頭蓋放射線療法によって引き起こされた定量認知デクリメント

Summary

脳腫瘍の放射線治療管理に起因する認知機能障害に悪影響生活の質に影響を与える臨床的に難治性の状態を表します。批判的に放射線誘発性認知デクリメントを改善するための潜在的な介入を評価する能力は、最終的に認知の厳格な定量的な評価を実施する能力に依存します。

Abstract

生存の例外を除いて、癌の臨床管理に起因する認知障害は治療結果を口述主要な要因である。 CNS及び非中枢神経系の悪性疾患に罹患し、多くの患者は、放射線療法と化学療法は疾患制御のための最良の選択肢を提供します。これらの治療法は、しかし、コストで来て、ほぼすべてのがん生存者（2006年だけのように、米国で約11万人）は頭蓋放射線治療（〜200,000 /年を受けた患者に見られる最も深刻なケースでは、認知機能障害を開発するためのいくつかのリスクを負担する）原発性および転移性脳腫瘍¹の制御のために。その長期生存著しい社会経済負担²の著しい認知デクリメントの結果に悩まさ小児例では、特に問題である。現在までに、この重要な臨床的問題には満足のいく解決策はまだありません。

私たちは、移植された幹CEを使用して、この深刻な健康上の懸念に対処してきたLLS頭蓋照射³にかけ無胸腺ラットの放射線誘発性認知機能の低下に対抗する。定位照射の詳細およびヒト神経幹細胞（hNSCs）のin vitroでの培養と移植における私たちの仲間論文（Acharyaさんら、JOVE参照）に記載されています。照射および移植手術後、ラットは、その後認知の変化、移植細胞の生存と照射後の分化特異的マーカ1と4ヶ月の発現のために評価される。批判的に放射線誘発認知後遺症、定量的な認知課題の厳格なシリーズを実行する必要が改善するように設計された任意の潜在的な介入の成否を評価すること。これを達成するために、我々は、海馬と非海馬学習と記憶を定量化するために、斬新な場所の認識、水迷路、高架式十字迷路と恐怖条件付けなどの認知テストパラダイムのスイートに私たちの動物を施す。我々は、の有用性を実証しているこれらの照射動物の認知デクリメントし、特定のタイプを定量化するためのテスト、およびhNSCsを移植した動物は認知機能³の大幅な改善を示すことを示すためにそれらを使用していました。

移植されたヒト幹細胞に由来する認知のメリットは、同様の戦略は一日認知障害に苦しんでがん生存者に大いに必要な臨床リコースを提供するかもしれないことを示唆している。したがって、我々は診療所に私達の有望な結果の変換を容易にするために私たちの認知テストパラダイムに使用する重要な手順の書かれており、視覚的なドキュメンテーションを提供してきました。

