Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

DNA-vingerafdrukken van Mycobacterium leprae Stammen Met behulp van variabel aantal Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Lengte Analyse (FLA)

Published: July 15, 2011 doi: 10.3791/3104

Summary

Lepra, veroorzaakt door

Abstract

De studie van de overdracht van lepra is bijzonder moeilijk omdat de verwekker, Mycobacterium leprae, kan niet worden gekweekt in het laboratorium. De enige bron van de bacterie zijn lepra patiënten en experimenteel geïnfecteerde gordeldieren en naakt muizen. Dus veel van de methoden die worden gebruikt in de moderne epidemiologie zijn niet beschikbaar voor de studie van lepra. Ondanks een uitgebreide wereldwijde medicamenteuze behandeling voor lepra uitgevoerd door de WHO een, lepra nog steeds endemisch in veel landen met ongeveer 250.000 nieuwe gevallen per jaar. 2 Het hele M. leprae genoom in kaart is gebracht 3,4 en vele loci zijn geïdentificeerd die segmenten van twee of meer basenparen herhaald (de zogenaamde micro-en minisatellieten). Klinische 5 stammen van M. leprae kunnen variëren in het aantal tandem herhaalde segmenten (short tandem repeats, STR) worden veel van deze loci. 5,6,7 variabel aantal tandem repeat (VNTR) 5 analyse is gebruikt om de verschillende stammen van de lepra bacillen te onderscheiden. Sommige van de loci lijken stabieler dan anderen, die minder variatie in aantallen te herhalen, terwijl anderen lijken soms sneller te veranderen, bij dezelfde patiënt. Terwijl de variabiliteit van bepaalde VNTRs heeft opgevoed vragen over hun geschiktheid voor stamtypering 7,8,9, de opkomende gegevens suggereren dat het analyseren van verschillende loci, die zijn divers in hun stabiliteit, kan gebruikt worden als een waardevol epidemiologisch instrument. Meerdere locus VNTR-analyse (MLVA) 10 is gebruikt om lepra evolutie en transmissie in een aantal landen, waaronder China 11,12, Malawi 8, de Filippijnen 10,13, 14 en Brazilië te bestuderen. MLVA omvat meerdere stappen. Eerst wordt bacterieel DNA geëxtraheerd samen met gastheerweefsel DNA van klinische biopsies of spleetogen huid vlekken (SSS). 10 De gewenste loci worden vervolgens geamplificeerd uit het geëxtraheerde DNA via polymerase chain reaction (PCR). Fluorescent-gelabelde primers 4-5 verschillende loci worden gebruikt per reactie, met 18 loci worden versterkt in een totaal vier reacties. 10 De PCR-producten kan worden onderworpen aan agarosegelelektroforese om de aanwezigheid van het gewenste DNA-segmenten te controleren, en vervolgens ingediend voor TL-fragment length analyse (FLA) met behulp van capillaire elektroforese. DNA van gordeldier gepasseerd bacteriën met een bekend aantal kopieën te herhalen voor elke locus wordt gebruikt als een positieve controle. De FLA chromatogrammen worden vervolgens onderzocht met behulp van Peak Scanner software en fragment lengte is omgezet naar het aantal VNTR exemplaren (allel). Ten slotte worden de VNTR haplotypes geanalyseerd voor patronen en wanneer het wordt gecombineerd met de patiënt klinische gegevens kunnen worden gebruikt om de verdeling van de stam types track.

Protocol

Het doel van deze video artikel is om een overzicht van het werk stroom voorzien, samen met data format en interpretatie voor onderzoekers dat alleen mag worden met ingang van dit soort werk (Figuur 1). Het omvat demonstratie van technieken, vereenvoudigde protocollen en praktische tips beschreven in de eerder gepubliceerde werken. 5,10

Algemene Work Flow en laboratoriumfaciliteiten:

Er moeten minstens drie verschillende werkplaatsen voor dit soort onderzoek. Het laboratorium moet 1) een pre-PCR gebied met een PCR-kap (schone lucht box of geïsoleerde werkgebied) voor de primer voorbereiding (verdunning, aliquot voorbereiding en mixen), 2) een aparte bio-veilige behuizing voor de behandeling en de toevoeging van DNA de PCR-mengsels, en 3) een post-PCR werkgebied voor het voorbereiden en het laden van gels en voor het bereiden van monsters voor FLA. Primers en DNA-monsters moeten worden bewaard in aparte vriezers en koelkasten. Primer besmetting is een van de belangrijkste en meest hardnekkige problemen in het laboratorium het werk van dit type. Pipetten gebruikt voor primers en PCR mixen mag NIET worden gebruikt voor DNA. Er moeten aparte sets van pipetten voor de pre-PCR, PCR en post-PCR werkgebieden. In het algemeen kan een onderzoeker proces 12 tot 18 monsters in een 12-24 uur periode met behulp van standaard laboratoriumapparatuur.

