Summary
وقد تم تطوير تقنية الطباعة الحجرية تنوعا البلازما لتوليد أنماط سطح مستقر لتوجيه مرفق الخلوية. ويمكن تطبيق هذه التقنية لإنشاء شبكات الخليوي بما في ذلك تلك التي تحاكي الأنسجة الطبيعية واستخدمت لدراسة العديد من أنواع الخلايا متميزة.
Abstract
مطلوب في كثير من الأحيان التلاعب المنهجي لالمكروية الخلية مع قرار المتناهية الصغر والنانوية عن فك رموز مختلف الظواهر الخلوية والجزيئية. للتصدي لهذا المطلب ، قمنا بتطوير تقنية البلازما الطباعة الحجرية للتلاعب المكروية الخلوية عن طريق خلق نمط السطح مع أحجام ميزة تتراوح بين 100 نانومتر إلى ملليمتر. الهدف من هذه التقنية هو أن نكون قادرين على الدراسة في طريقة للرقابة ، وسلوك الخلايا الفردية ، فضلا عن مجموعات من الخلايا وتفاعلاتها.
ويستند هذا الأسلوب الطباعة الحجرية البلازما على تعديل انتقائي للكيمياء السطحية على ركيزة من خلال حجب الاتصال من درجات الحرارة المنخفضة البلازما مع العفن الجسدي. هذا التدريع انتقائي يترك نمط الكيميائية التي يمكن أن توجه مرفق الخلية والحركة. ويمكن بعد هذا النمط ، أو قالب السطحية ، ويمكن استخدامها لإنشاء شبكات من الخلايا التي يمكن أن تحاكي بنية التي وجدت في الطبيعة وتنتج بيئة يمكن السيطرة عليها لإجراء التحقيقات التجريبية. تناسب هذه التقنية لدراسة الظاهرة البيولوجية كما أنها تنتج أنماط سطح ثابت على ركائز البوليمرية بطريقة شفافة حيويا. يمكن لأنماط سطح تستمر لأسابيع أو شهور وبالتالي التفاعل مع دليل الخلايا لفترات زمنية طويلة مما يسهل من دراسة طويلة الأجل العمليات الخلوية ، مثل التفاضل والتأقلم معها. تعديل على السطح الكيميائية في المقام الأول في الطبيعة ، وبالتالي لا يدخل تدخل الطوبوغرافية أو المادية لتفسير النتائج. كما أنه لا ينطوي على أي مواد سامة أو قاسية لتحقيق الزخرفة ومتوافق لزراعة الأنسجة. وعلاوة على ذلك ، يمكن تطبيقه لتعديل أنواع مختلفة من ركائز البوليمرية ، والذي يرجع إلى القدرة على ضبط ممتلكاتهم مثالية لوتستخدم على نطاق التطبيقات البيولوجية. القرار تحقيقه هو مفيد أيضا ، وبمعزل عن عمليات محددة ، مثل الهجرة ، والالتصاق ، أو ملزما يسمح للملاحظات ، المنفصلة واضحة على مستوى واحد لmulticell.
وقد استخدمت هذه الطريقة لتشكيل شبكات متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا لإجراء التحقيقات التي تنطوي على الهجرة ، ويشير ، وتكوين الأنسجة ، وسلوك وتفاعلات الخلايا العصبية استدعي في الشبكة.
Protocol
1. إنشاء القوالب المستخدمة في الزخرفة
- المفاهيمي تصميم أنماط. يتم إنشاء أنماط التي تعمل على تشكيل شبكات الخليوي ، ومراقبة الاتصال الخليوي ، عزل الخلايا ، تحاكي الهياكل الطبيعية ، أو دليل على خلاف ذلك التصاق الخلية والتنسيب.
- التصميم بمساعدة الحاسوب CAD أو إنشاء نمط يستند إلى وخلق الضوئية الرئيسية. ويهدف هذا النمط المطلوب في برامج CAD ، مثل أوتوكاد ، وترسل بعد ذلك إلى شركة خارجية لإنتاج الضوئية الرئيسية.
- ضوئيه لانتاج نمط الرئيسي. والشرائح الزجاجية المزخرفة مع رقيقة إيجابية إما مقاومة أو مقاومة سلبية سميكة وهذا يتوقف على حجم الهيكل الذي يتم إنشاؤه. تستخدم شرائح زجاجية للفوائدها يجري منخفضة التكلفة أقوى ، من رقائق السيليكون والغبار التي لا تنتج ما يصل عند كسرها. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام هياكل ملائمة أخرى مثل حواجز شبكية الحيود ونمط رئيسي.
- ويرد الشريحة منقوشة إلى كومة من الشرائح التي لم منقوشة. يتم تنفيذ جميع الخطوات داخل غطاء تدفق النظيفة للحد من الغبار.
- إنشاء قوالب الرئيسي. يتم إنشاء حاوية البربون أكبر قليلا من كومة من الشرائح لعقد ز 30 من Polydimethylsiloxane (PDMS) الذي يصب بعد ذلك على سطح منقوشة photolithographically لإنشاء القالب الأولي. هو degassed في PDMS وسمح لعلاج لمدة يوم أو يومين.
- يشفى بمجرد مقشر وPDMS الخروج من نمط رئيسي وتشكل العفن للخطوة التالية.
- يختلط 6 غرام من الايبوكسي جزء 2 (المساعدة DevCon # 14310 (6 ز) لمدة 1 دقيقة ثم تصب في القالب الرئيسي ، وسمحت لdegassed العلاج. إفراغ الغاز يجب أن يتم بسرعة الايبوكسي (<8 دقيقة) باستخدام العديد من فقاعة كسر حلقات وفقط باستخدام طبقة رقيقة قبل مجموعات الايبوكسي وإزالة فقاعة يصبح من المستحيل لإزالة الفقاعات. ز 6 وتستخدم وتنتج طبقة رقيقة مما يسهل سرعة إزالة الفقاعة.
- بعد ساعة واحدة ، وسوف يكون الجزء 2 الايبوكسي شفي جزئيا ويمكن إضافة المزيد من الايبوكسي على أعلى دون التفريغ لإنتاج أكثر سمكا الهيكل الذي هو الأسهل للتعامل في خطوات لاحقة. ثم سمح لعلاج الايبوكسي ل1-2 أيام.
- الشفاء مرة واحدة ، هي إزالة الايبوكسي من القالب الرئيسي PDMS ويلف شريط حول العفن الايبوكسي لتشكيل الحاويات. ومن ثم خلق العفن تعمل عن طريق سكب PDMS على القالب الايبوكسي والتفريغ في PDMS ، وعلاج لمدة يوم أو يومين.
- الشفاء مرة واحدة ، هي مقشر القالب العمل الخروج من الايبوكسي وتخزينها للحفاظ على النظافة.
2. الزخرفة من السطوح مع قوالب للتوجيهات الخلية
- يتم قطع أجزاء صغيرة من العفن العمل بها ووضعها في الصعود إلى البوليسترين طبق بيتري. وصفت مواقع هذه الفروع العفن.
- وشكلت لترايبود من الفروع الصغيرة والمرجحة لضمان الاتصال بين امتثالي العفن على سطح العمل وطبق بيتري. ويمكن ملاحظة وضع جيد من خلال النظر في قاع الطبق.
- وضعت الجمعية الى غرفة البلازما. يبدأ العلاج البلازما ، واستمر في 150 باسكال عند 29.6 W (أقصى القوة) لمدة 10 دقيقة باستخدام الهواء البلازما.
- بعد العلاج البلازما ، ويتم إزالة العفن وتوجيه الاتهام الوزن.
- يوضع طبق بيتري تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة من التعقيم داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية وتخزينها هناك حتى المصنف مع الخلايا.
3. بذر السطوح مع الخلايا
- يتم استزراع خلايا SH - 2266 - SY5Y CRL ورم الخلايا البدائية العصبية البشرية أو غيرها باستخدام بروتوكولات موحدة لنوع من الخلايا.
- التقاء SH - 2266 - SY5Y CRL يقاس خلايا ورم الخلايا البدائية العصبية الإنسان بصريا قبل البذر على سطح منقوشة.
- ويتم تقسيم خلية من معيار لإزالة الخلايا من سطح صحن بيتري بهم.
- هي المصنفة الخلايا ، التعويم مرة واحدة ، على سطح الطبق بيتري منقوشة بعد المخفف لتحقيق التقاء المطلوب عند وضعه على سطح منقوشة.
- يسمح للخلايا لتسوية ونعلق على السطح.
- هو طبق بيتري المحتضنة منقوشة لعدة ساعات إلى عدة أيام في حين أن خلايا التجمع على نمط إنشاؤها بواسطة البلازما.
- عند إضافة إلى زراعة الخلايا العصبية ، وحامض الريتينويك (10 ميكرومتر) يوميا من أجل حث الخلايا على التمايز إلى حالة تشبه الخلايا العصبية. يتم اضافة حمض الريتينويك في الظلام.
- يضاف حمض الريتينويك يوميا لعدة أيام ، وبعد ذلك سوف يتم ملاحظتها التمايز.
- يتم استبدال وسائل الاعلام كل يوم 3-4.
4. الملاحظة والتحليل
- تؤخذ الصور الدورية للخلايا الحية أو أشرطة الفيديو لمراقبة سلوك الخلايا مع مرور الوقت. لوحات حية ، وتوضع الخلايا في أعلى مرحلة المجهر الحاضنة التي تحافظ على خلايا عند 37 درجة مئوية والرطوبة 100 ٪ ، و 5 ٪ CO 2. ويمكن أيضا أن تكون ثابتة والخلايا الملون تحت المراقبة لمضان
5. ممثل النتائج :
ونتيجة نموذجية لتنفيذ تقنية الطباعة الحجرية البلازما هي تشكيل نمط من الخلايا التي تشبه بعض بنية تعسفية أو الطبيعية. ويعتبر هذا في الشكل 1A - B حيث تم إنشاء خطوط وشبكات الخلايا العصبية. ويمكن استخدام أنواع الخلايا الأخرى كذلك كما هو مبين في الشكل 1C - D ، مما يدل على الإنسان خلايا بطانة الوريد السري (HUVEC) وخلايا عضلات الهيكل العظمي C2C12 تشكيل شبكات. ويمكن أيضا مواد مثل البولي - L - يسين تكون منقوشة ، الشكل 1E لتسهيل الحجز على بعض أنواع الخلايا وغيرها من الاستخدامات. في حالة الخلايا العصبية تظهر ، ما كان يتم إنشاء شبكات من الخلايا التي لها صلات بينهما. يتطابق هذا ما يحدث بشكل طبيعي في الخلايا العصبية في الدماغ حيث لديهم اتصالات منفصلة بين الخلايا المجاورة التي تؤثر على عمل الدماغ. مع إنشاء هيكل من هذا القبيل في المختبر ، ويمكن أن يكون العدد ، والموقف ، والتردد وعوامل أخرى من الاتصالات للرقابة منتظمة. ويمكن قياس هذه النتيجة توجيه الاتهام البصر ويمكن أن تنفذ المدخلات الإضافية مثل المواد الكيميائية أو التحفيز الكهربائي للتحقيق في سلوك الشبكة.
ومن شأن النتيجة السلبية أن يكون نمط متضخمة أو ناقصة أو عينة ملوثة. ونمطا غير مكتملة أو غير ناضج نتيجة بذر الركيزة إما مع خلايا قليلة جدا أو كثيرة جدا والتي لن تزويد نمط مثالي مع مبلغ من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، إذا لم يتم تصميم هذا النمط بشكل صحيح (على سبيل المثال ، خطوط ضيقة جدا) فإن الخلايا لا تكون قادرة على تولي وتنمو بنجاح على ذلك. في حالة وجود عينة ملوثة ، لن النظافة المناسبة قد حافظت خلال واحدة من الخطوات رغم أن هذا أمر نادر الحدوث عند اتباع البروتوكول المناسب خلية ثقافة يرجع ذلك إلى حقيقة أن الزخرفة البلازما يعقم أيضا الركيزة.
الشكل 1. الزخرفه من الخلايا والبروتين.
Discussion
أسلوب التحقيق الخلية المقدمة هنا يمكن خلق أنماط معقدة من الشبكات المتعددة الخلايا التي تحاكي الهياكل البيولوجية وكذلك يوفر وسيلة لإنتاج المحفزات التي هي في طبيعتها التحت خلوية مما يسهل ثم التحقيقات في سلوك كل من خلية تجميع والاستجابات خلية واحدة إلى عوامل بيئية. استخدام هذه الطريقة بسيطة لكنها قوية كما أنه يمكن تنفيذ بسرعة مع انخفاض تكلفة المعدات في المختبر نفس الثقافة الخلية. بل هو أيضا بقوة الخلية الحساسة ، ويسمح سهلة الملاحظة للسلوك والناتجة من الطبيعة المستقرة لفترات زمنية طويلة ، مما يسمح التحقيق في سلوك الخلية طويلة الأجل. بالإضافة إلى أنه يسمح لمجموعة متنوعة من التجارب التي يتعين القيام بها لأنه متوافق مع العديد من أنواع الخلايا ويمكن أن تخلق أنماط التعسفي. استقرار على المدى الطويل لهذه التقنية مستمد من حقيقة أن functionalization سطح الكشف عنها من قبل البلازما هي جزء من السطح وليس طلاء أو طبقة أخرى والتي يمكن إزالتها أو المتدهورة. إذا كان يحتفظ بها تحت السائل ، ويمكن لهذا النوع من التعديل تحتفظ بقدرتها الخلية التوجيهية لعدة أشهر.
أهم جزء من التجربة اللازمة لضمان تحقيق نتائج ذات مغزى هو أن خلق نمط الرئيسية التي من شأنها أن تستخدم لتوجيه الخلية. إذا لم يتم هذا النمط مصممة على نحو سليم ، فإن الخلايا لا يستجيب بشكل مناسب لنمط وسلوك قد لا ينتج فائدة. يمكن المعلمات مثل عرض الخط وتباعد النمط ، والتأثير على الآخرين بشكل كبير التوافق مع خلية نمط معين ، وعادة ما يمكن إنشاء مجموعة من المعلمات من هذا القبيل على الشاشة الضوئية الرئيسية الأولية للتصميم الأنسب.
معلمات هامة أخرى تتصل بتنفيذ الزخرفة تشمل خلق القالب ، والحفاظ على بيئة خالية الغبار ، زرع الخلايا والعقم العامة للثقافة الخلية. قد تتم عن طريق إنشاء قالب نقل مختلف الخطوات التي اتخذت للسماح المتكررة PDMS صب القالب قبالة أحد الايبوكسي. يتم إنشاء القالب الايبوكسي لأنه لن تتحلل في بنفس الطريقة مع مقاومة العفن ، وارتفاع نسبة الجانب هياكل صغيرة تحت الصب المتكررة. إذا تم صب نقل بشكل صحيح ، لن تسفر أبعاد ويتأثر به ولكن إذا كان غير صحيح من قبل مثل علاج ، التفريغ ضعيفة ناقصة ، أو التسخين المفرط ، وفقاعات ، وخشونة ، وتشوه من نمط يمكن أن يحدث الأمر الذي يؤثر على النتيجة النهائية. فيما يتعلق بالحفاظ على البيئة الغبار الحرة ، يجب أن تبقى نظيفة والقوالب ممكن أي غبار يمكن أن تتداخل مع الاتصال السليم بين العمل والعفن PDMS سطح والسليم وبالتالي البلازما التدريع والزخرفة الكيميائية. كثافة البذر من الخلايا ويجب أيضا أن يكون الأمثل لضمان أن لا خلايا قليلة جدا أو كثيرة جدا وتسكن منطقة نمط ويجب المحافظة على عقم لتجنب التلوث الجرثومي وغيرها من الخلايا المستخدمة.
ويمكن أيضا أن يدرج هذا الاسلوب مع العناصر الأخرى مثل على microfluidics ، microelectrodes ، وتحقيقات الميكانيكية. وهذا يوفر محفزات إضافية للخلايا من أجل تكرار أفضل الظروف الفسيولوجية المختلفة خلال التجريب والعمل في المستقبل وتركز على دراسة الآثار المترتبة على هذه التركيبات
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner And Vacuum Chamber | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-001 | |
| Inverted fluorescence and phase contrast microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Microscope stage top incubator | AmScope | Model TCS-100 | Modified to include an enclosure that supplies an appropriate atmosphere |
| Polystyrene Petri dish | VWR international | 25384-090 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy | Devcon Inc. | 2 ton clear epoxy #14310 | |
| Cell culture media | Various | Media follows standard formulations for cell type | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
References
- Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography. Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).
- Junkin, M., Wong, P. K. Probing cell migration in confined environments by plasma lithography. Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).
- Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides. Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).
- Langowski, B. A., Uhrich, K. E. Microscale Plasma-Initiated Patterning (μPIP). Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).
- Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks. Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Johansson, B. -L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth. Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).
- Murakami, T., Kuroda, S. -i, Osawa, Z. Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).
- Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion. , VSP. Utrecht, Netherlands. (1994).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).
- Song, M., Uhrich, K. R. Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations. Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).
- Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -J. Nrf2 promotes neuronal cell differentiation. Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).
- Ohl, A., Schroder, K. Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review. Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).
- van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions. Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).
- Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Schön, P., Figdor, C. G., Speller, S. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).
