Plasma Litografi Surface Mönstring för att skapa Cell Networks

Summary

En mångsidig plasma litografi tekniken har utvecklats för att generera stabil yta mönster för att vägleda cellulära fastsättning. Denna teknik kan användas för att skapa cellen nätverk inklusive de som efterliknar naturliga vävnader och har använts för att studera flera, olika celltyper.

Abstract

Systematisk manipulering av en cell mikromiljö med mikro-och nanoskala upplösning krävs ofta för att dechiffrera olika cellulära och molekylära fenomen. För att möta detta krav har vi utvecklat en teknik plasma litografi för att manipulera den cellulära mikromiljön genom att skapa en mönstrad yta med inslag storlekar från 100 nm till millimeter. Målet med denna teknik är att kunna studera på ett kontrollerat sätt, beteenden av enskilda celler och grupper av celler och deras interaktioner.

Denna plasma litografi Metoden bygger på selektiv modifiering av ytkemi på ett substrat genom skärmning kontakten med låga temperaturer plasma med en fysisk form. Denna selektiva skärmning ger en kemisk mönster som kan vägleda cellbindning och rörelse. Detta mönster eller yta mall kan sedan användas för att skapa nätverk av celler vars struktur kan efterlikna den som finns i naturen och ger en kontrollerbar miljö för experimentella undersökningar. Tekniken lämpar sig väl för att studera biologiska fenomen som det producerar stabil yta mönster på genomskinlig polymera substrat i ett biokompatibelt sätt. Ytan mönster pågå i veckor till månader och kan därmed vägleda samspel med celler för långa tidsperioder vilket underlättar studier av långsiktiga cellulära processer, såsom differentiering och anpassning. Ändringen till ytan är främst kemisk karaktär och därför inte införa topografiska eller fysisk störning för tolkning av resultaten. Det skall heller inte innebära några hårda eller giftiga ämnen för att uppnå mönstring och är kompatibel för vävnadsodling. Dessutom kan det användas för att ändra olika typer av polymera substrat, som på grund av möjligheten att ställa sina egenskaper är idealiska för och används ofta i biologiska tillämpningar. Upplösningen kan uppnås är också fördelaktigt, eftersom isolering av specifika processer som migration, vidhäftning, eller bindande möjliggör diskret, tydliga observationer på singel till Multicell nivå.

Denna metod har använts för att bilda olika nätverk av olika celltyper för utredningar innefattar migration, signalering, vävnad bildning och beteende och interaktioner mellan nervceller svars i ett nätverk.

Protocol

1. Skapande av formar som används för mönstring

1. Konceptuell design av mönster. Mönster skapas som tjänar till att bilda celler nätverk, kontakta kontroll cell, isolera celler, härma naturliga strukturer eller på annat sätt styra cell adhesion och placering.
2. Datorstödd design eller CAD baserat skapande av mönster och skapande av fotomasker. Det önskade mönstret är designad i CAD-program, såsom AutoCAD, och skickas sedan till ett utomstående företag för att producera en fotomask.
3. Fotolitografi att producera bemästra mönster. Glas bilder är mönstrade med antingen en tunn positiv motstå eller en tjock negativ motstå beroende på storleken av strukturen som skapas. Glas bilder används för att fördelarna med att vara låg kostnad, starkare än kiselskivor och inte producerar så mycket damm när bruten. Alternativt kan andra praktiska strukturer såsom diffraktion galler kan användas som master mönster.
4. Den mönstrade bilden är ansluten till en bunt bilder som inte har mönstrade. Alla steg utförs i en ren flöde huva för att minimera damm.
5. Skapande av mästare formar. En container med aluminiumfolie något större än stacken av bilder är skapad för att hålla 30 g Polydimetylsiloxan (PDMS), som sedan hälls över photolithographically mönstrad yta för att skapa en inledande mögel. Den PDMS avgasas och får härda i en till två dagar.
6. När härdat PDMS är skalade bort av befälhavaren mönstret och bildar en form för nästa steg.
7. 6 g 2 del epoxy (Devcon # 14.310 (6 g) blandas i 1 minut och sedan hälls i master mögel, avgasade och tillåtas härda. Avgasning epoxin måste ske snabbt (<8 min) med hjälp av många bubbla bryta cykler och med endast ett tunt lager innan epoxin apparater och bubbla bort blir omöjligt att få bort bubblorna. Den 6 g som används ger ett tunt skikt som underlättar snabb bubbla bort.
8. Efter en timme kommer det 2 delen epoxi delvis härdad och mer epoxi kan läggas ovanpå utan avgasning att producera en tjockare struktur som är easer att hantera i senare steg. Epoxin får sedan härda i en till två dagar.
9. Härdat är epoxin bort från PDMS mästare mögel och tejpen rullas runt epoxi mögel att bilda en behållare. En arbetsgrupp mögel skapas sedan genom att hälla PDMS på epoxi mögel, avgasning av PDMS, och härdning för en till två dagar.
10. Härdat är de arbetande mögel skalade bort av epoxi och lagras för att upprätthålla renlighet.