Voordat u begint elke fase van het werk:

  • Draag een laboratoriumjas en handschoenen. Handschoenen worden gedragen allen tijde biologische monsters, primers, DNA en ethidiumbromide worden afgehandeld. Veranderen regelmatig handschoenen.
  • Werk in een PCR-kast kap, bioveiligheid kast of schoon werkgebied.
  • Gebruik een nieuw bankje papier of pad.
  • Stel afval recipiënten die geschikt zijn voor vloeistoffen en pipetpunten.
  • Veeg af met de binnenkant van de PCR-kap en pipetten met 70% ethanol.
  • Onderwerp pipetten en werkruimte aan UV-licht gedurende 15 minuten voor de PCR opgezet. (Ultraviolet licht crosslinks oppervlak DNA verontreinigingen.)
  • Gebruik altijd spuitbus preventie pipetpunten voor materialen die DNA, primers en PCR-reagentia.
  • Centrifuge een buizen / strips / platen met vloeistof voordat u deze opent om spuitbussen te ontsnappen en kruisbesmetting te voorkomen door het hanteren.

1. M. leprae DNA voorbereiding

Klinische monsters met M. leprae worden verkregen uit lepra patiënten die een bezoek huid klinieken. Routine diagnostische monsters kunnen worden huid stansbiopsieën, spleet de huid vegen of neusswabs. In het algemeen, stansbiopsieën of sleuven huid vlekken zijn het beste voor moleculaire epidemiologie, omdat ze zijn schoon en bevat voldoende hoeveelheden van M. leprae. Gebruik van deze materialen voor onderzoek moet worden goedgekeurd volgens de institutionele richtlijnen.

  1. Behouden biopsie of spleet huid uitstrijkje monsters in een schroefdop injectieflacon met 1 ml 70% ethanol.
  2. Centrifuge elk monster in een variabele snelheid bench-top centrifuge bij 12.000 xg gedurende 15 minuten.
  3. Verwijder de bovenstaande vloeistof en plaats deze in een microcentrifugebuis. Indien nodig, kan het nuttig zijn om re-centrifuge deze monsters en later te herstellen extra weefsel of DNA.
  4. Voeg 500 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan de weefselmonsters en geniet gedurende 1 uur om de resterende ethanol conserveermiddel uit te wisselen en het monster te hydrateren.
  5. Centrifugeer de monsters in een bench-top centrifuge bij 12.000 xg gedurende 20 minuten. Gooi de PBS-oplossing in een afvalcontainer gedeeltelijk gevuld met een ontsmettingsmiddel oplossing.
  6. Extract bacteriële DNA met behulp van de Qiagen DNEasy bloed en weefsel kit na de voorgeschreven richtlijnen.
  7. Geëxtraheerde DNA moet worden in hoeveelheden verdeeld in 4 flacons. Bewaar 2 porties bij -80 ° C voor toekomstig gebruik als / wanneer de reproduceerbaarheid van de testresultaten vereist is of als er nieuwe technologieën beschikbaar komen. Bewaar een aliquot bij -20 ° C en een bij 4 ° C voor meer onmiddellijk gebruik.
  8. Het is verstandig om een ​​"opvraging blank 'voor te bereiden, samen met de weefselmonsters. De lege is onderworpen aan alle op dezelfde behandelingen hierboven geschetste, maar wordt uitgevoerd zonder weefsel. PCR de extractie blank samen met de monsters van patiënten te garanderen dat de exploitant extractie techniek correct is en dat de reagentia vrij zijn van DNA besmetting.

2. Primer voorbereiding

  1. Primers voor de loci waarvoor er het meest uitgebreide stam soort gegevens staan ​​vermeld in tabel 1. Vier of vijf primers worden gecombineerd voor multiplex PCR. Een primer voor elke locus draagt ​​een 5 'fluorescerende chemische tag die wordt gedetecteerd tijdens capillaire elektroforese fragment length analyse (FLA).
  2. Voor elke combinatie van multiplex PCR, worden de gelabelde primer en de bijbehorende reverse primer voor elke locus gecombineerd in een aparte Eppendorf buizen: vooruit primers in een buis, omgekeerde in het andere. Stock primers zijn bereid als 100 urn oplossingen (figuur 2a), waarvan een deelwordt verdund 10x tot een concentratie van 10 uM gebruik van TE (1x Tris-EDTA, pH 8,0). Resterende fracties van de 100 uM primer oplossingen worden opgeslagen bij -20 ° C voor later gebruik.
  3. Gelijke hoeveelheden van elk 10 uM primer worden gemengd wat resulteert in 2μM eindconcentraties van elke primer. Wanneer de primer-combinaties worden toegevoegd aan de PCR-mengsel (tabel 3), de uiteindelijke concentratie van elke primer daalt tot 0,2 uM.

