Summary
De Gespaard zenuwletsel diermodel is hier beschreven als een muis model van perifere neuropathische pijn na een gedeeltelijke denervatie van de nervus ischiadicus door lesioning het scheenbeen en de gemeenschappelijke peroneus takken, waardoor de resterende Sural zenuw intact. Gedragsverandering als gevolg van mechanische allodynie wordt gekwantificeerd door von Frey filamenten.
Abstract
Perifere neuropathische pijn is een ernstige chronische pijn aandoening die het gevolg zijn van een trauma voor sensorische zenuwen in het perifere zenuwstelsel. De gespaard zenuwletsel (SNI) model induceert symptomen van neuropathische pijn, zoals mechanische allodynie dat wil zeggen pijn als gevolg van tactiele prikkels die normaal gesproken niet leiden tot een pijnlijke reactie [1].
Het SNI muismodel bestaat ligatie van twee van de drie takken van de n. ischiadicus (de nervus tibialis en de gemeenschappelijke peroneus), terwijl de Sural zenuw is intact gelaten [2]. Het letsel resulteert in duidelijke overgevoeligheid in de laterale gedeelte van de poot, die wordt geïnnerveerd door de gespaard Sural zenuw. De niet-geopereerde kant van de muis kan worden gebruikt als een controle. De voordelen van de DNI model zijn de robuustheid van de reactie en dat het niet nodig expert microchirurgische vaardigheden.
De drempel voor mechanische pijn reactie wordt bepaald door te testen met von Frey filamenten van toenemende buiging kracht, die herhaaldelijk worden gedrukt tegen de laterale oppervlakte van de poot [3], [4]. Een positieve reactie van pijn wordt gedefinieerd als een plotselinge terugtrekking poot, een spier te vertrekken en / of poot likken veroorzaakt door de gloeidraad. Een positief antwoord op drie van de vijf repetitieve stimuli wordt gedefinieerd als de pijngrens.
Zoals aangetoond in de video-protocol, C57BL / 6 muizen ervaring diepgaande allodynie zo vroeg als de dag na de operatie en onderhouden van deze voor enkele weken.
Protocol
1. von Frey nulmetingen voorafgaand aan de operatie
Voor Von Frey test procedure, verwijzen wij u naar hoofdstuk 5.
2. Anesthesie / het preparaat
- Verdoven van de dieren (intraperitoneale injectie van een mengsel van 100mg/kg ketamine en 15 mg / kg Xylazine).
- Plaats het dier in een rustige plaats tot volledig onder narcose (bijvoorbeeld bedekt met een papieren handdoek).
- Controleer reflexen door knijpen het uiteinde van de staart en de poten met een pincet. Zorg ervoor dat de dieren niet reageren voordat u verdergaat.
- Subcutaan injecteren (rug schouder gebied) 0,5 ml isotone zoutoplossing met antibiotica, zoals ampicilline (om uitdroging te vermijden en te voorkomen infecties, maar dit is een kleine chirurgische ingreep).
- Met behulp van een elektrisch scheerapparaat, scheer het operatiegebied van iets onder de knie gebied om de heup (voor rechtshandige personen de linker achterste ledematen wordt aanbevolen).
- Van toepassing oogzalf om de ogen met een watten knop.
- Leg het dier op zijn rechterzijde en plaats het linker achterbeen op een klein platform te houden verhoogd. Zet de been met plakband.
- Ontsmet het operatiegebied met afwisselend scrubs van ethanol en betadine van chirurgisch website uit.
3. Chirurgie
- Zoek de knie met de duim van je linkerhand en gebruik een scalpel om een app te maken. 1 cm incisie in de lengterichting proximaal van de knie.
- Open de huid door stompe dissectie behulp van de punt van een paar steriele schaar.