Protocol

私たちの認知テストのパラダイムを模式的に図1に図示されています。照射や外科的処置が行われた後の認知テストは1月に開始されます。

小説場所の認識（NPR）にタスクを行う

1. 小説·プレイス認識（NPR）タスクがMumbyら（2002）により記載された手順に基づいており、海馬⁴に依存している空間認識記憶課題である。
2. ラットは最初の3日間は一日一回20分間のテストアリーナ（カスタムメイド、白、アクリル、オープントップ·ボックス、70センチメートルX 40センチメートル高いX 70センチメートル）に配置することにより、テスト·コンテキストに精通されています。後でテストのために使用されないオブジェクトは、これらの馴化セッション中にアリーナに配置されます。
3. 動作の記録および追跡は必要ありませんしながら馴化段階では、探索行動の手動観測は、注目すべきである。
4. NPRのタスクのすべての段階については、アリーナは交絡臭気手がかりを最小限に抑えるために、70％エタノールを用いて動物の間で徹底的に掃除されています。すべての試験のために、動物は単に彼らが横に配置することが起こることを、ブロックを探索する機会を最小限にするための一貫したオリエンテーションでテストアリーナの中央に実験場所の動物を。
5. 習熟相と5分のテストフェーズは第四日目に投与されています。
6. 習熟段階では、徹底的に70％エタノールで洗浄された2つの同一のプラスチックブロック（8センチメートル×横3cm X 10cmの高）がテストアリーナ内の特定の位置に配置されている。一匹を5分間各アリーナに置かれ、自由に探索することが許可されます。
7. 2つの等しくおなじみの空間位置の探査は、自動追跡システムを使用して得点が記録されます。すべての段階については、探査が動物の鼻ポイントは4センチメートルの半径内にあるものとして定義され、ブロックに向かう。
8. フォー習熟段階llowing、動物は5分遅延間隔のための小さな保持ケージに入れています。この間、テストのアリーナを70％エタノールで洗浄され、ブロックの同一のコピーが追加され、習熟段階の間と同一の空間位置に1つ、そして小説空間位置の1つ。ラットは習熟段階か​​らのブロックの空間的配置を覚えている場合、それは小説の空間位置に位置するブロックを探索するより多くの時間を過ごすことになります。
9. 5分の遅延間隔後、動物は5分のテストフェーズのためのテストアリーナに戻されます。彼らは、3分間自由に探索する。
10. 24時間習熟段階の終了後、動物は24時間のテスト段階のために再度テストアリーナに戻されます。このフェーズでは、1つのブロックは、習熟及び5分のテストフェーズと同じ位置のままで、他のブロックは、新しい、斬新な空間的な位置に置かれる。繰り返しになりますが、もしラットの再メンバーは前日習熟段階か​​らのブロックの空間配置、彼は小説の空間位置に位置するブロックを探索するより多くの時間を過ごすことになります。
11. さて、様々な空間的な位置にあるブロックを探索に費やされる時間の量は、自動追跡プログラムを使用して収集され、実験群間の差を統計的に分析することができます。
12. 習熟段階では、合計時間は全体のトライアル間の両方の空間位置を過ごして計算されます。彼らが（ 図2A）均等に精通/動物に慣れていないとして、このフェーズ2の空間位置を探索に費やされる時間に差があってはならない。さらに、実験群間の全探査で​​有意な差が探索するモチベーションのグループのばらつきや不安のレベルを示すことがありますと2テスト段階から空間認識記憶の結果を解釈する際に考慮すべきである。
13. 両方のための5分や24時間対応のテストフェーズ、探査比は次のように計算されます時は、新規ポジションを過ごした-時は、おなじみの位置/（ 図2B）探索にかかった合計時間を過ごした。このように、オブジェクトを探索するためのモチベーションの個々のばらつきが考慮されます。正常な動物は、5分や24時間対応の遅延間隔（ 図2B）、次の機会（破線で示す）が予想よりも小説空間位置を探索するかなり多くの時間を費やしています。
14. 探査比は、通常、5分や24時間対応のテスト⁴の最初の60秒ごとに計算されます。テストトライアルの進捗状況として、小説空間位置は、動物へのより身近になるためです。したがって、テストトライアルの最初の分は、空間認識記憶の最も正確な評価を提供します。