Wanneer het gecombineerde primers worden toegevoegd aan de PCR-mengsels (tabel 3), laatste concentraties dalen tot 0.2μM elk.

3. Versterken van bacterieel DNA met behulp van multiplex-PCR

  1. PCR Setup
    • Noteer het aantal monsters dat wordt gebruikt voor te bereiden en een werkblad met de vereiste reagentia en hun volumes voor het verzamelen van de nodige kunststoffen en andere materialen.
    • Label de steriele buizen / strips / platen worden gebruikt voor de PCR met aantallen monsters. Vergeet niet om de positieve en negatieve controles omvatten.
  2. Veeg de thermocycler met een reinigingsmiddel (zoals Decon ELIMINase) en het programma het volgens tabel 2. Change handschoenen na het schoonmaken en voordat u primers en andere reagentia.
  3. Bereid PCR Mastermix volgens Tabel 3 en het etiket van het PCR-buisjes / strips / plaat met de primer combinatie en aantallen monsters worden gebruikt.
  4. Aliquot 18μl van Mastermix aan elk gelabeld PCR monsterbuis of goed. Veranderen handschoenen.
  5. Vegen van een aparte bio-safety kast en pipetten met 70% ethanol om te helpen reinigen en te desinfecteren het werkgebied en tools, vervolgens onder het werkgebied en pipetten tegen UV-licht gedurende 15 minuten om cross-link een DNA verontreinigingen. Veranderen handschoenen.
  6. In het schone bio-veilige behuizing, voeg 2μl van de DNA-template voor de Mastermix in elke PCR-buis / plaat goed aan een totaal volume van 20μl (Figuur 2b) te verwerven. Aërosol preventie pipetpunten Gebruik voor alle vloeibare materialen.
  7. Kort Centrifugeer de PCR-buizen / strips / platen aan inhoud te mengen.
  8. Plaats het monster buizen / strips / plaat in de thermocycler en start het PCR-programma.
  9. Wanneer het programma voltooid is, verwijdert u de producten uit de thermocycler en bewaren bij 4 ° C tot elektroforese.

4. Gelelektroforese van PCR producten

* Dit protocol is standaard al vele jaren en is een optionele stap die kan worden ingezet als bevestiging van de PCR-producten wordt voorafgaand gewenst is om het verzenden van hen voor FLA.

  1. In een aparte post-PCR werkgebied, bereiden een 2% agarose gel. Gebruik 2,0 g agarose powder/100ml van 1x TBE (Tris / Boraat / EDTA) buffer-oplossing in een kolf. Verwarm het mengsel gedurende ongeveer 1,5-2 minuut in de magnetron. Schud de inhoud, verwarming nog een keer als nodig is om de agarose op te lossen. Iets afkoelen en giet de gel in een vorm met behulp van een kam met voldoende bronnen voor de monsters.
  2. Haal de PCR-producten van 4 ° C en centrifugeer gedurende ongeveer 30 seconden.
  3. Mix 2-5μl van het PCR-product met een 0,5-1μl van 5x of 6x gel laadbuffer (laden buffer is verkrijgbaar bij verschillende bedrijven, of kan gemengd worden in het lab. Recepten zijn online beschikbaar.)
  4. De putjes in de gel met de 6μl monster / laadbuffer mix. Voeg een moleculaire ladder naar een goed (bij voorkeur een 20 bp ladder).
  5. Laat de gel op 100V voor ongeveer 90 minuten.
  6. Laat de gel met ethidiumbromide oplossing voor 15-30 minuten, daarna in ultrapuur water gedestilleerd voor een gelijke hoeveelheid tijd.
  7. Het imago van de gel terwijl de UV-licht wordt toegepast. Er moet een band voor elk van de 4-5 DNA segmenten in de combinatie (zie figuur 3).
  8. Gooi de gel in overeenstemming met gevaarlijke materialen van de instelling beleid. Ethidiumbromide oplossing kan meerdere keren worden gebruikt voor de adequate verwerking.