- Scheid de spierlaag door stompe dissectie vlak naast de duidelijk zichtbare bloedvat, dicht bij het dijbeen (femur). Als dit juist gebeurt, zal de spierlagen gemakkelijk uit elkaar, zonder bloeden, waaruit de heupzenuw rechts onder de spieren.
Als bloeden gebeurt bijvoorbeeld door beschadiging van een bloedvat dicht bij de knie, gebruik van steriele watten knoppen of stukken blik om het bloed op te vangen. Druk op totdat het bloeden stopt. - Plaats de muis onder een stereo microscoop en zorgvuldig de spieren los met een paar steriele pincet (nr. 2) om de heupzenuw te visualiseren. Oprolmechanismen kan ook worden toegepast.
- Identificeer het gebied waar de Sural zenuw takken van de nervus ischiadicus. De Sural zenuw is de kleinste van de drie takken, vertakking naar rechts in het linker been.
- Van toepassing zijn hechting (6-0 hechtdraad) rond de andere twee takken die nog lopen parallel (de tibia en de gemeenschappelijke peroneus zenuwen), die zeer voorzichtig naar de Sural tak raken. Dit is een belangrijke stap omdat de Sural zenuw moet worden gelaten volledig intact.
- Maak een strakke chirurgische knoop. Als de eerste knoop is strak, zal contracties van de ledemaat in acht worden genomen.
- Pak de zenuwen te snijden onder de hechtdraad met een pincet (nr. 5) en snijd de zenuwen boven en onder pincet met een kleine schaar. Door eerst te snijden boven het pincet, trekken van de zenuwen wordt vermeden.
- Snijd hechtdraad eindigt met een paar van micro-schaar en sluit de spierlaag. Voeg een druppel van lidocaïne op de wond en de hechtdraad met chirurgische knopen.
4. Na de operatie
- Controleer of oogzalf is nog steeds voldoende.
- Plaats de muis in een schone kooi onder een papieren handdoek in een comfortabele houding. Als de kamer koud is, plaats dan een warmte-pad onder een deel van de kooi (alleen onder een deel van de kooi als het dier moet kunnen ontsnappen naar een koudere omgeving indien gewenst).
- Zorg ervoor dat gemakkelijk toegankelijk water en voer.
5. von Frey testen (baseline, en vanaf de dag na de operatie)
- Leg de muizen in rood gekleurde plastic cilinders geplaatst op een gaas tafel twee dagen en een dag voorafgaand aan de operatie. Wennen voor de 15 min in cilinders voor de test. De rode kleur van de cilinders helpt de muizen om snel te ontspannen als ze niet kunnen zien elkaar en zijn in een donkere omgeving.
- Controleer of de muizen rust en gelden von Frey draden naar het laterale deel van de poot: beginnen met de 0,02 g gloeidraad, eerst van toepassing kracht om de linkerpoot vijf keer over een totale periode van 30 seconden (ongeveer 2 seconden per stimulus) en peilen naar de muis reactie na elke toepassing. Herhaal dit met dezelfde filament en de linker poot van een andere muizen, en dan opnieuw beginnen met de juiste poot van de eerste muis voordat u naar de volgende filament, bijvoorbeeld:
- Muis 1: linker poot 5 keer voor gloeilampen en 0,02 g
- Muis 2: linker poot 5 keer voor gloeilampen en 0,02 g, etc.
- Muis 1: rechts poot 5 keer voor gloeilampen en 0,02 g
- Muis 2: rechter poot 5 keer voor gloeilampen en 0,02 g, etc.
- Muis 1: linker poot 5 keer voor gloeilampen en 0,04 g
- Muis 2: linker poot 5 keer voor gloeilampen en 0,04 g, etc.
- Respons in drie van de vijf stimuli wordt beschouwd als een positieve reactie. Filamenten boven threshold kan worden toegepast op de drempel te controleren.
Response = plotselinge poot terugtrekken, plotselinge spier te vertrekken, plotselinge poot likken.