2。高架式十字迷路（EPM）の作業を行う

1. 高架プラス迷路（EPM）のタスクがWalfとフライ、2007 ⁵から手順に基づいています。
2. EPMのタスクは、げっ歯類における不安を評価するために使用されています。 EPM装置はプラス状に配置された腕で、床レベルから "45を調達して4アーム迷路（45"×4 "）です。2つのアームが囲まれ、2が開いている。示す装置がメッド·アソシエイツ株式会社によって製造されている。
3. このタスク時の動作は、新規環境（オープンアームに費やされた時間）と保護地域（クローズドアーム）に残っているのための好みを探求するラットの自然な動機との間に矛盾を反映している。
4. 実験室は明るく閉じた、より薄暗い武器を好むように十分な動機を確保するために迷路を指さしたスポットライトで照らされています。
5. 迷路は最初の動物をテストする前に十分に洗浄し、各試験の間にある。
6. 動物が離れてからは、オープンアームに直面して、前肢の下でそれを保持し、迷路の中央部に置くことで、装置内に配置されている実験者。各トライアルは5分間続きます。
7. 動物のパスは、エントリーと時間の量のその数は計算することができ、オープンとクローズの腕の中で過ごしたので、自動トラッキングソフトウェアを使用して追跡されます。そのような装置の側面にわたって飼育、グルーミング、ヘッドディップとして追加の動作を監視することができます。動物の中心点は、アームに交差したときのエントリがカウントされます。
8. ラットが迷路から落ちた場合は、すぐにそれが落ちたから、オープンアームに戻され、イベントが観察ノートに記録されます。ラットが長時間フリーズする場合は、すべての可能な原因（ 例えば 、試験室の外に突然、大きな音）とともに動作は、留意し、テストでは、すべての実験動物が同様の露光時間を持つように継続されます。
9. もろ手で時間/腕の中で総時間：オープン対クローズドの腕の中で費やされた時間は比の計算に使用されます。同様に、エントリの比率は、総対の腕を開きますアームエントリが計算されます。自動トラッキングソフトウェアを使用して、総走行距離と速度は、実験群間の運動機能の違いを評価するために測定することができます。
10. 増加した不安や恐怖は、クローズドアームで過ごした多くの時間と関連付けられている間に減少した不安は、オープンアームに費やした時間の割合が大きいと関連付けられています。正常な動物はチャンス（破線で示すように、 図3）により、予想よりも開いている腕の中で大幅に少ない時間を費やしています。少なく不安の動物（たとえば、迷路か、次の抗不安薬物治療への複数回の露光後）オープンアームに多くの時間を過ごすことになりながら、より気になる動物は、オープンアームに比例して少ない時間を過ごすことになります。