2. Mönstring av ytor med formar för cell vägledning

1. Små delar av arbetarklassen mögel skärs ut och placeras på ett polystyren petriskål. Platserna för dessa mögel sektioner är märkta.
2. Ett stativ bildas från små avsnitt och viktas för att säkerställa konform kontakt mellan arbetar mögel och petriskålen ytan. Bra placering kan observeras genom att titta på botten av skålen.
3. Monteringen är placerad i plasma kammaren. Plasma behandling initieras och fortsättas på 150 Pa vid 29,6 W (max effekt) i 10 minuter med tryckluft plasma.
4. Efter plasma-behandlingen, är mögel och vikt neka bort.
5. Petriskålen placeras under UV-ljus i 10 minuter av sterilisering inuti biosäkerhet skåpet och förvaras där tills ympats med celler.

3. Seedning ytor med celler

1. SH-SY5Y CRL-2266 Mänskliga Neuroblastom eller andra celler odlas med hjälp av standardprotokoll för den celltyp.
2. Sammanflödet av SH-SY5Y CRL-2266 är Mänskliga Neuroblastom celler mäts visuellt före sådd på mönstrad yta.
3. Standard cell uppdelningen sker för att avlägsna celler från ytan av sin petriskål.
4. Cellerna, en gång fritt flytande, är seedade på ytan av det mönstrade petriskålens efter utspädning för att uppnå önskad sammanflödet när den placeras på mönstrad yta.
5. Cellerna får bosätta sig och fästa till ytan.
6. Den mönstrade petriskål inkuberas i flera timmar till flera dagar, medan de celler som samlas in på det mönster som skapats av plasma.
7. Vid odling av neuroblastom celler, retinoinsyra (10 mikroM) läggs dagligen för att förmå cellerna differentieras till en neuron-liknande tillstånd. Tillägget av retinoinsyra sker i mörker.
8. Retinoinsyra läggs dagligen i flera dagar, varefter differentiering kommer att observeras.
9. Media byts var 3-4 dagar.

4. Observation och analys

1. Periodiska bilder av levande celler eller videor tas för att observera cellens beteende över tid. För levande bilder, är de celler som placeras i ett mikroskop skede topp inkubator som håller cellerna vid 37 ° C, 100% luftfuktighet och 5% CO _2. Celler kan också vara fast och färgas för observation i fluorescens

5. Representativa resultat:

En typisk följd av genomförandet av tekniken plasma litografi är bildandet av ett mönster av celler som liknar någon godtycklig eller naturliga struktur. Detta syns i Figur 1a-b där linjer och nätverk av nervceller har skapats. Andra celltyper kan användas såväl som visas i Figur 1c-d, som visar mänskliga navelsträngen ven endotelceller (HUVEC) och C2C12 skelett muskelceller bildar galler. Material som poly-L-lysin kan också vara mönstrade, Figur 1e för att underlätta fastsättning av vissa celltyper och för andra ändamål. I fallet som visas nervceller, vad skapades är nätverk av celler som har kopplingar mellan dem. Detta är samma vad som sker naturligt i hjärnan där nervceller har diskreta kopplingar mellan angränsande celler som påverkar driften av hjärnan. Med skapandet av en sådan struktur i labbet, kan antal, placering, frekvens och andra faktorer av anslutningarna systematiskt kontrolleras. Resultatet av dessa arraignments kan mätas visuellt och extra ingångar som kemisk eller elektrisk stimulering kan genomföras för att undersöka nätverket beteende.

