Summary
एक बहुमुखी प्लाज्मा लिथोग्राफी तकनीक सेलुलर लगाव का मार्गदर्शन करने के लिए स्थिर सतह पैटर्न उत्पन्न करने के लिए विकसित किया गया है. इस तकनीक के लिए उन है कि प्राकृतिक ऊतकों की नकल है और कई अलग सेल प्रकार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया सहित सेल नेटवर्क बनाने के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
1. Patterning के लिए इस्तेमाल किया molds के निर्माण
- पैटर्न की संकल्पनात्मक डिजाइन. पैटर्न बनाया है जो सेल नेटवर्क के रूप में, नियंत्रण कक्ष से संपर्क करें, कोशिकाओं को अलग करने के लिए, प्राकृतिक संरचनाओं की नकल करने के लिए, या अन्यथा कोशिका आसंजन और स्थान गाइड की सेवा.
- कंप्यूटर एडेड डिजाइन या पैटर्न और photomask के सृजन के सीएडी आधारित रचना. AutoCAD जैसे सीएडी सॉफ्टवेयर, में वांछित पैटर्न बनाया है, और है तो एक photomask उत्पादन के लिए एक कंपनी के बाहर भेजा.
- गुरु पैटर्न का उत्पादन करने के लिए photolithography. ग्लास स्लाइड्स या तो एक पतली विरोध सकारात्मक या एक मोटी बनाया जा रहा संरचना के आकार पर निर्भर करता है है विरोध नकारात्मक के साथ नमूनों हैं. ग्लास स्लाइड्स कम सिलिकॉन wafers की तुलना में लागत मजबूत किया जा रहा है और उत्पादन जब नहीं तोड़ा बहुत धूल के रूप में अपने लाभ के लिए उपयोग किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, विवर्तन gratings के रूप में अन्य सुविधाजनक संरचनाओं मास्टर पैटर्न के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- नमूनों स्लाइड स्लाइड्स जो नमूनों नहीं किया गया है की एक ढेर करने के लिए जुड़ा हुआ है. सभी चरणों का एक स्वच्छ प्रवाह हुड के अंदर प्रदर्शन कर रहे हैं धूल को कम कर रहे हैं.
- मास्टर molds के निर्माण. थोड़ा स्लाइड के ढेर से भी बड़ा टिनफ़ोइल के एक कंटेनर polydimethylsiloxane की 30 ग्राम (PDMS) जो तब photolithographically नमूनों सतह पर डालते है एक प्रारंभिक मोल्ड बनाने पकड़ बनाया है. PDMS degassed है और एक को दो दिनों के लिए इलाज की अनुमति दी.
- एक बार ठीक PDMS मास्टर पैटर्न के बंद खुली है और अगले कदम के लिए एक साँचे में ढालना रूपों.
- भाग 2 epoxy (Devcon # 14,310 (6 ग्राम) के 6 ग्राम 1 मिनट के लिए मिलाया जाता है और तब मास्टर मोल्ड में डाला, degassed और इलाज की अनुमति दी Degassing epoxy जल्दी से किया जाना चाहिए (<8 मिनट) कई बुलबुले का उपयोग चक्र को तोड़ने. और epoxy सेट और बुलबुला हटाने से पहले यह केवल एक पतली परत का उपयोग असंभव हो जाता है बुलबुले को दूर 6 इस्तेमाल किया जी एक पतली परत है जो जल्दी बुलबुला हटाने की सुविधा का उत्पादन..
- एक घंटे के बाद, भाग 2 epoxy आंशिक रूप से और ठीक हो जाएगा और अधिक epoxy के लिए एक मोटा संरचना है जो बाद के चरणों में संभाल easer है का उत्पादन degassing के बिना शीर्ष पर जोड़ा जा सकता है है. epoxy तो एक से दो दिनों के लिए इलाज की अनुमति दी है.
- एक बार ठीक epoxy PDMS मास्टर मोल्ड से हटा दिया है और टेप epoxy मोल्ड के चारों ओर लपेटा जाता है के लिए एक कंटेनर के रूप में. एक काम ढालना तो epoxy मोल्ड पर PDMS डालने के लिये, PDMS degassing, और एक को दो दिनों के लिए इलाज के द्वारा बनाई गई है.