3。文脈手掛かりと恐怖条件付け（FC）の作業を行う

1. 文脈的手掛かり恐怖条件付け（FC）のタスクの説明を見るSchafから手順に基づいてい電子ら、1999、Winocurら、2006とマクラウドら、2007 ^6-8。
2. 侵害刺激（通常は軽度フットショックとそれをペアリングすることによって、恐怖条件付け（FC）のタスクでは、動物は以前に中性刺激（条件刺激文脈、光またはトーン）;恐れることを学ばれている行動のパラダイムである無条件刺激）。学習は、急速な、堅牢で長持ちであり、したがって、FCのタスクは、学習およびげっ歯類でメモリの神経生物学的回路を研究するためにしばしば使用されます。
3. FC装置は30cm X 30センチメートルX 40センチメートル高い密閉チャンバ（Phenotyper、モデル3000、Noldus情報技術）です。室の床は、ショック刺激を提供する目的で使用されるステンレス鋼のグリッドで構成されています。 Phenotyperは、条件刺激として作用し、オンデマンドで2300Hz、90デシベル音を発するスピーカーが装備されています。
4. ショックはショックジェネレータ（メッド·アソシエイツ株式会社）を経由して配信されます。ショックはラスを生成しません瞬間的な不快感であるティンの痛みや組織の損傷。トレーニングやテストトライアルの両方のため、衝撃やトーン刺激の配信がタイムアウトし、Ethovision XTはアドオントライアルとハードウェア·コントロール·モジュール（バージョン7.0; Noldus情報技術）を使用して自動的に制御されます。
5. 最初の日に、FCのトレーニングが行われている。 Phenotyperを70％エタノールで十分に洗浄され、単一の動物は、チャンバ内に配置されます。訓練試験は3つのフェーズで構成され、全くショックやトーンが投与されていない（1）ベースラインフェイズ、トーンショックの組み合わせが提示される（2）訓練段階、および（3）トレーニング後の段階、時なし衝撃や音が投与される。各フェーズは動物当たり15分の総訓練試行時間は約5分です。
6. トレーニングフェーズでは、トーンが30秒、トーンの終わりと一致するために投与される、1ミリアンペアショックが1秒間グリッドに配信されます。このトーンショックペアリングは可変10から60セコで、合計5回繰り返されます各ペアの間にND間隔間隔。
7. 訓練段階から、動かない、または凍結各動物が費やす時間の割合は、初期ベースライン期の最後の60秒（トーンショックのペアの前に自発的凍結を確立する）から、ポストの最後の60秒から測定されます訓練相（トーンショックの組み合わせに応じて、すくみ行動を確立するために）。正常な動物は、トレーニング後の段階（ 図4）の間凍結のレベルをベースライン·フェーズ中に凍結の非常に低いレベルを表示すると非常に高い（〜95％）。
8. 24時間後、動物は同じコンテキストに返され、5分間の文脈FCのテストのために観察される。全くショックやトーンは、このフェーズ中に配信されず、凍結に費やされた時間の割合は、全体の審理のために計算される。トレーニングからコンテキストテストにコンテキストを一定に保つことの重要性を注意してください。実際には、同じ実験のハンドルを持って、両方の日に動物をテストすることですねcessary。通常の動物はすくみ行動（ 図4）に従事し、コンテキスト裁判の約70％を費やしています。
9. 手掛かりFCのテストは一時間後に投与される。チャンバーのコンテキストは、グリッドの床を除去チャンバの外側にパネルを追加し、香りの家庭用掃除機で床を掃除することによって変更される。動物の凍結挙動は最初分間観察し、文脈が十分に（図4）が変更されている場合氷結のレベルが非常に低くなっています。トーンは、その後の沈黙の最後の1分、続いて3分間再生され、パーセントの時間を費やし凍結が計算されます。正常な動物は、この時間（ 図4）の間に凍結の高いレベルを示しています。
10. 合計では、すくみ行動の5離散的措置が収集され、（1）ベースライン、（2）研修後、（3）コンテキストtest、（4）プレキュー試験、（5）キューとポストキューテスト。
11. ベースライン·フェーズで凍結の不在はsubstanながら、通常の不安レベルを確立するトレーニング後のフェーズ中に動凍結はそのまま感覚運動能力を示唆している。コンテキストのテスト中にフリーズはそのまま海馬と扁桃体機能⁹に依存している訓練のコンテキスト、24時間対応のメモリを確立します。プレキューテストの凍結がないことは、初期研修コンテキストに十分な変化を示唆している。キューおよびポストキュー凍結はそのまま扁桃体の機能に依存して⁹トーンの刺激、24時間対応のメモリを確立します。

