Summary
Ett protokoll för kanylering av musen submandibular spottkörteln via Whartons kanalen beskrivs. För det här experimentet är trypan blå lösning som används som en färgare för att visa hur denna teknik på ett effektivt sätt levererar infusioner i riktade körtel, och att föreslå tillförlitligheten av denna nya strategi som en möjlig klinisk läkemedelsutveckling / cellterapi för regenerering av spottkörtlarna.
Abstract
Svår salivkörtlarna underfunktion är ofta hos patienter med Sjögrens syndrom och de som fått terapeutiska bestrålning i sitt huvud och hals för cancerbehandling. Båda grupperna av patienter få symptom som muntorrhet (muntorrhet), dysfagi (försämrad tugga och svälja), svår karies, smakförändringar, oro och svalg infektioner (candida), mukosit, smärta och obehag.
En innovativ metod för regenerativ medicin för behandling av spottkörtlarna hypo-funktionen är spekulerats i RS Redman, E Mezey et al 2009:. Stamceller kan direkt deponeras av kanylering i körtel som en potent metod i att återuppliva de funktioner som nedsatt orgel. Förmodligen kommer de migrerade utländska stamceller differentieras till körtelceller att fungera som en del i den mottagande spottkörteln. Detta är också kanylering tekniken en ändamålsenlig och effektiv leverans metod för klinisk genöverföring ansökan.
Här illustrerar vi de olika stegen i att utföra kanylering proceduren på musen submandibular spottkörteln via Whartons kanalen (Fig 1). C3H möss (Charles River, Montreal, QC, Kanada) används för detta experiment, som har hållits under rent konventionella förhållanden vid McGill University djuret resurscentrum. Alla experiment har godkänts av universitetet Animal Care kommittén och var i enlighet med riktlinjerna för den kanadensiska rådet om Animal Care.
För detta experiment är en trypan blå lösning infunderas i körteln genom öppningen av Wharton kanalen med en insulin spruta med en 29-nål inneslutet i ett rör i polyetylen. Därefter är musen dissekeras för att visa att infusioner flyttade in i körteln framgångsrikt.
Protocol
1. Processuella Beskrivning
- Subkutant injicera 1 ml / g kroppsvikt på 0,5 mg / ml atropinsulfat monohydrat (Cat # 11.330, Fluka, USA) i varje musen för att förhindra att salivutsöndring stör förflyttning av infusioner.
- Bedöva varje mus med 1 l / g kroppsvikt av en 100 mg / ml ketamin och 20 mg / ml xylazin (Phoenix vetenskapliga, AR, USA) lösning injiceras intraperitonealt (IP)
- Placera musen på en skräddarsydd plast plattformen i ventrala position: att käk framtänder är låsta på en metalltråd, och mandibular framtänder är anslutna på ett elastiskt snöre för att hålla munnen öppen.
- Använd en spruta med en 29-nål (Cat # 600.145, Tyco Healthcare, MA, USA) placeras i en 0,58 mm rör i polyetylen (Cat # 427.410, Becton Dickinson, MD, USA, Fig. 2). Det rör i polyetylen sätts 5mm över spetsen på en 29-nål. Nålen används som en rigid guide för att flytta polyeten röret i Whartons kanalen. Det rör i polyetylen sätts 3-5 mm innanför kanalen. Observera att endast polyeten slangen går in i spottkörteln kanalen medan nålen kvar utanför kanalen. Injicera 50ul av filtrerade 0,4% trypan blånad lösning (Cat # 15.250, Gibco, USA) i submandibular körteln via Whartons kanalen, som ligger precis under tungan. Infusionen levereras stadigt med övertryck på sprutan kolven, fingret kvar på kolven även efter alla infusionen har levererats till körteln, för att förhindra ett backflöde av infusionen inom oralt. Den trypan blå Lösningen används i videon som ett färgämne för att demonstrera tekniken.
