Ett förfarande beskrivs för framställning av en 3-dimensionell matris bestående av kollagen typ I och primära humana fibroblaster. Denna organotypisk gel fungerar som en användbar substrat för att bedöma invasiv cellmigration eftersom det härmar grundläggande funktionerna i vävnad stroma och är mottaglig för många former av mikroskopi.
Cellmigration är grundläggande för många aspekter av biologin, inklusive utveckling, sårläkning, de cellulära svaren i immunsystemet, och metastas av tumörceller. Migration har studerats på täckglas för att göra cellulära dynamik mottagliga för utredning av ljusmikroskop. Emellertid har det blivit klart att många aspekter av cellmigration beror på egenskaperna hos den lokala miljön inklusive dess elasticitet, proteinkomposition, och porstorlek, som inte troget representeras av styva tvådimensionella substrat, såsom glas och plast 1. Vidare, har växelverkan med andra celltyper, inklusive stromala fibroblaster 2 och immunceller 3, visats spela en kritisk roll för att främja invasionen av cancerceller. Utredning på molekylär nivå har alltmer visat att molekyldynamik, inklusive svar på läkemedelsbehandling, av identiska celler signifikant jämfört <em> In vitro och in vivo 4.
Idealt skulle det vara bäst att studera cellmigration i sitt naturligt förekommande sammanhang i levande organismer, men detta är inte alltid möjligt. Mellanliggande vävnadsodlingsplattor system, såsom cellhärlett matris, Matrigel, organotypisk kultur (beskrivs här) explantat vävnad, organoids och xenografter, är därför viktiga experimentella mellanprodukter. Dessa system ungefärliga vissa aspekter av en in vivo miljö men är mer mottagliga för experimentell manipulering såsom användning av stabilt transfekterade cellinjer, läkemedel regimer behandling, långsiktiga och hög upplösning. Sådana mellanliggande system är särskilt användbara som bevis skäl att validera sonder och etablera parametrar som krävs för att bilden dynamiska svaret av celler och fluorescerande reportrar innan företaget avbildning in vivo 5. Som sådana, kan de tjäna en viktig roll för att minska behovet av experiment på living djur.
Här presenterar vi en metod för framställning av en 3-dimensionell matris lämplig för studier av invasiv cellmigration 6-8. Matrisen består av 1 kollagen typ fibriller, som lagts över en period av flera dagar genom primära humana epidermala fibroblaster. Kollagenet framställs genom syraextraktion, inte enzymatisk digerering, vilket bevarar reaktivitet vid poly-peptid ändar och främjar tvärbindning av kollagenfibriller till större aggregat vid neutralisering av buffertbetingelser 9. Detta resulterar i en rekonstituerad gel som mer nära efterliknar egenskaperna hos kollagen in vivo och har viktiga konsekvenser för de invasiva egenskaperna hos celler odlade i gelerna. Det spelar ingen roll om färska eller frysta utgångsmaterial används, men användningen av unga skolästfiskar är viktigt eftersom kollagen tvärbindning är mer labilt i yngre djur. Kollagen I från yngre djur är därför lättare att extrahera och åter utgör wed högre trohet.
Kollagenmatrisen kan fixeras och färgas med antikroppar riktade mot antingen invasiva tumörceller eller stromaceller fibroblaster 2,10 och är mycket användbar för att testa effektiviteten av läkemedel som kan inhibera invasion 5,6.
Även detta protokoll föreslår användningen av primära humana hudfibroblaster, är det möjligt att använda primära fibroblaster från andra vävnadstyper, beroende på vilken typ av vävnad som undersöks. Det är också möjligt att fastställa kulturerna med odödliggjorda fibroblaster, inklusive celler som har transfekterats stabilt med fluorescerande proteinkonjugat. På detta sätt både stromala och tumörceller kan märkas att visualisera cell-cell-interaktioner under invasion 11.
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
10x MEM | Gibco | 21430 | – |
NaOH | Sigma | 367176-500G | Prepare 0.22 M stock in water |
FCS | PAA Laboratories | A15-101 | – |
35 mm dishes | Falcon | 353001 | For step 3.4 |
60 mm dishes | Falcon | 353004 | For step 5.2 |
Spring forceps blunt | Samco | E003/02 | Toothed, not smooth |
16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 15710 | Dilute to 4% in PBS prior to use |
Screens for cd-1, size 40 mesh | Sigma | S07707-5EA | Stainless steel grids, 5 per pack |
Dialysis tubing | Medicell International | 7607 2295 | 12 – 14 kD |
PBS | Oxoid | BR0014G | – |
Acetic Acid | Sigma | 242853 | – |
24 well dish | Falcon | 353047 | For step 4.1 |
Fungizone | In vitrogen | 15290018 | – |