Summary
Çok yönlü bir plazma litografi tekniği hücresel eklenti rehberlik için sabit bir yüzey desenleri oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu teknik, doğal dokuları taklit eden ve birçok farklı hücre tiplerinde eğitim için kullanılır olmuştur da dahil olmak üzere hücre ağları oluşturmak için uygulanabilir.
Abstract
Mikro ve nano ölçekli çözünürlüğe sahip bir hücre mikroçevresinin Sistematik manipülasyonu genellikle çeşitli hücresel ve moleküler olaylar deşifreleme için gereklidir. Bu gereksinimi karşılamak için, biz, 100 nm milimetre arasında değişen özelliği boyutları ile desenli bir yüzey oluşturarak hücresel mikroçevresinin işlemek için bir plazma litografi tekniği geliştirdik. Bu tekniğin amacı, kontrollü bir şekilde çalışma yapabilmek için, tek tek hücrelerin davranışları yanı sıra, hücreler ve onların etkileşimleri grupları.
Bu plazma litografi yöntemi, yüzey kimyası, fiziksel bir kalıp ile düşük ısılı plazma temas koruyucu yoluyla bir substrat üzerindeki seçici değişiklik dayanmaktadır. Bu seçici koruyucu hücre eki ve hareket kılavuzu kimyasal bir desen bırakır. Bu desen veya yüzey şablon, daha sonra yapısı, doğada bulunan taklit ve deneysel araştırmalar için kontrollü bir ortamda üreten hücreleri ağları oluşturmak için kullanılan olabilir. Biyouyumlu bir şekilde şeffaf polimer yüzeylerde sabit bir yüzey desenleri tekniği de biyolojik bir fenomen eğitim için uygundur. Haftalar veya aylar için son ve yüzey desenleri, böylece hücreleri, farklılaşma ve adaptasyon gibi hücresel süreçleri, uzun vadeli çalışma kolaylaştırır uzun süreler için etkileşim rehberlik eder. Yüzeye değişiklik doğa öncelikle kimyasal ve böylece sonuçların yorumlanması için topografik ya da fiziksel bir girişim tanıtmak değildir. Ayrıca desenlendirme elde etmek için herhangi bir sert veya toksik maddeler içerir ve doku kültürü ile uyumlu değildir. Ayrıca, çeşitli türleri için idealdir ve yeteneği kendi özellikleri ayarlamak için nedeniyle biyolojik uygulamalarında yaygın olarak kullanılan polimerik malzeme, değiştirmek için uygulanabilir. , Göç, yapışma, ve ciltleme gibi belirli süreçleri yalıtılmış, tek ve çok hücreli seviyesine ayrık, açık gözlemler sağlar ulaşılabilir çözünürlük, aynı zamanda faydalıdır.
Bu yöntem, göç, sinyalizasyon, doku oluşumu ve nöron davranış ve etkileşimleri bir ağ içinde çıkarılmalıdır ilgili araştırmalar için farklı hücre tipleri farklı ağları oluşturmak için istihdam edilmiştir.
Protocol
1. Desenlendirme için kullanılan kalıpların oluşturulması
- Kavramsal tasarım desen. Desenler, cep telefonu şebekelerini kontrol hücre temas kurma hücrelerin izole, doğal yapıları taklit ya da başka hücre adezyon ve yerleştirme kılavuzu hizmet hangi oluşturulur.
- Bilgisayar destekli, desen ve photomask oluşturulması tasarım veya CAD tabanlı oluşturma. Istenilen desen CAD yazılımı, AutoCAD gibi tasarlanmış olup, sonra bir photomask üretmek için dışarıdan bir şirkete gönderilir.
- Ana desen üretmek için Fotolitografi. Cam slaytları ya karşı ince bir olumlu ya da kalın oluşturulan yapının büyüklüğüne bağlı olarak karşı bir negatif desenli. Cam slaytlar silikon gofret daha güçlü düşük maliyetli ve kırıldığı zaman kadar çok toz üreten kendi yararları için kullanılır. Alternatif olarak, kırınım ızgaralar gibi diğer kullanışlı yapılar ana desen olarak kullanılabilir.
- Desenli slayt slaytlar desenli edilmiş bir yığına eklenir. Tüm adımları toz en aza indirmek için temiz bir akış kaput içinde yapılır.
- Ana kalıpların oluşturulması. Kalay slayt yığınını biraz daha büyük bir konteyner sonra ilk bir kalıp oluşturmak için photolithographically desenli yüzey üzerine dökülür polidimetilsiloksan 30 g (PDMS) tutmak için oluşturulur. PDMS gazlar ve 1-2 gün boyunca tedavi etmek için izin verilir.