5. Voorbereiding van de monsters voor het fragment length analyse (FLA)

  1. In een schone eppendorfbuisje, bereiden een meester mengsel dat 12μl van Hi-Di formamide oplossing van een verse hoeveelheid en 0.3μl van GENESCAN -500 LIZ dimensionering standaard (zowel van Applied Biosystems) voor elk monster te testen. (Hi-Di formamide denatureert chemisch de DNA-strengen voorafgaand aan de capillaire elektroforese, waardoor de noodzaak voor verwarming). Behulp van een 96-well optische kwaliteit reactie plaat, hoeveelheid 12.3μl van de formamide-LIZ mix in elke well wordt gebruikt voor monsters en stel de plaat opzij.
  2. Maak een bord kaart voor uw eigen administratie te geven welke DNA-monster is in elk putje (figuur 4a).
  3. Met behulp van buizen / strips of een 96-well plaat, voeg 1μl van het PCR-product (uit deel 3) om 59μl van PCR kwaliteit water het maken van een 1:60 verdunning van het PCR-product. Verdunningen kan worden aangepast op basis van signaalsterkte van de FLA gegevens of de helderheid van de gel bands. Nog lagere concentraties van DNA kanvoldoende zijn (1:120 of 1:180).
  4. Voeg 1μl van het verdunde PCR-product op de juiste goed in de plaat met de formamide-LIZ mengsel.
  5. Snelheid en efficiëntie kan sterk worden bevorderd wanneer de PCR werd ook gedaan in een 96-well plaat. Men kan gewoon line-up drie van dergelijke platen in de juiste volgorde: Plaat 1 met PCR-producten, Plaat 2 met steriel water voor de verdunning van de PCR-producten, en Plaat 3 met formamide en dimensionering ladder voor fragment length analyse. Een multichannel pipet zorgt voor een snel proces van de FLA voorbereiding.

Voorbeeld Analyse via genetische Analyzer

  1. Kalibreer de Genetische Analyzer de toegepaste flurophores per instructies van de fabrikant op te sporen. Zorg ervoor dat u een dye-set die LIZ omvat het gebruik.
  2. Vul het water spoelen containers en toevoegen van nieuwe Running Buffer met EDTA (1x) (Applied Biosystems) naar kamers buffer.
  3. Voeg een pre-split silicium septum op de plaat en plaats de plaat in de ontworpen holding lade. Druk op de 'Tray' knop op de genetische Analyzer om de autosampler voren te brengen. Plaats lade op autosampler en sluit de deur naar de genetische Analyzer.
  4. Maken of importeren een spreadsheet voor de analyse. Importeerbare bestanden hebben een. Plt extensie en worden in de tab-gescheiden formaat. Bestanden kunnen worden gewijzigd in Excel (Microsoft) of soortgelijke programma's.
  5. De monsters worden geïnjecteerd in de capillaire (50-cm lengte, POP-7 polymeer), door het aanbrengen van een injectie spanning van 1,6 kV voor 15 s. De capillaire elektroforese werkt op een spanning van 15 kV bij 60 ° C voor 1800 seconden. Het hele proces duurt ongeveer 45 minuten.
  6. Zodra een run is voltooid, worden de gegevens voor geanalyseerde elk monster omgezet naar bestanden met een. FSA extensie en geplaatst in een plaat map (Figuur 4b). Elk bestand is ongeveer 100 kB groot en kan worden opgeslagen op een flash-drive of geritst en per e-mail. Data bestanden kunnen worden bekeken met behulp van geschikte software, zoals GeneMapper ABI's of Peak Scanner.

6. Analyse van de fragment length resultaten

  1. Analyse van de gegevens van tl-capillaire elektroforese vereist speciale software. Indien dergelijke software is niet beschikbaar is, gaat het Applied Biosystems website en download Peak Scanner. De software is gratis en werkt heel goed. https://products.appliedbiosystems.com/ab/en/US/adirect/ab?cmd=catNavigate2&catID=603624
  2. Open Peak Scanner en 'Start New Project' gevolgd door 'Add Files'. Laad de geselecteerde. Fsa data bestanden naar het programma, inclusief de positieve en negatieve controles.
  3. Selecteren (markeren) en "analyseren" alle geladen bestanden. Zorg ervoor dat elk monster is ingesteld op "Maat Standaard: GS500 (-250) en Analyse Methode:. Sizing Standaard-pp Druk op 'Analyseren'.
  4. Onderzoek van de omvang in basenparen van elk gekleurd piek van het DNA-fragmenten in de monsters.
  5. Record elke piek grootte waarde in basenparen en vergelijk het met de positieve controle piek.
  6. Pieken in de positieve controlemonsters moet gunstig vergelijken met het aantal basenparen en de nummers van tandem repeats in de tabellen 4-7.
  7. Bepaal hoeveel korte tandem repeat segmenten aanwezig zijn in elk monster allel in vergelijking met de positieve controle. We maken gebruik van NHDP63 dat is voor het aantal exemplaren VNTR gesequenced op elke locus wordt onderzocht 4.
  8. Vul de opgenomen gegevens in een spreadsheet voor vergelijkende en / of wiskundige analyses. VNTR 'vingerafdrukken' of haplotypes, zijn strings van allelen van bepaalde loci die kenmerkend zijn voor een M. leprae stam.