- fter injektion av trypan blå lösning, var musen avlivas före dissekering. Spottkörteln är kirurgiskt utsätts för att avgöra hur mycket av infusioner faktiskt har kvar i körteln.
2. Representativa resultat:
Efter infusioner var injicerades var musen dissekeras för att kirurgiskt exponera efter kanylerade spottkörteln. Som visas på Bild-2, ger den mörka färgen på Wharton kanalen bevis för att trypan blå lösningen infunderas framgångsrikt.
Figur 1. Kanylering av mus submandibular körtel.
Figur 2. Polyeten röret är inkapslad runt spetsen av en 29-nål. Sprutan nål används som en rigid guide för att flytta polyeten röret i Whartons kanalen. Det rör i polyetylen sätts (kanylerade) 3-5 mm innanför kanalen. Observera att endast polyeten slangen går in i spottkörteln kanalen medan nålen kvar utanför kanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En svårighet med denna kanylering metod är att förhindra backflöde av den injicerade lösningen. Även om trypan blå lösning har tillfälligt flyttat in i spottkörteln framgångsrikt, kan saliv sekretion störa infusioner och orsaka backflöde av trypan blå lösningen ur körteln. Som en försiktighetsåtgärd, förutom att använda atropin som hämmar utsöndringen av saliv bör polyeten kanyl kvar i Whartons kanal och kolven i sprutan hålls för 60 sekunder efter infusioner har deponerats. Detta gör att de flesta av de infunderas lösningen att stanna kvar i körteln.
Traditionellt har den systemiska ansökan, nämligen intravenös injektion (IV) av droger / cellerna, har använts som en klinisk metod för spottkörteln förnyelse. Intravenöst injicerade infusioner kommer att resa genom hela cirkulationssystemet, att endast vissa läkemedel / cellerna att migrera till den riktade körtlar. Jämfört med denna traditionella metoden kan den lokala tillämpningen, det är injicering av narkotika / celler via kanylering förfarande, ska uppfattas som en mer direkt och effektivt sätt att återuppliva de funktioner som parotis, submandibulär och sublinguala spottkörtlar. Därför kan detta kanylering tekniken användas som en tillförlitlig modell för regenerativ medicin av mus spottkörtlarna, och som en framtida utsikter, kan detta förfarande vara ett lämpligare sätt att klinisk tillämpning.
Det skulle vara ett stort nöje för denna visuella-artikeln för att användas som ett effektivt verktyg för studenter och forskare som är intresserade av fortsatta studier inom regenerativ medicin i spottkörteln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla experiment har godkänts av universitetet Animal Care kommittén och var i enlighet med riktlinjerna för den kanadensiska rådet om Animal Care.
Acknowledgments
Författarna är tacksamma att Dr Ana Cotrim för teknisk konsultation och till Dr Monzur Murshed för utrustning. Detta arbete har delvis finansierats av den kanadensiska Institutes for Health Research.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine | Drug | Fluka | 11330 | To inhibit saliva secretion |
| Ketamine | Drug | Phoenix Scientific | Sedation | |
| Xylazine | Drug | Phoenix Scientific | ||
| Polyethylene tubing (0.58 mm diameter) | Tube | Intramedic | 427410 | To insert over tip of needle to avoid tissue injury during insertion into Wharton’s duct. |
| Ultra Comfort Insulin syringe (with a 29G needle) | Syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 600145 | |
| 4% trypan blue | Stain | GIBCO, by Life Technologies | 15250 |
References
- Fox, P. C. Acquired salivary dysfunction. Drugs and radiation. Ann N Y Acad Sci. 842, 132-137 (1998).
- Bhide, S. A., Miah, A. B., Harrington, K. J., Newbold, K. L., Nutting, C. M. Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, prevention and treatment. Clin Oncol (R Coll Radiol). 21, 737-744 (2009).
- Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree. Biotech Histochem. 84, 253-260 (2009).