Ett negativt resultat skulle vara en igenväxt eller ofullständiga mönster eller ett förorenat prov. En ofullständig eller igenvuxen mönster skulle bli följden av seedning underlaget med antingen för få eller för många celler som inte skulle leverera mönstret med en idealisk mängd celler. Dessutom, om mönstret inte är konstruerad på rätt sätt (t.ex. linjer för smal) cellerna inte kommer att kunna fästa och växa med framgång på den. Vid ett förorenat prov, skulle väl renlighet inte ha varit aktiv under ett av stegen men detta är sällsynt då följande korrekt protokoll cellodling beror på att plasma mönster också steriliserar substratet.

Figur 1. Mönstring av celler och protein.

Discussion

Cellen undersökningsmetod presenteras här möjliggör skapandet av komplexa mönster av flercelliga nätverk som efterliknar biologiska strukturer samt erbjuder en metod att producera stimuli som subcellulära i naturen som då underlättar undersökningar av både grupperade cellens beteende och enkla svar cell till miljöfaktorer. Användningen av denna metod är enkel men robust som det kan vara snabbt utföras med låg kostnad utrustning i samma labb som cellkultur. Det är också starkt cell känsliga, gör det lätt att observation av den resulterande beteende och är till sin natur stabil under långa tidsperioder, vilket möjliggör undersökningar av långsiktiga cellens beteende. Det möjliggör dessutom för en rad olika experiment som ska utföras eftersom det är kompatibelt med många celltyper och kan skapa godtyckligt mönster. Den långsiktiga stabiliteten i den teknik som härrör från det faktum att ytan funktionalisering förmedlas av plasma är en del av ytan och är inte en beläggning eller andra skikt som kan tas bort eller försämras. Om hållas under vätska, kan denna typ av modifiering behålla sin cell vägledande förmåga i månader.

Den mest kritiska delen av experimentet nödvändigt för att säkerställa meningsfulla resultat är att skapa befälhavaren mönster som i slutändan kommer att användas för cell vägledning. Om detta mönster inte är korrekt utformad, kommer cellerna inte lämpligt sätt mönstret och får inte producera användbara beteende. Parametrar som linjebredd, mönster avstånd, och andra kan kraftigt påverka cellen kompatibilitet med ett visst mönster, och oftast ett antal sådana parametrar kan skapas på den första fotomasker till skärmen för lämplig utformning.

Andra viktiga parametrar att genomföra mönstring innehålla mögel skapa, upprätthålla en dammfri miljö, cell sådd och allmänna sterilitet i cellkultur. Mögel skapande kan ske genom olika överföringen åtgärder som vidtas för att möjliggöra upprepade PDMS kastar loss en epoxi mögel. Epoxin mögel skapas eftersom det inte kommer brytas ned i samma sätt som en motstå mögel med små, höga strukturer bildformat under upprepade gjutning. Om överföringen gjutning görs korrekt kommer mått och avkastningen inte påverkas, men om det görs på fel sätt, t.ex. genom dåligt avgasning, ofullständig härdning, eller överdriven värme, kan bubblor, ojämnheter och deformering av ett mönster uppstå som påverkar slutresultatet. I förhållande till att upprätthålla en dammfri miljö måste formarna hållas så rena som möjligt eftersom damm kan störa kontakten mellan de arbetande PDMS mögel och ytan och därmed korrekt plasma-skärmar och kemiska mönster. Den sådd densitet celler måste också vara optimerad för att säkerställa att varken för få eller för många celler lever mönstret området och sterilitet måste upprätthållas för att undvika bakterier och andra föroreningar i cellerna som används.

Tekniken kan även integreras med andra faktorer såsom mikrofluidik, microelectrodes och mekaniska givare. Detta ger ytterligare stimulans till cellerna för att bättre kunna replikera olika fysiologiska förhållanden under experiment och framtida arbete är fokuserat på att studera effekterna av dessa kombinationer