7. Representatieve resultaten

Gelelektroforese van de PCR-producten zal hopelijk produceren een band voor elke locus in de primer combinatie (figuur 3). In figuur 3 zijn er 2 secties om de gel: het bovenste gedeelte heeft Combinatie een PCR-monsters en het onderste gedeelte Combinatie 2 monsters. Elke sectie bevat een 20 basepaar moleculaire ladder, gevolgd door PCR producten verkregen uit acht patiënten monsters. Combinatie 1 heeft ook een negatieve controle en uiteindelijk een positieve controle (NHDP63 stam). (De knoppen voor combinatie twee waren op een andere gel.) Merk op dat de meeste monsters die duidelijk zijn vijf bands, een display voor elke locus in de combinatie. In sommige gevallen kunnen bands te dicht bij elkaar om te verschijnen als afzonderlijke loci resulteert in de verschijning van slechts vier bands.

Verwachte amplicon maten zijn vermeld in tabel 1. Ons laboratorium maakt gebruik van NHDP63 stam van M. leprae als een positieve controle. Er zijn twee soorten te herhalen segmenten onderzocht: microsatelliet loci (met 1-5 base herhalingen) en minisatelliet loci (met segmenten van meer dan 5 basenparen meerdere keren herhaald).

Interpretatie van de gegevens bestanden van capillaire elektroforese is gebaseerd op twee normen: een intern DNA-fragment sizing standaard genoemd GENESCAN-500LIZ (ABI) en een externe positieve controle steekproef van geamplificeerd bacterieel DNA.

De FLA chromatogrammen, bekeken met behulp van Peak Scanner software, is te zien in de figuren 5a, 5b en 6.

Peak Scanner verstrekt gegevens over amplicongrootte (x-as in basenparen) en de signaalsterkte (y-as). (Figuur 5b) Aanvullende gegevens over piekoppervlak, etc. zijn ook beschikbaar, hoewel de grootte en de piekhoogte waarden zijn het belangrijkst. Pieken minder dan 100 eenheden in de hoogte worden doorgaans beschouwd als te zwak signaal betrouwbaar te zijn.

Figuur 6 vergelijkt de positieve controle (NHDP63) en twee monsters van patiënten, met een variatie in het aantal tandem repeats op locus (GTA) 9. In de positieve controle, de reeks (GTA) is 10 keer herhaald. De NHDP63 VNTR en de amplicongrootte werden geverifieerd door middel van genetische sequencing. Patiënt 4's PCR-amplicon is 3 bp kleiner dan de positieve controle aangeeft dat er slechts 9 herhalende eenheden, terwijl de patiënt 6 heeft een amplicon dat is 3 bp groter is dan NHDP63 onthullende 11 herhalingen van (GTA). Patiënt 2 had een lage bacteriële index (BI) met weinig of geen DNA-PCR-replicatie, dus geen FLA-signaal.

Moeite met FLA interpretatie van gegevens gebeurt soms als een gevolg van 'stotteren'. Tijdens de PCR-reactie, kan het DNA-polymerase produceren van fragmenten die een of meer herhalingen langer of korter is dan de bron allel. Deze worden doorgaans als pieken van lagere hoogte rondom de grote piek. Zij zullen 'op de ladder', dat is, het juiste aantal basenparen van de herhaling segment groter of kleiner zijn dan de belangrijkste piek. Het resultaat is een familie van pieken van dezelfde kleur. Figuur 7 is dit met locus (TA) 10.

