em utilizar este método de canulação é evitar que o refluxo da solução injetada. Mesmo se a solução azul de tripano foi temporariamente migraram para a glândula salivar com sucesso, a secreção de saliva pode interferir com as infusões e causar refluxo da solução de azul de tripano para fora da glândula. Como precaução, além de usar atropina para inibir a secreção de saliva, a cânula de polietileno deve permanecer no duto de Wharton eo pistão da seringa realizada durante 60 segundos após as infusões foram depositados. Isso permitirá que mais da solução aplicada a permanecer dentro da glândula.
Convencionalmente, a aplicação sistêmica, ou seja, a injeção intravenosa (IV) de fármacos / células, tem sido usada como uma abordagem clínica para a regeneração da glândula salivar. Infusões por via intravenosa injetado irá percorrer todo o sistema circulatório, permitindo que apenas alguns dos medicamentos / células a migrar para as glândulas alvo. Comparado com este método tradicional, a aplicação local, que é a injeção de drogas / células através do procedimento de canulação, pode ser entendida como uma forma mais directa e eficaz em reviver as funções das glândulas parótidas, submandibular, sublingual e salivares. Assim, esta técnica de canulação pode ser usado como um modelo confiável para a medicina regenerativa da glândula salivar de rato, e como uma perspectiva futura, este procedimento pode ser um método conveniente para aplicação clínica.
Seria um grande prazer para este artigo visual-para ser usado como uma ferramenta eficaz para estudantes e pesquisadores que estão interessados em estudos na medicina regenerativa da glândula salivar.
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Disclosures
Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade e estavam de acordo com as diretrizes do Canadian Council on Animal Care.
Acknowledgments
Os autores são gratos a Dr. Ana Cotrim, para consulta técnica e Dr. Monzur Murshed para o equipamento. Este trabalho foi financiado em parte pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine | Drug | Fluka | 11330 | To inhibit saliva secretion |
| Ketamine | Drug | Phoenix Scientific | Sedation | |
| Xylazine | Drug | Phoenix Scientific | ||
| Polyethylene tubing (0.58 mm diameter) | Tube | Intramedic | 427410 | To insert over tip of needle to avoid tissue injury during insertion into Wharton’s duct. |
| Ultra Comfort Insulin syringe (with a 29G needle) | Syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 600145 | |
| 4% trypan blue | Stain | GIBCO, by Life Technologies | 15250 |
References
- Fox, P. C. Acquired salivary dysfunction. Drugs and radiation. Ann N Y Acad Sci. 842, 132-137 (1998).
- Bhide, S. A., Miah, A. B., Harrington, K. J., Newbold, K. L., Nutting, C. M. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, prevention and treatment. Clin Oncol (R Coll Radiol). 21, 737-744 (2009).
- Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotech Histochem. 84, 253-260 (2009).