4。モリス水迷路（MWM）タスクを行う

1. モリス水迷路課題の手続きは前の記述^10,11に基づいています。
2. モリス水迷路（MWM）タスクは、遠位手がかりの利用が不透明な水の大きなプールに沈めエスケーププラットフォームを見つけるために必要とげっ歯類のための空間学習のテストです。大規模な、明確な視覚的な手がかりは、特定の、一定の場所にプールの周りに配置されます。動物は、suに移動するには、次のキューを使用することを学ぶプラットフォームをbmerged。彼らは泳ぐことができない場合は、動物が監視され、水から除去される。
3. 空間学習は、プラットフォームが存在しない場合、プラットフォームの面積に対する選好を評価することによって決定されて繰り返された試行と参照記憶を越えて評価される。逆転裁判は空間的な障害の検出を強化し、そのような前頭葉¹⁰のような付加的な脳領域に課税することができる。
4. MWMタスクが8日間にわたって投与し、4つのフェーズで構成され、キュードテスト、アクイジション·フェーズ、24時間プローブテストと逆転学習テスト。
5. プールは高いカスタムメイド直径白、ポリエチレンタンク、200センチメートルと60cmです。これは約30cmの深さまで水で満たし、白、非毒性塗料を使って、不透明な作られています。水温は20〜22℃（68および72°F）の間で維持されます。エスケープ·プラットフォームは、直径10cmの円形を測定トップとカスタムメイドの、透明なプラスチック製のスタンドです。それは、ウォートの表面の下に約1.5センチメートル座るR。
6. キュードテストでは、1日目に投与した4試験で構成されています。避難場所は、動物に明らかであるように、これらの試験では、明瞭な黒と白の旗は、プラットフォームの中央に配置されます。このフェーズでは、空間的な情報の使用を最小限に抑えるために、壁の手がかりは除去され、プラットフォームおよび開始位置は、裁判から裁判に変化させている。このフェーズでは、アクイジション·フェーズが開始される前に実験群の間の任意の感覚·運動に関連する差異を排除するのに役立ちます。
7. MWMタスクの全ての段階では、動物は、前肢の下で開催されており、静かに指定された開始位置に水に入れ、プールの壁に面しています。動物は1日4試験の各々の間の試行間間隔は8から10分があるような8のコホートでテストされています。試行間のインターバル中に、動物は体温を避けるために、温暖化のケージで飼育されています。
8. キュードテストでは、最大30秒の水泳時間は上に登るために動物のために許可されているプラットフォーム。最大時間は、動物·エスケープ前に到達した場合は、実験者が手でプラットフォームに導くとプラットフォーム上に配置します。動物が温暖化ケージ内に配置される前に20秒の休止期間のためのプラットフォーム上に残ります。
9. 各キュードテストトライアルでは、動物は、プールの周囲に異なる、予め決められた開始位置から開始され、プラットフォームはまた、4つの異なる象限の各位置に移動されます。
10. アクイジション·フェーズでは、次の日から始まり、5日間連続で1日4試験で構成されています。このフェーズでは、隠されたプラットフォームは、同じ場所に残り、動物が遠部屋の手がかりを使用してそれにナビゲートすることを学ぶ。
11. 再び、4試験のそれぞれについて、動物は異なる、あらかじめ決め始点でプールに置かれます。毎日、開始点の2が左にあり、開始点の2はegocの発展を避けるために、ランダムな順序で、プラットフォームの右側にあるタスクを解決するためのentric空間戦略。
12. 各取得裁判の最大の水泳時間は動物がに導かれ、実験者がプラットフォーム上に配置された後、60秒です。動物が脱出後に20秒のためのプラットフォーム上に残る。
13. 7日目、24時間で最終訓練試験の後、60秒のプローブ試行は、プラットフォームが除去されて投与される。このフェーズは、プラットフォームを含めるために使用される象限のための動物の好みを判断し、空間参照メモリ¹⁰の尺度として使用される。プローブ試行の後、プラットフォームは同​​じ象限に戻され、3定期的な取得試験が投与される。
14. 8日目に逆転学習のテストでは、プラットフォームは逆転学習能力を評価するために、新しい場所に移動します。その新しい場所に固執性の評価や、INAを提供し、時間に対する動物の量を測定することは、前の場所にプラットフォームを探して過ごすプラットフォームは¹⁰に移動された後に以前の場所への応答を抑制する安定化する働きがあります。取得とプローブフェーズとしては、4〜60秒の試験が投与される。
15. キュードテストでは、プラットフォームや速度を見つけるためにレイテンシがそれぞれ、視覚や運動機能の指標として使用されています。このフェーズの実験群間の差異は存在するかもしれないグループ間の感覚·運動機能の違いとして取得し、メモリの結果の解釈の際に考慮しなければなりません。
16. アクイジション·フェーズでは、プラットフォームおよび/またはパスの長さを見つけるために、待ち時間が空間学習の指標として使用されていることを意味します。通常の動物では、待ち時間が徐々に平均脱出時間は5日目で15〜20秒（ 図5A）の周りにあるような5取得日がたつにつれて減少脱出。
17. プローブフェーズについては、（ 図5C最初のプラットフォームの以前の場所に到達するために、プラットフォームまでの距離（ 図5B）、および/ ​​または遅延を意味する
18. 反転フェーズでは、プラットフォームを含む古い対新しい象限で過ごしパーセント時間は固執の尺度として使用される。 4回の試行の結果、古いプラットフォームの場所の設定は、新しいプラットフォームの場所の設定として減少するはずである（ 図5D）が確立されます。