Een andere moeilijkheid soms ondervonden met FLA gaat '+ A' of 'A-tailing', waarin de DNA-polymerase een enkele base [meestal adenine (A)] om het 3 'einde van de gekopieerde DNA-segment zorgt. Dit toont in FLA als een piek aan de rechterkant van een hoofd-of stotteren piek dat is een basepaar groter is dan de aangrenzende piek zoals weergegeven in figuur 8. Het moet niet worden verward met een hoofd-of stotteren piek. Een belangrijk hoogtepunt en de A-staart worden beschouwd als een enkele soort. De A-tail doet geen afbreuk aan het nummer van VNTR herhalingen. (Sommige DNA-polymerase kits zijn ontworpen om specifiek te bevorderen A-tailing om dit verstorend effect te verminderen. Het bevorderen van complete A-tailing neigt het produceren van een enkele piek in plaats van een paar pieken.)

De DNA-extractie en PCR-producten bevatten zowel M. leprae en menselijke DNA, echter met uitzondering van de (TA) 18, de primers zijn specifiek genoeg dat ze alleen de bacteriële DNA te versterken, en er is weinig of geen menselijk DNA-amplificatie. (TA) 18 levert vaak een piek bij 242 basenparen die is van menselijk DNA en is niet te zien in gordeldier gepasseerde DNA-monsters (Figuur 9).

De houdbaarheid van primers is over het algemeen goed op voorwaarde dat ze bewaard bij -20 ° C, alleen verwijderd voor onmiddellijk gebruik, en vervolgens opgeslagen bij 4 ° C tot verbruikt. Primers moet stabiel zijn bij 4 ° C gedurende 1-2 weken. Hoewel het maken van combinaties primer voor PCR is wat tijdrovend, is het aanbevolen dat slechts genoeg primer combinatie voor onmiddellijk gebruik worden bereid. Primer combinaties lijken enigszins te verminderen wanneer opgeslagen voor langere periodes.

TE moet worden gealiquoteerd van grotere voorraden, en de fracties kunnen worden opgeslagen, hetzij bevroren of op kamertemperatuur. Grotere hoeveelheden van 200-400μl zijn goed voor het verdunnen van gedroogde of geconcentreerde primer voorraden (Figuur 2a). Kleinere porties van 10-50 ul zijn nuttig voor aanvulling van de volumes van de primer-combinaties 3 en 4. TE is goedkoop en aliquots dient te worden weggegooid na gebruik.

Multiplex enzym kits zijn vrij duur en moet worden bewaard ingevroren (-20 ° C) tot gebruik. Na de PCR-voorbereiding, ongebruikte multiplex oplossingen onmiddellijk worden teruggestuurd naar 4 ° C. De kleine Qiagen Multiplex PCR kit wordt geleverd met drie buizen van multiplex mix, elk met 0.85ml (850μl) oplossing, voldoende voor ongeveer 65-70 PCR's.

Over het algemeen is het het beste om te voorkomen dat herhaalde, grote temperatuurschommelingen voor de materialen gebruikt in dit type van laboratorium-werk met inbegrip van de DNA-monsters, primers en multiplex kit oplossingen. Al het materiaal moet worden bewaard bij -20 ° C totdat het nodig is, en vervolgens bewaard op 4 ° C tot verbruikt. Lange termijn opslag van DNA moet worden bij -80 ° C.

Alle materialen die besteed weefsel, primers en / of DNA moet worden geautoclaveerd en afgevoerd wanneer zij niet langer van enig nut. Alle monsters worden behandeldmet ethidiumbromide of formamide moeten worden behandeld als gevaarlijk afval en afgevoerd in overeenstemming met gevaarlijke materialen van de instelling beleid.

Tabel 1
Tabel 1: Amplicon maten voor stam NHDP63

Tabel 2
Tabel 2: Fietsen Parameters voor VNTR PCR

Tabel 3
Tabel 3: Voorbereiding van de PCR

Tabel 4
Tabel 4: Allel pleit voor een combinatie

Tabel 5
Tabel 5: Allel pleit voor Combinatie 2

Tabel 6
Tabel 6: Allel roept op tot Combinatie 3

Tabel 7
Tabel 7: Allel roept op tot Combinatie 4

Figuur 1
Figuur 1: VNTR-FLA Process Flow Diagram

Figuur 2
Figuur 2. (A) Bereiding van Combinatie 1 Upper Primers (eppendorfbuisje foto met dank aan www.clker.com ). (B) PCR Setup (voor 8 PCR) (eppendorfbuisje foto met dank aan www.clker.com)

Figuur 3
Figuur 3. Agarosegel van combinaties 1 en 2 VNTR PCR-product DNA

Figuur 4a
Figuur 4b
Figuur 4. . (A) FLA Plate Map (b) de FLA bestanden: *. FSA

Figuur 5a
Figuur 5b
Figuur 5. (A) FLA Chromatogram van de positieve controle (NHDP63) voor de Combinatie een VNTR loci. (B) Peak Scanner gegevens voor amplicongrootte en overvloed van (GTA) 9

Figuur 6
Figuur 6. Vergelijking van de PCR-monsters aan de pc (NHDP63) voor de locus (GTA) 9

Figuur 7
Figuur 7. Hoofd-en stutter Peaks voor (TA) 10

Figuur 8
Figuur 8: + A (A-staart) Peaks grenst aan Main of Stutter Peaks.