- Kürünü PDMS ana desen sıyrılır ve bir sonraki adım için bir kalıp oluşturur.
- 6 g 2 bileşenli epoksi (Devcon # 14310 (6 g) 1 dakika karıştırılır ve sonra gazlar, ana kalıp içine dökülür ve kuruması. Epoksi döngülerini kırarak birçok kabarcık kullanarak hızlı bir şekilde yapılmalıdır (8 dk) Gaz Giderme ve daha önce sadece ince bir tabaka kullanılarak epoksi setleri ve kabarcık kaldırma kabarcıklarını çıkarmak için imkansız hale gelir. kullanılan 6 g hızlı kabarcık çıkarılmasına olanak ince bir tabaka oluşturur.
- Bir saat sonra, 2 bileşenli epoksi kısmen tedavi edilebilir ve daha fazla epoksi sonraki adımları ele easer kalın bir yapı üretmek için gaz alma üstüne eklenebilir. Epoksi sonra 1-2 gün boyunca tedavi etmek için izin verilir.
- Sertleştikten sonra, epoksi PDMS ana kalıp çıkarılır ve bant epoksi kalıp bir kap formu sarılı. Bir çalışma kalıp sonra, epoksi kalıp üzerine PDMS dökme gaz alma PDMS, 1-2 gün boyunca kür tarafından oluşturulur.
- Kürünü çalışma kalıp epoksi sıyrılır ve temizliğini korumak için saklanır.
2. Hücre rehberlik için kalıp yüzeyleri, Desenlendirme
- Çalışma kalıp Küçük bölümleri kesip ve polistiren Petri kabı üzerine yerleştirilir. Bu kalıp bölümlerinin yerleri etiketlenir.
- Bir tripod, küçük bölümler ve konformal çalışma kalıp ve Petri kabı yüzeyi arasında temas sağlamak için ağırlıklı oluşur. İyi yerleştirme çanak alt bakarak görülebilir.
- Montaj, plazma odasına yerleştirilir. Plazma tedavisi hava plazma ile 10 dakika 29.6 W (maksimum güç) 150 Pa başlatılan ve devam edilir.
- Plazma tedaviden sonra, kalıp ve ağırlık arraignment kaldırılır.
- Petri kabı biyogüvenlik kabini içinde 10 dakika sterilizasyon için UV ışığı altında yerleştirilir ve hücreleri ile seribaşı kadar orada saklanır.
3. Hücreleri ile yüzeyler Seeding
- SH-SY5Y CRL-2266 İnsan Nöroblastom veya diğer hücreleri hücre tipi için standart protokolleri kullanarak kültür.
- SH-SY5Y izdiham CRL-2266 İnsan Nöroblastom hücreleri desenli yüzeye ekim önce görsel olarak ölçülür.
- Standart hücre bölünmesi, kendi Petri çanak yüzeyinden hücreleri çıkarmak için yapılmaktadır.
- Hücreleri, bir kez serbest dalgalı desenli yüzey üzerine yerleştirildiği zaman istenilen izdiham ulaşmak için seyreltilmiş sonra desenli Petri kabı yüzeyine numaralı seribaşı.
- Hücrelerini yerleşmek ve yüzey eklemek için izin verilir.
- Hücreleri, plazma tarafından oluşturulan desen üzerine monte ederken desenli Petri kabı birkaç gün birkaç saat inkübe edilir.
- Kültür nöroblastoma hücreleri, retinoik asit (10 mcM), bir nöron gibi devlet içine ayırt etmek için hücre ikna etmek amacıyla günlük olarak eklenir. Retinoik asit Ayrıca karanlıkta yapılır.
- Retinoik asit, farklılaşma gözlemlenebilir bundan sonra, birkaç gün boyunca her gün eklenir.
- Medya, her 3-4 günde bir değiştirilir.