6. Representatieve resultaten
Figuur 1. Von Frey testen op C57BL / 6 muizen leeftijd 8-10 weken oud werd uitgevoerd een dag voorafgaand aan de operatie en herhaaldelijk na de operatie. 4-8 dieren werden opgenomen in elke groep. Von Frey testen op de geopereerde kant wordt vertegenwoordigd door ipsilaterale en de niet-geopereerde controle kant wordt vertegenwoordigd door de contralaterale. De dag na de operatie van de dieren te ontwikkelen belangrijke overgevoeligheid op de geopereerde poot, terwijl de niet-geopereerde is slechts licht aangetast ten opzichte van sham bediend muizen. (* <0.05, ** <0.01, *** <0.001, ipsilateraal ten opzichte van contralateraal).
Discussion
Kritische stappen
Schade aan de Sural zenuw moet worden vermeden om de pathologische veranderingen in de intacte Sural zenuw na letsel aan de tibia en de gemeenschappelijke peroneus zenuwen te bestuderen. Bijkomende schade aan het Sural zenuw kan leiden tot verlamming en kan dus worden gevisualiseerd als het slepen van de geopereerde achterste ledematen.
Alleen de zijkant van de poot wordt geïnnerveerd door de zenuw gespaard Sural, en dus alleen op dit gebied ontwikkelt neuropathie. Het testen van andere gebieden, geïnnerveerd door de zenuwen doorsneden, kunnen sterk vooroordeel de evaluatie van de veranderde mechanische drempel.
Eventuele wijzigingen
Andere soorten ligaties kan dienen als aanvulling op het gebied van het bestuderen van pathologische pijn voorwaarden na perifere zenuwschade, zoals chronische vernauwing letsel [5] of gedeeltelijke zenuw ligatie [6]. Elke experimentele procedure resulteert in verschillende fenotypische veranderingen die moeten voorafgaand aan de post-operatie testen worden overwogen.
Bovendien kunnen andere sensorische tests zoals thermische hyperalgesie worden toegepast [7], hoewel dit fenotype is minder robuust volgende DNI.
Toekomstige toepassingen
Deze techniek kan gebruikt worden voor het testen van drugs het veranderen van de ontwikkeling of het onderhoud van mechanische allodynie [8]. Analyse van de nervus ischiadicus, de achterwortelganglia (DRG) en / of de lumbale ruggenmerg kan er onderzoek van de moleculaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de geïnduceerde fenotype.
Dierproeven werd uitgevoerd volgens de goede laboratoriumpraktijken in volledige overeenstemming met Deense en Europese regelgeving. Alle experimenten werden goedgekeurd door de Deense Inspectie Dierproeven onder het Ministerie van Justitie (toestemming nummer 2006/561-1206).
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Lundbeck Foundation, de Carlsberg Foundation en Dagmar Marshall Foundation.
References
- Costigan, M., Scholz, J., Woolf, C. J. Neuropathic pain: a maladaptive response of the nervous system to damage. Annu. Rev. Neurosci. 32, 1-32 (2009).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87, 149-158 (2000).
- Bourquin, A. -F., Süveges, M., Pertin, M., Gilliar, N., Sardy, S., Davidson, A. C., Spahn, D. R., Decosterd, I. Assessment and analysis of mechanical allodynia-like behavior induced by spared nerve injury (SNI) in the mouse. Pain. 122, 14.e1-14.e14 (2006).
- Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. J. Neurosci. Methods. 53, 55-63 (1994).
- Bennett, G. J., Xie, Y. -K. A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man. Pain. 33, 87-107 (1988).
- Seltzer, Z., Dubner, R., Shir, Y. A novel behavioral model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial sciatic nerve injury. Pain. 43, 205-218 (1990).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutanous hyperalgesia. Pain. 32, 77-88 (1988).
- Erichsen, H. K., Blackburn-Munro, G. Pharmacological characterization of the spared nerve injury model of neuropathic pain. Pain. 98, 151-161 (2002).