- एक बार ठीक काम कर मोल्ड बंद epoxy की खुली है और सफाई बनाए रखने के लिए संग्रहीत.
2. सतहों सेल मार्गदर्शन के लिए molds के साथ patterning
- काम मोल्ड के छोटे वर्गों बाहर काट रहे हैं और एक polystyrene पेट्री डिश पर रखा है. इन मोल्ड वर्गों के स्थानों को चिह्नित कर रहे हैं.
- एक तिपाई और छोटे वर्गों और काम ढालना और पेट्री डिश की सतह के बीच conformal संपर्क सुनिश्चित करने के लिए भारित से बनाई है. पकवान के नीचे देख कर अच्छा प्लेसमेंट मनाया जा सकता है.
- विधानसभा प्लाज्मा चैम्बर में रखा जाता है. प्लाज्मा उपचार शुरू 150 पा में जारी रखा 29.6 डब्ल्यू (अधिकतम शक्ति) पर 10 मिनट के लिए हवा प्लाज्मा का उपयोग.
- प्लाज्मा उपचार के बाद, मोल्ड और वजन आक्षेप हटा रहे हैं.
- पेट्री डिश पराबैंगनी प्रकाश के तहत जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर नसबंदी के 10 मिनट के लिए रखा गया है और वहाँ संग्रहीत जब तक कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त है.
3. कोशिकाओं के साथ सतहों सीडिंग
- एसएच SY5Y CRL-२,२६६ मानव Neuroblastoma या अन्य कोशिकाओं सेल प्रकार के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर सुसंस्कृत हैं.
- CRL एसएच SY5Y के संगम 2266 मानव Neuroblastoma कोशिकाओं नेत्रहीन नमूनों सतह पर बोने के पहले मापा जाता है.
- मानक सेल बंटवारे बाहर किया जाता है उनके पेट्री डिश की सतह से कोशिकाओं को हटाने के लिए.
- कोशिकाओं, एक बार मुक्त अस्थायी, नमूनों पेट्री डिश की सतह पर वांछित संगम जब नमूनों सतह पर रखा प्राप्त करने के लिए पतला किया जा रहा है के बाद वरीयता प्राप्त कर रहे हैं.
- कोशिकाओं को व्यवस्थित करते हैं और सतह को संलग्न करने के लिए अनुमति दी जाती है.
- नमूनों पेट्री डिश कई दिनों के लिए कई घंटे के लिए incubated है जबकि कोशिकाओं प्लाज्मा के द्वारा बनाई गई पैटर्न पर इकट्ठा.
- जब संवर्धन neuroblastoma कोशिकाओं, retinoic एसिड (10 सुक्ष्ममापी) दैनिक जोड़ा जाता है क्रम में कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए न्यूरॉन की तरह एक राज्य में अंतर है. retinoic एसिड के अलावा अंधेरे में किया जाता है.
- Retinoic एसिड दैनिक कई दिनों के लिए जोड़ा जाता है, जिसके बाद भेदभाव नमूदार हो जाएगा.
- मीडिया हर 3-4 दिनों की जगह है.
4. अवलोकन और विश्लेषण
- जीवित कोशिकाओं या वीडियो की छवियों आवधिक क्रम में समय पर सेल व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए लिया जाता है. रहते हैं छवियों के लिए, कोशिकाओं एक खुर्दबीन मंच शीर्ष इनक्यूबेटर है जो 37 डिग्री सेल्सियस, 100% नमी, और 5% सीओ 2 कोशिकाओं रहता है में रखा जाता है . कोशिकाओं को भी तय कर सकते हैं प्रतिदीप्ति के तहत अवलोकन के लिए दाग हो
5. प्रतिनिधि परिणाम:
प्लाज्मा लिथोग्राफी तकनीक लागू करने के एक ठेठ परिणाम कोशिकाओं जो कुछ मनमाने ढंग से या प्राकृतिक संरचना जैसा दिखता है एक पैटर्न के गठन है. यह 1a बी चित्रा जहां लाइनों और न्यूरॉन्स के नेटवर्क बनाया गया है में देखा जाता है. अन्य प्रकार की कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह के रूप में देखा -1 सी घ चित्रा, जो मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVEC) और C2C12 कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं ग्रिड बनाने से पता चलता है इस्तेमाल किया जा सकता है. पाली एल Lysine जैसे सामग्री भी चित्रा 1e नमूनों किया जा सकता है कुछ सेल प्रकार के और अन्य उपयोगों के लिए कुर्की की सुविधा . दिखाया न्यूरॉन्स के मामले में, क्या बनाया गया था कोशिकाओं है जो उन दोनों के बीच कनेक्शन है के नेटवर्क रहे हैं. यह प्रतिकृति क्या जहां मस्तिष्क न्यूरॉन्स पड़ोसी कोशिकाओं जो मस्तिष्क के ऑपरेशन को प्रभावित करती है के बीच असतत कनेक्शन है में स्वाभाविक रूप से होता है. प्रयोगशाला में एक ऐसी संरचना के निर्माण के साथ, संख्या, स्थिति, आवृत्ति, और कनेक्शन के अन्य कारकों को व्यवस्थित नियंत्रित किया जा सकता है. इन arraignments के परिणाम नेत्रहीन मापा जा सकता है और रासायनिक या बिजली की उत्तेजना के रूप में अतिरिक्त जानकारी के लिए नेटवर्क व्यवहार की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है.
एक नकारात्मक परिणाम एक ऊंचा हो या अधूरा पैटर्न या एक नमूना दूषित होगा. एक अधूरा या ऊंचा हो गया हुआ पैटर्न या तो भी या कुछ भी कई कोशिकाओं जो कक्षों की एक आदर्श राशि के साथ पैटर्न की आपूर्ति नहीं होता के साथ सब्सट्रेट बोने से नतीजा होगा. इसके अलावा, अगर पैटर्न सही ढंग से नहीं बनाया गया है (उदाहरण के लिए, लाइनों भी संकीर्ण) कोशिकाओं को देते हैं और उस पर सफलतापूर्वक विकसित करने में सक्षम नहीं हो जाएगा. एक दूषित नमूने के मामले में उचित सफाई एक कदम के दौरान बनाए रखा नहीं होगा, हालांकि इस दुर्लभ है, जब उचित सेल संस्कृति तथ्य यह है कि प्लाज्मा patterning भी सब्सट्रेट sterilizes के कारण प्रोटोकॉल के बाद.
चित्रा 1 कोशिकाओं और प्रोटीन के patterning.
Discussion
सेल जांच विधि यहाँ प्रस्तुत सक्षम बनाता है multicellular नेटवर्क है जो जैविक संरचनाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नकल के जटिल पैटर्न की रचना उत्तेजनाओं कि प्रकृति है जो तब दोनों समूहीकृत सेल व्यवहार और पर्यावरणीय कारकों के लिए एक सेल प्रतिक्रिया की जांच की सुविधा में subcellular कर रहे हैं के उत्पादन के लिए एक तरीका प्रदान करता है. इस विधि का प्रयोग सरल अभी तक मजबूत है के रूप में इसे जल्दी सेल संस्कृति के रूप में एक ही प्रयोगशाला में किया जा सकता है कम लागत के उपकरणों के साथ प्रदर्शन किया. यह भी दृढ़ता से सेल संवेदनशील है, परिणामी व्यवहार के आसान अवलोकन की अनुमति देता है और लंबे समय अवधि है, जो लंबी अवधि के सेल व्यवहार की जांच की अनुमति देता है लिए स्थिर स्वभाव से है. यह अतिरिक्त के रूप में यह कई प्रकार की कोशिकाओं के साथ संगत है और मनमाना पैटर्न बना सकते हैं प्रदर्शन किया जा प्रयोगों की एक विविध रेंज के लिए अनुमति देता है. तकनीक के दीर्घकालिक स्थिरता तथ्य यह है कि सतह functionalization प्लाज्मा द्वारा दिया सतह का हिस्सा है और एक कोटिंग या अन्य परत जो या हटाया जा सकता अपमानित नहीं है से निकला है. यदि तरल के तहत रखा है, इस प्रकार के संशोधन के महीनों के लिए अपने सेल मार्गदर्शन करने की क्षमता बनाए रखने कर सकते हैं.
मास्टर पैटर्न जो अंततः सेल मार्गदर्शन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा बनाने के सार्थक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक प्रयोग की सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है. यदि यह पैटर्न ठीक से नहीं बनाया गया है, कोशिकाओं उचित पैटर्न के लिए जवाब नहीं और उपयोगी व्यवहार का उत्पादन नहीं हो सकता है. पैरामीटर्स जैसे पंक्ति चौड़ाई, पैटर्न रिक्ति, और दूसरों को बहुत एक विशेष पैटर्न के साथ सेल संगतता को प्रभावित कर सकते हैं और आम तौर पर इस तरह के मापदंडों के एक रेंज डिजाइन के लिए सबसे उपयुक्त स्क्रीन करने के लिए प्रारंभिक photomask पर बनाया जा सकता है है.
अन्य महत्वपूर्ण पैरामीटर patterning के बाहर ले जाने से संबंधित ढालना निर्माण, एक धूल मुक्त वातावरण बनाए रखने, सेल बोने और सेल संस्कृति का सामान्य बाँझपन शामिल हैं. मोल्ड निर्माण विभिन्न हस्तांतरण कदम है जो दोहराया PDMS एक epoxy मोल्ड कास्टिंग के लिए अनुमति देने के लिए किए जाते हैं द्वारा प्रभावित हो सकता है. epoxy मोल्ड क्योंकि यह एक ही रास्ते में नहीं नीचा के रूप में एक छोटे, दोहराया कास्टिंग के तहत उच्च पहलू अनुपात संरचनाओं के साथ मोल्ड का विरोध करने के लिए बनाया है. यदि हस्तांतरण ढलाई सही ढंग से किया जाता है, आयाम और उपज लेकिन प्रभावित नहीं अगर इस तरह के रूप में गलत तरीके से खराब degassing, अधूरा इलाज, या अत्यधिक हीटिंग के द्वारा किया, बुलबुले, और एक पैटर्न का खुरदरापन विरूपण हो सकता है जो अंतिम परिणाम को प्रभावित करता है. एक धूल मुक्त वातावरण बनाए रखने के संबंध में, molds के रूप में संभव के रूप में साफ रखा जाना चाहिए है के रूप में किसी भी धूल काम PDMS मोल्ड और सतह और इस प्रकार उचित प्लाज्मा परिरक्षण और रासायनिक patterning के बीच उचित संपर्क के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं. कोशिकाओं के घनत्व बोने भी करने के लिए सुनिश्चित करें कि न तो भी या कुछ भी कई कोशिकाओं पैटर्न क्षेत्र में निवास के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए और बाँझपन के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है कोशिकाओं जीवाणु और अन्य संक्रमण से बचने के लिए बनाए रखा जाना चाहिए.
तकनीक भी जैसे microfluidics, microelectrodes, और यांत्रिक जांच अन्य तत्वों के साथ शामिल किया जा सकता है. यह कोशिकाओं को अतिरिक्त उत्तेजनाओं प्रदान करता है क्रम में करने के लिए बेहतर प्रयोग और भविष्य के काम के दौरान विभिन्न शारीरिक स्थितियों को दोहराने इन संयोजनों के प्रभाव का अध्ययन पर ध्यान केंद्रित है
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner And Vacuum Chamber | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-001 | |
| Inverted fluorescence and phase contrast microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Microscope stage top incubator | AmScope | Model TCS-100 | Modified to include an enclosure that supplies an appropriate atmosphere |
| Polystyrene Petri dish | VWR international | 25384-090 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy | Devcon Inc. | 2 ton clear epoxy #14310 | |
| Cell culture media | Various | Media follows standard formulations for cell type | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
References
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