5。代表の結果：

図1：当社の認知テストパラダイムの模式図。

図2。小説場所の認識タスクでコントロール動物からの代表的な結果。 A）の合計時間は、2つの空間的位置を観光した習熟段階の間にほぼ等しくなければなりません。 B）の探査比（小説poを過ごした時間sition /両方の位置を探索に費やされる時間）が5分や24時間対応の遅延間隔後に小説空間的な位置のための明確な優先順位を示しています。破線はチャンスの性能を示しています。

図3：高架式十字迷路上のコントロール動物からの代表的な結果。正常な動物は、オープンアーム（破線で示す）でたまたま予想より少ない時間を費やしています。抗不安薬との迷路や治療への複数回の露光が開いて腕の中で過ごした時間が長くなります一方、気になる動物は、対照と比較して、オープンアームに比例して少ない時間を過ごすことになります。

図4：恐怖条件付けタスクでコントロール動物からの代表的な結果。凍結の低レベルは、室（ベースラインへの初期暴露中に観察される）、コンテキストがキューテスト（プレキューテスト）の前に変更されたとき。これとは対照的に、通常の動物はすくみ行動に従事し、トレーニング後の期間の大半を過ごす。動物は訓練には24時間の遅延後に発生したコンテキストを覚えているなら、彼らは5分コンテキスト試験の約70％を凍結挙動に取り組んでまいります。動物が音を覚えていれば同様に、彼らはキューキューとポストテストの間凍結の高いレベルを示しています。

図5：モリス水迷路課題で対照動物からの代表的な結果。 A）は脱出レイテンシはアクイジション·フェーズプログレッシブ訓練に伴って減少する。 B）およびC）最初の24時間、プローブテスト時に以前のプラットフォームの場所を横断する距離からと待ち時間を平均空間参照記憶の指標として使用されています。 D）が逆転学習をTESの最終日にプラットフォームの場所を変更することにより評価されるティン。 4回の試行の結果、正常な動物は、徐々に古い象限の検索を停止し、プラットフォームが新しい場所に置かれていることを学ぶ。

Discussion

がん生存^12,13でますます一般的になりつつある認知機能障害の開発を未然に防ぐように設計され、長期的な戦略のための差し迫った必要性がある。細胞療法は、彼らが細胞傷害性がん治療¹⁴から紛失または破損したセルを交換するための機会を提供するため、CNSにおける正常組織の後遺症の範囲を改善するための手段を提供することができる幹。これらの取り組みの実現を早めるために、我々は、機能的には中枢神経系の³の照射された組織のベッドの中で認知を復元するには、頭側で移植しhNSCsの能力を確認した校長の実験の証拠のシリーズを実施している。この努力にとって決定的に重要なのは、確実に再現可能な方法で慎重に制御認知一連のテストを遂行するに足る能力だった。私たちはクリニックで幹細胞治療の並進可能性を促進するための努力で、これらの重要な手順を詳しく説明しています。アールさらなる問題データの質の重大な影響を与える可能性は、以下の強調表示されます。

認知テストでは、細部に注意を払う必要がありますし、特定の標準的なプラクティスに準拠することは、結果の解釈を複雑にアーチファクトを最小限に抑えることができます。動物保持客室と実験者とは別の専用の行動試験室の使用が望ましい。また、手元の作業から動物をそらすことができる動物施設で外部ノイズを遮断する "ホワイトノイズ"を使用するのが賢明です。認知機能テストのために運命づけられた動物へのストレスを最小限に抑えるために、それは彼らが前のタスク管理への行動試験を実行する実験に精通していることが重要です。女性と男性をテストする場合、一般的に、それは彼らが男性の匂いの手がかりがテストアリーナに残っていれば、テスト中にもっと不安になる傾向があるとして最初の女性をテストすることをお勧めします。タスクのシリアルバッテリーを投与する場合、それは草原に動物を公開することが重要であるstの第一ストレスの多い作業（EPMのように、NPR）と最後の最も過酷なタスク（FCのような、MWM）。