Figuur 9
Figuur 9: (TA) 18 Main Peak, Stutter Peaks en menselijke DNA Peak

Figuur 10a
Figuur 10b
Figuur 10:. (A) Strain Differentiatie van M. leprae op basis van VNTR data (B) Strain Differentiatie van M. leprae op basis van MLVA DNA-vingerafdruk

Discussion

De collectie van de huid monsters van lepra patiënten vereist deskundige artsen of technici werken op de huid klinieken. Laboratorium medewerkers die werken met deze monsters moeten besteden veel zorg aan lab jassen, handschoenen en een beschermende bril dragen en om te werken in een bio-safety kast bij de omgang met geïnfecteerde monsters van menselijke of gordeldier weefsel. Desinfectie van oppervlakken en gereedschappen is ook kritisch. Werken in een schone, steriele bio-safe kast is van belang voor het vermijden van verontreiniging van DNA-monsters.

DNA-extractie is uitgegroeid tot relatief eenvoudig dankzij de ontwikkeling van de extractie kits van bedrijven als Qiagen. Richtingen moeten zorgvuldig worden opgevolgd. Alle monsters moeten worden bewaard koud wanneer niet in gebruik. Vermijd herhaaldelijk, extreme temperatuurschommelingen voor monsters.

DNA-primers gebruikt in dit werk kan worden besteld bij verschillende bedrijven die zijn in de lijst met literatuur referenties aan het einde van deze paper. Voorzichtigheid is geboden om te werken met primers in een DNA-vrije omgeving, om besmetting te voorkomen. Primers komen als droog poeder en moeten worden gemengd met TE en verdund tot een concentratie van 100 urn, dan opgesplitst in kleinere hoeveelheden (Figuur 2a). Werken oplossingen van primers worden verder verdund tot 10μM concentraties. Nogmaals, geen gebruik maken van DNA-monsters in gebieden / kappen waar de primers worden gebruikt en bereid.

PCR-producten moeten ook worden bewaard koud wanneer niet in gebruik.

Een 3% agarosegel voorbereiding zal geven betere DNA band scheiding, maar duurt het langer te lopen. Voor zuiver kwalitatieve doeleinden, 2% is meestal voldoende. Ethidiumbromide oplossing gebruikt voor het kleuren van de DNA in agarose gels is een zeer actief genotoxin die wordt geabsorbeerd door de huid. Behandel deze oplossing en gels gekleurd met met behulp van grote zorg en altijd zeker om handschoenen te dragen. Handen grondig wassen na het hanteren van een DNA-monsters of ethidiumbromide materialen. Gooi ethidiumbromide kleuroplossing, wassen en gels volgens de institutionele richtlijnen. Gels zijn niet routinematig vereist; deze stap kan worden geëlimineerd zodra FLA methoden zijn vastgesteld. Het is tijd en reagens beslag.

De formamide oplossing die wordt gebruikt bij de voorbereiding van monsters voor FLA is ook zeer giftig en moet met zorg worden behandeld. Handen wassen na het gebruik ervan. Gooi het volgende institutionele richtlijnen.

Het lezen van de resultaten van het FLA gebruik van Peak Scanner software kan een uitdaging zijn. Een basisset van allel oproepen (aantal tandem repeats) is ontwikkeld bij CSU (tabellen 4-7). (Opgemerkt moet worden dat de tabellen 4-7 misschien niet all inclusive. Als andere stammen van M. leprae worden bestudeerd, allelen met een kopie nummers buiten de vermelde bereik kan worden gevonden.) Een bijzondere uitdaging houdt 'stotteren' pieken. Dit zijn families van pieken, vooral van STRs die alleen betrekking 2-3 basepaar herhaalt, zoals (TA) 10. Soms is het selecteren van de juiste piek te lezen is moeilijk (figuur 7). In deze figuur, de piek in de positieve controle op 190 bp is de belangrijkste piek. Pieken lager in hoogte dat zijn 2, 4 of zelfs 6 basenparen groter of kleiner zijn dan de grootste piek worden 'stotteren pieken. " A-tailing kan ook leiden tot verwarring. A-tailing is eerder beschreven in de tekst en in figuur 8. Tot slot, als er PCR-producten zijn zeer overvloedig in de monsters, kunnen pieken verschijnen met een dubbele piek. In dit geval, lees dan het midden van de piek te vormen. (Zie Figuur 6, Patiënt 6.)