4. Gözlem ve Analiz
- Canlı hücreleri veya videolar Periyodik görüntüleri zaman içinde hücre davranışı gözlemlemek için alınır. Canlı görüntüler için, hücreler 37 ° C,% 100 nem ve% 5 CO 2 hücreleri tutan bir mikroskop aşamasında üst inkübatör yerleştirilir. Hücreler aynı zamanda floresan altında gözlem için sabit ve lekeli olmak
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Plazma litografi tekniği uygulayan tipik bir sonucu bazı keyfi veya doğal yapısı benzeyen hücreler bir desen oluşumu. Bu nöronların hatları ve şebekeleri oluşturulmuştur Şekil 1a-b görülür. Diğer hücre tiplerinin yanı sıra İnsan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVEC) ve ızgaraları oluşturan C2C12 iskelet kas hücreleri gösteren Şekil 1c-d 'de görüldüğü gibi kullanılabilir. Ayrıca, poli-L-lisin gibi malzemeler, bazı hücre tiplerinin ve diğer kullanımlar için takılmasını kolaylaştıracak şekilde, Şekil 1e desenli olabilir . Nöronların gösterildiği durumda, bunlar arasındaki bağlantıları hücre ağları oluşturuldu. Bu nöronlar, beynin işleyişini etkileyen komşu hücreler arasında ayrık bağlantıları var beyin doğal olarak gerçekleşir ne çoğaltır. Laboratuvar böyle bir yapının oluşturulması ile, sayı, konum, sıklık ve bağlantıların diğer faktörlerin sistematik olarak kontrol edilebilir. Bu arraignments sonucu görsel olarak ölçülebilir ve kimyasal veya elektriksel stimülasyon gibi ek girdiler ağ davranış prob için uygulanabilir.
Negatif bir sonuç, aşırı büyümüş ya da eksik desen veya kontamine örnek olacaktır. Bir eksik veya büyümüş desen desen ideal miktarda hücre kaynağı olmaz ya çok az ya da çok fazla hücre yüzey ekim neden olacaktır. Ayrıca, desen doğru değilse (örneğin, çok dar) hücreleri eklemek ve başarılı bir şekilde büyümek mümkün olmaz. Plazma desenlendirme de yüzey sterilize gerçeği nedeniyle uygun hücre kültürü protokolü bu nadir olmasına rağmen, kirlenmiş bir örnek durumda, uygun temizlik adımlardan biri sırasında muhafaza edilmiş olmaz.
Şekil 1 hücreleri ve protein Desenlendirme.
Discussion
Burada sunulan hücre soruşturma yöntemi karmaşık desenleri gibi biyolojik yapıları taklit çok hücreli ağlarının oluşturulması, sonra gruplandırılmış hücre davranış ve çevresel faktörler tek hücre yanıtlarını soruşturma kolaylaştırır doğa Subselüler. Uyaranlara üretmek için bir yöntem sağlar sağlar. Bu yöntemin kullanımı hızla hücre kültürü ile aynı laboratuarda düşük maliyetli ekipman ile yapılabilir gibi basit ama güçlü. Bu, aynı zamanda güçlü bir hücre duyarlı ortaya çıkan davranış kolay gözlem sağlar ve uzun süreli hücre davranışının araştırılması, uzun süreler için, kararlı doğası gereğidir. Bu ek olarak, birçok hücre tipleri ile uyumlu ve keyfi desenleri oluşturmak yapılacak deneyler çeşitli sağlar. Tekniğin uzun vadeli istikrar, plazma ile aktarılırdı yüzey işlevsellik yüzey parçası ve kaldırılmış veya bozulmuş olabilir bir kaplama veya diğer katman olmadığı gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Sıvı altında tutulması halinde, bu tür modifikasyon ay boyunca cep rehberlik yeteneğini koruyabilirsiniz.
Deney anlamlı sonuçlar sağlanması için gerekli en önemli parçası, sonuçta hücre rehberlik için kullanılacak ana desen yaratma olmasıdır. Bu desen uygun bir şekilde tasarlanmış değilse, hücreler uygun desen yanıt vermiyor ve faydalı bir davranış üretmek olmayabilir. Gibi çizgi genişliği, desen aralığı ve diğerleri gibi parametreler belirli bir deseni ile hücre uyumluluk büyük ölçüde etkileyebilir ve genellikle bir dizi bu parametrelerin en uygun tasarım için ekrana ilk photomask oluşturulabilir.
Desenlendirme dışarı taşıma ile ilgili diğer önemli parametreler kalıp oluşturma, tozsuz bir ortamda muhafaza, hücre tohumlama ve hücre kültürü genel kısırlık içerir. Kalıp oluşturma PDMS epoksi kalıp döküm tekrarlanan için izin yapılmaktadır çeşitli transfer adımlarla etkilenmiş olabilir. Tekrarlanan döküm altında küçük, yüksek en-boy oranı yapıları kalıp karşı aynı şekilde kaybetmez, çünkü epoksi kalıp oluşturulur. Transfer kalıplama doğru yapılırsa, boyutları ve verim etkilenebilir ama kötü gaz giderme, eksik kür veya aşırı ısıtma gibi yanlış yapılırsa, bir desen kabarcıklar, pürüzlülük ve deformasyon nihai sonucu etkiler oluşabilir. Tozsuz bir ortamda sürdürülmesi ile ilgili olarak, herhangi bir toz çalışma PDMS kalıp ve yüzey ve böylece uygun plazma koruyucu ve kimyasal desenlendirme arasındaki iletişim ile müdahale gibi kalıpları mümkün olduğunca temiz tutulması gerekir. Hücrelerin ekim yoğunluğu da, ne çok az ya da çok fazla hücre desen alanında yaşayan olmasını sağlamak için optimize olmalıdır ve kısırlık kullanılmakta olan hücreler, bakteri ve diğer kirlenmesini önlemek amacıyla sağlanmalıdır.
Teknik Mikroakiskan, Mikroelektronlar ve mekanik problar gibi diğer unsurları da dahil edilebilir. Bu, bu kombinasyonlarının etkilerini inceleyerek odaklanmış daha iyi deneyler ve gelecekteki çalışmaları sırasında çeşitli fizyolojik şartlar çoğaltmak için hücrelere ek uyaranlar sağlar
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasma Cleaner And Vacuum Chamber | Harrick Scientific Products, Inc. | PDC-001 | |
| Inverted fluorescence and phase contrast microscope | Nikon Instruments | TE2000-U | |
| Microscope stage top incubator | AmScope | Model TCS-100 | Modified to include an enclosure that supplies an appropriate atmosphere |
| Polystyrene Petri dish | VWR international | 25384-090 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Epoxy | Devcon Inc. | 2 ton clear epoxy #14310 | |
| Cell culture media | Various | Media follows standard formulations for cell type | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 |
References
- Junkin, M., Watson, J., Vande Geest, J. P., Wong, P. K. Template-Guided Self-Assembly of Colloidal Quantum Dots Using Plasma Lithography. Adv Mater. 21, 1247-1251 (2009).
- Junkin, M., Wong, P. K. Probing cell migration in confined environments by plasma lithography. Biomaterials. 32, 1848-1855 (2011).
- Keyes, J., Junkin, M., Cappello, J., Wu, X., Wong, P. K. Evaporation-induced assembly of biomimetic polypeptides. Appl Phys Lett. 93, 023120-023 (2008).
- Langowski, B. A., Uhrich, K. E. Microscale Plasma-Initiated Patterning (μPIP). Langmuir. 21, 10509-10514 (2005).
- Tourovskaia, A., Barber, T., Wickes, B. T., Hirdes, D., Grin, B., Castner, D. G. Micropatterns of Chemisorbed Cell Adhesion-Repellent Films Using Oxygen Plasma Etching and Elastomeric Masks. Langmuir. 19, 4754-4764 (2003).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Johansson, B. -L., Larsson, A., Ocklind, A., Ohrlund, A. Characterization of Air Plasma-Treated Polymer Surfaces by ESCA and Contact Angle Measurements for Optimization of Surface Stability and Cell Growth. Journal of Applied Polymer Science. 86, 26185-26185 (2002).
- Murakami, T., Kuroda, S. -i, Osawa, Z. Dynamics of Polymeric Solid Surfaces Treated with Oxygen Plasma: Effect of Aging Media after Plasma Treatment. Journal of Colloid and Interface Science. 202, 37-44 (1998).
- Strobel, M., Lyons, C. S., Mittal, K. L. Plasma surface modification of polymers: Relevance to adhesion. , VSP. Utrecht, Netherlands. (1994).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Annual Review of Materials Science. 37, 550-575 (1998).
- Song, M., Uhrich, K. R. Optimal Micropattern Dimensions Enhance Neurite Outgrowth Rates, Lengths, and Orientations. Annals of Biomedical Engineering. 35, 1812-1820 (2007).
- Zhao, F., Wu, T., Lau, A., Jiang, T., Huang, Z., Wang, X. -J. Nrf2 promotes neuronal cell differentiation. Free Radical Biology and Medicine. 47, 867-879 (2009).
- Ohl, A., Schroder, K. Plasma-induced chemical micropatterning for cell culturing applications: a brief review. Surface and Coatings Technology. 116-119, 820-830 (1999).
- van Kooten, T. G., Spijker, H. T., Busscher, H. J. Plasma-treated polystyrene surfaces: model surfaces for studying cell-biomaterial interactions. Biomaterials. 25, 1735-1747 (2004).
- Loesberg, W. A., te Riet, J., van Delft, F., Schön, P., Figdor, C. G., Speller, S. The threshold at which substrate nanogroove dimensions may influence fibroblast alignment and adhesion. Biomaterials. 28, 3944-3951 (2007).