Data management kan een enorme taak voor dit soort werk. Het is belangrijk dat registreert alle relevante informatie voor alle experimenten zoals: de datum van een taak of procedure, operator, strip / plaat kaarten, FLA-orders, PCR-condities en recepten, data van gels en foto's, opslag temperaturen, DNA-template verdunningen, FLA elektronisch bestand opslaglocaties, etc. Goede organisatie en het data management kan besparen uur van de tijd besteed op zoek naar specifieke delen van informatie in de toekomst.

Het laboratorium werk dat hier wordt beschreven is al een aantal jaren bij Colorado State University en op andere locaties in de wereld. Het grote beeld van wat allemaal van de verzamelde gegevens betekent en hoe het kan worden van het toekomstig gebruik begint te ontstaan. Figuren 10A en 10B tonen hoe deze DNA-vingerafdrukken kunnen worden gebruikt om verschillende M. te onderscheiden leprae stammen tussen landen (10A) of zelfs tussen de families (10B). Familie en de gemeenschap gekoppeld gevallen is aangetoond dat M. dragen leprae van soortgelijke of identieke VNTR stam types. De hoop is dat het mogelijk is om meer inzicht te krijgen in de wijze (n) van lepra transmissie, zodat een systeem voor vroegtijdige opsporing van transmissienetwerken kan worden ontwikkeld voor die mensen most in gevaar, en dat curatieve therapie mag aanvangen voordat permanente neurologische en dermatologische schade wordt aangericht.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

De financiering werd verstrekt door NIH / NIAID verlenen RO1-AI-63457 en de ARRA subsidie ​​aan te vullen RO1-AI-63457 S1. Wij erkennen de bijdragen van alle huidige en vroegere leden van het laboratorium groep en medewerkers.

References

  1. World Health Organization. Chemotherapy of leprosy for control programmes. Technical Report Series. 675, 18-22 (1982).
  2. Cole, S. T. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature. 409, 1007-1011 (2001).
  3. Leproma Web Server. Leproma Web Server [Internet]. Available from: http://genolist.pasteur.fr/Leproma/ (2004).
  4. Groathouse, N. A. Multiple Polymorphic Loci for Molecular Typing of Strains of Mycobacterium leprae. J. of Clinical Microbiology. 42, 1666-1672 (2004).
  5. Young, S. K. Use of Short Tandem Repeat Sequences to Study Mycobacterium leprae in Leprosy Patients in Malawi and India. Public Library of Science: Neglected Tropical Diseases. 2, E214-E214 (2008).
  6. Monot, M. Are Variable-Number Tandem Repeats Appropriate for Genotyping Mycobacterium leprae. J. of Clinical Microbiology. 46, 2291-2297 (2008).
  7. Kimura, M. Rapid Variable Number Tandem-Repeat Genotyping for Mycobacterium leprae Clinical Specimens. J. of Clinical Microbiology. 47, 1757-1766 (2009).
  8. Weng, X. iaoman Identification and Distribution of Mycobacterium leprae Genotypes in a Region of High Leprosy Prevalence in China: a 3-Year Molecular Epidemiological Study. J. of Clinical Microbiology. 45, 1728-1734 (2007).
  9. Weng, X. Transmission of leprosy in Qiubei County, Yunnan, China: Insights from an eight year molecular epidemiology investigation. Infection, Genetics and Evolution. (2010).
  10. Sakamuri, R. M. Population-Based Molecular Epidemiology of Leprosy in Cebu, Philippines. J. of Clinical Microbiology. 47, 2844-2854 (2009).
  11. Fontes, A. N. B. Genetic diversity of Mycobacterium leprae isolates from Brazilian leprosy patients. Leprosy Review. 80, 302-315 (2009).
DNA-vingerafdrukken van<em> Mycobacterium leprae</em> Stammen Met behulp van variabel aantal Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Lengte Analyse (FLA)
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Jensen, R. W., Rivest, J., Li, W., Vissa, V. DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA). J. Vis. Exp. (53), e3104, doi:10.3791/3104 (2011).More

Jensen, R. W., Rivest, J., Li, W., Vissa, V. DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA). J. Vis. Exp. (53), e3104, doi:10.3791/3104 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter