Summary
我々はサルモネラ血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、およびネズミチフス菌の迅速検出のためのマルチプレックスPCRを説明します。特定のサルモネラの血清型は、特定の血清型のO -抗原の生合成クラスターとフラジェリンに固有の遺伝子との配列とPCRマルチプレックスを標的とすることで識別できます。血清型は、ターゲットの対立遺伝子に対応する固有の、大きさのアンプリコン（PCR産物）の外観に基づいて、分離株のサルモネラにして割り当てられています。
Abstract
この属に特有のサルモネラの標的遺伝子を同定するための現在の商業的なPCRのテスト。しかし、そこに二つの種六亜種、2,500以上の異なるサルモネラの血清型があり、すべてではないが、公衆衛生への重要性に等しい。例えば、S.を見つけるテーブルの卵の層のファーム上にenterica亜種 IIIaのアリゾナ州は、S.の分離に比べて重要ではありませんenterica亜種I血清型Enteritidisは、テーブルの卵の消費量にリンクされているサルモネラ症の主要原因。血清型は、抗原リポ多糖の違い（LPS）（O抗原）とフラジェリン（H1とH2抗原）に基づいて識別されます。これらの抗原性の違いは、この表現型に関連付けられている遺伝子と遺伝子の対立遺伝子の多様性の外観です。
我々は、4つの主要S.間の遺伝的差異のキーというアレロタイプ化、マルチプレックスPCRを開発しているenterica亜種私血清型は家禽で発見し、米国における重要なヒトの疾患に関連付けられている。 PCRのプライマーペアは、特定のサルモネラの血清型に固有の鍵となる遺伝子またはシーケンスを対象に、その遺伝子または対立遺伝子の特定のサイズのアンプリコンを生成するように設計。 サルモネラ血清型は、特定のLPSのためのPCR検査の結果の組み合わせに基づいて分離するために割り当てられていたとフラジェリン遺伝子の対立遺伝子。この資料に記載されている多重PCRはS.の検出のための固有のものですenterica亜種I血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌。
ここでは、分離サルモネラについては血清型を識別するマルチプレックスPCRを使用する方法を示します。
Protocol
1。 PCRテンプレートの調製
注：）1）テンプレート（DNA）準備、2 PCRのセットアップ、および3）ゲル電気泳動：PCRキャリーオーバーコンタミネーションを最小限にするためには、それはPCR互いに物理的に別のいくつかの重要なキーステップを保つことが重要です。また、ピペッターの文化や試薬の汚染を防ぐために障壁のヒントを使用することをお勧めします。
- 単一の孤立したコロニーから分離サルモネラとルリアベルターニ培養液または他の複合培地（ブレインハートインフュージョン、Superbroth、等）の1mlを接種する。 37℃で一晩培養液を、Cを
- 滅菌済み、1.5 mlの容量のマイクロチューブに1 mlを、約2分間4500 × gで細菌の細胞懸濁液を遠心してください。細胞をペレット化する。
- 上清をデカントでは、10分間室温で100％エタノールとセットの1mlで細胞ペレットを再懸濁します。以前のように、細胞をペレット化する（4,500 × gで、2分。）、1mlのPBSで上清と再懸セルを削除する。
- 遠心細胞は（4,500 × gで、2分。）、無菌のdH 2 Oを1mlの上清と再懸セルを廃棄
- -20のdH 2 O（5μl/95液のdH 2 O）と店舗℃で、最終的な細胞懸濁液1 / 20希釈する-20℃でPCRの鋳型として全細胞の貯蔵寿命は約1ヶ月です。
2。 PCRセットアップ
注：PCR反応ミックスの調製と調剤（テンプレート、バッファ、oligonucletoideprimers、ヌクレオチドおよびTaq DNAポリメラーゼ）は、PCR / UVワークステーションに専用の、好ましくは行わ物理的に別々の部屋で実行する必要があります。
注：PCRは、部屋もPCR試薬（緩衝液、オリゴヌクレオチドプライマー、及びヌクレオチド）、酵素とテンプレート、PCRのセットアップに設定された専用のピペッターの保管用に指定された-20℃フリーザー、使い捨てのゴム手袋で自己完結型である必要があります設定、白衣、バリアのヒント、マイクロタイタープレート、ガラスキャピラリー、マイクロチューブ、および除染面の10％の漂白剤。 PCRの試薬を分注するために、専用のピペッターセット（P10、P100、およびP1000）を使用してください。このピペットセットには、セットアップのワークステーションを離れることは、ありません。
注意：分子生物学またはPCRグレードのdH 2 O、アリコートを1.5 ml容量の遠心チューブに1 mlを取得。交差汚染をできるだけ回避するために、各使用後は小分けのdH 2 Oを分注する。同様のアプローチは、他のPCR試薬とを推奨します。
注意：UV照射及び/又は10％漂白剤で表面を拭くと、使用前にワークエリアを除染。 PCRのセットアップを実行する際に白衣とゴム手袋を着用してください。前後にPCRからのトラフィックを最小限に抑えるためのPCR反応をthermocylcerとPCR産物（アンプリコン）アガロースゲル上で分離されている中でインキュベートされている領域にセットアップ。あなたがPCRのセットアップエリアに戻っている場合、あなたが現在着用し、手袋の新しいペアに置かれているラテックス手袋処分する。
- 5 × 10 -4 Mの濃度にのdH 2 Oでマスタープライマーの在庫を確認1月20日のdH 2 O（; 25μM5μl/95液のdH 2 O）のプライマーを希釈する。各フラジェリンタイピングプライマー用オリゴヌクレオチド配列は、表1に記載されています。
- -20℃の冷凍庫からPCRの試薬およびテンプレートを取得し、試薬とサンプルが氷上で解凍することができます。必要になるまで冷凍庫にTaq DNAポリメラーゼを残す。
- 表1に示すようにアレロタイプ化PCR反応ミックスのための試薬を分注する。
- 列（例えばA1）の上部から始まり、次の先頭に列を下に移動し、滅菌、96ウェル、ポリスチレンマイクロタイタープレートで10丸底の各ウエルに、PCR反応ミックスの9μlを分注する。
- ポジティブコントロールのテンプレート（I / G、Mタイピングプライマー-ネズミチフス菌及びサルモネラの0.5μl、最初のウェル（A1）にPCRミックスを9μL（無DNAの制御）へのdH 2 Oを1μlを追加します。r/z10タイピングプライマー-ハイデルベルクとハダル、及び1,2 / E、N、Xタイピングプライマー-ネズミチフス菌とハダル）も2回目のPCRミックス（B1）9μlに、および大腸菌の1μLにK12DH5α第3のウェルにPCRミックスを9mlの（C1）。
- 各追加も（D1 - H1、A2、B2）の場合は、PCR反応ミックス中、第9μlに解凍したサンプルテンプレートを1μl加える。 I / G、Mアレロタイプ化PCR、S.用enterica血清型ネズミチフス菌（i）とEnteritidisは（G、M）はポジティブコントロールとして機能し、 サルモネラ血清型ハイデルベルク（R）とハダル（Z10）はR / Z 10アレロタイプ化マルチプレックスPCRのポジティブコントロールです。
- アイダホテクノロジーRapidcycler（8）の指定ホルダーに10μlの容量ガラスキャピラリーを置きます。
- かつてホルダーに固定、にキャピラリーに触れてPCR反応ミックスとキャピラリー各ガラスをロードするマイクロタイタープレートの底の井戸。液体がチューブを下に移動して終了し、熱が毛細血管の両端を密封するためにブタンのトーチでガラス管を密封する前にPCRミックスの間にスペースを提供できるようにホルダーを傾け。
- アイダホテクノロジーRapidcyclerにキャピラリーチューブとホルダーを配置し、PCRを実行するために、異なるアレロタイプ化プライマーについては表1に記載のサーマルサイクラーのプログラムを使用してください。
- クラーのプログラムが完了すると、ゲル電気泳動のステップに進みます。
3。ゲル電気泳動
注：電気泳動の研究室と使い捨てゴム手袋の新しいペアで使用するために指定された別の白衣を着用してください。
注：UV保護めがねゴーグルまたはフェイスシールドを着用し、エチジウムブロマイド、特にアガロースゲルを取り扱う際は常に手袋だった。
- 繰り返し周期的な視覚を持つ2〜5分間間隔の20％の電力で設定されたマイクロ波でアガロース懸濁液を加熱することにより1xTAE（または1 × TBE）電気泳動緩衝液（7）における分子生物学グレードのアガロース100ミリリットル溶融1.5％（w / v）の準備点検。それは、水浴の温度に平衡化するまで60 ° Cの水浴中で溶融アガロースを設定します。
- 溶融アガロースを注ぐ前にくしでゲルの金型を設定します。十分なコントロールのための井戸、サンプル、およびその両端に配置し、アガロースゲルの中央のために少なくとも3分子量標準を生成するのに十分な歯を持つゲルのコームを選択してください。
- 、混ぜ気泡を製作するのを避けるため、ゆっくりと瓶の中身を注ぐことに優しくスワールボトル、1xTAEで溶融1.5％（w / v）アガロース（またはTBE）100mlにエチジウムブロマイド（10 mg / ml）を2μlを添加する10センチメートルアガロースゲルで15のためのゲル型の真ん中に。アガロースゲル内の任意の気泡を除去するためにティッシュペーパーやペーパータオルのエッジを使用してください。
- アガロース固化（〜30〜45分）まで、室温で設定されたゲルの金型をしてみましょう。潜水艇、1X TAE（または1 × TBE）電気泳動用バッファーを含む水平電気泳動槽にゲル＆コーム付ゲルトレイを転送します。ゆっくりとアガロースゲルからコームを抜き取る。
- このポールは、ゲルの下部にかどうかを確認して電気泳動槽の陰極または陽極からの相対ゲルトレイの配置を確認してください。注：陰極に向かって負に荷電したDNA移行する（すなわち、"赤に実行する"）を覚えておいてください。
- 6X DNAのローディング色素を40μlとしたDNA分子量マーカー（0.25μg/μLの）のプレミックス200μlの。最初、真ん中、最後のウェルに予備混合したDNA分子量マーカーXIVの4.8μlをロードします。
- 左から右に移動し、よく2から始まると後続の各ウェルに進んでPCRサンプルのそれぞれをロードします。分子量標準を含むウェルのいずれかでサンプルをロードしないように。
- キャピラリー各ガラスに含まれるサンプルをロードするには：
- そのホルダーとエッチングからガラスカッターとキャピラリーの両端をそれぞれのキャピラリを取り外します。
- キャピラリーの両側に両手の親指と人差し指は、ガラスカッターでマークされ、毛細血管をはめ込みます。
- PCR反応ミックスの端の反対側にキャピラリーディスペンサーを置き、ゆっくりと液体がチューブの一番下になるまで時計回りにプランジャーを回す。
- ロードされるようにウェルにキャピラリーを置き、ゆっくりよくアガロースにフィコール加重サンプルを分注するために時計回りにプランジャーを回す。キャピラリーともしない穿刺に注意してくださいまたは液体の最後は、毛細血管を離れるときに、過去あまり回して、ウェルに気泡を導入する。
- 一度すべてのサンプルと標準がロードされ、90 V（9ボルト/ cmのアガロースゲル）への電源の定電圧を設定します。
- 黄色の色素（Taurazine）フロントがゲルの底から1cmになると、電気泳動を中止してください。
- 電気泳動が完了すると、DNA断片と分子量標準を可視化するためにUVトランスにゲルを移す。またはサーマルプリンタとCCDカメラと印刷イメージを使用してデジタル画像として：オレンジ色ガラスフィルター（2 ×、4.5 yを設定）でポラロイドカメラを使用して、ポラロイドフィルム上にイメージをキャプチャします。
- 15〜30分間10％の漂白剤のキャピラリーホルダーを置きます。のdH 2 OおよびバックPCRセットアップの室内の空気乾燥の場所で3回リンス。
4。代表的なマルチプレックスPCRの結果
1から10までのサルモネラ分離株のアレロタイプ化PCRの結果を図1に示す（レーン3-12）と次のように解釈されます。 O対立遺伝子の指定は、PCRのコントロールにサイズに一致するとは、Oの対立遺伝子のプライマーに対して予測アンプリコン（PCR産物）に基づいて分離サルモネラに与えられる（3）使用する設定：B - 560bp、C1 - 340bp、C2 - 400bpの、 D1 - 620、BP、およびE1 - 280 BP。 - Oアレロタイプ化PCR（図1A）でテスト分離株の場合、我々は（レーン10 B Oの対立遺伝子を割り当てレーン3-12にテストされたサルモネラが分離さ10〜13）、C1（レーン7-9）、C2（レーン4,5）、D1（レーン3）、およびE1（レーン6）。これらの同一のサルモネラ菌分離株は 、図と同じ順序で、テストされました。 1A、H1の対立遺伝子のi、G、M、R、およびz10（図1B、C）。再び、H1の対立遺伝子は、それぞれのPCRのコントロールにサイズに一致するアンプリコンの存在に依存して分離するために割り当てられ、など（3）使用される4 H1の対立遺伝子のプライマーを設定するための予測：I - 510 BP（図1B、レーン2 ）、G、M - 310 BP（図1B、レーン2）、R - 170 BP（図1C、レーン2）、およびz10 - 360 BP（図1C、レーン2）。 H1の対立遺伝子は10個のサルモネラ分離株のいずれかに割り当てられていた：私は- 3と8を（図1B、レーン5＆10）隔離し、G、M -分離株1および5（図1B、レーン3＆7）、Rに分離株6と9（図1C、レーン8＆11）;。分離株2、7、および10（図1C、レーン4、9、および12）へとz10のサルモネラが分離4は、テストした4 H1の対立遺伝子は陰性であった。最後に、 サルモネラの分離株は、1,2に関連付けられているH2の対立遺伝子についてPCRにより試験した、1,5、1,6、1,7抗原複合体とE、N、X、E、N、Z15抗原複合体。 1,6、、1,5、1,7、複雑にし、H2 E、N、X、プライマーは、H2 1,2については設定のe、nは、Z15複合体（3）はそれぞれ、290 bpおよび150 bpのアンプリコンを生成する。プライマーセットは、決定的な対立遺伝子の種類、元を割り当てるには、どちらかH2の抗原複合体に含まれる特定のH2の対立遺伝子を区別することはできません。 。分離するために1,2、（3） サルモネラ4を分離し、6、8-10 H2 1,2に関連付けられているH2の対立遺伝子が陽性であった、1,5、1,6、1,7抗原複合体、分離株2としながらE、N、Z15抗原複合体（データは示さず）、7は、e、nは、xに関連付けられたH2の対立遺伝子が陽性であった。 サルモネラは 1,3、および5二つH2抗原の複合体は陰性であった分離しながら、唯一の1と5は、H2フラジェリンのためのような一般的なH2フラジェリンPCR（1）（データは示さない）を用いて決定陰 性であった分離します。これらの結果は、各分離するために割り当てられていると推定されるサルモネラの血清型と一緒に表2にまとめた。
図1。 S.に関連付けられた特定のOとHの対立遺伝子を識別するためのマルチプレックスPCR enterica血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス。（）O対立遺伝子のマルチプレックスPCR。 I / G、M（B）とr/z10（C）：フラジェリンの対立遺伝子を識別するための（B、C）H1アレルマルチプレックスPCR。レーン1と13：100 bpのラダー（プロメガ社、マディソン、WI）、レーン2：マルチプレックスPCRのコントロールO対立遺伝子B、C1、C2、D1、およびE（）のため、H1の対立遺伝子I / G、M（B）、およびH1は対立遺伝子r/z10（C）、およびレーン3-12： サルモネラは、1〜10（表2）を分離します。
| PCRマスターミックス | サーモ（Rapidcycler） | ||||
| 試薬 | コンポジション/濃度 | 量は | パラメータ | 予想されるサイズ | |
| H1 I / G、M | |||||
| のdH 2 O | 63μlの | プログラム1 | 94℃で1分間 | ||
| 10 × PCRバッファー | 20mMのMgCl 2の | 10μlの | プログラム2 | 1秒94 ° C | |
| 500 mMTris PH8 | 1秒、55 ° C | ||||
| 2.5 mg / mlのBSA | 20秒72 ° C | ||||
| 5パーセントフィコール400 | 40サイクル | ||||
| 10 mMTartrazine | 傾き= 2.0 | ||||
| プライマーI（F）* | AACGAAATCAACAACAACCTGC | 2μlの | プログラム3 | 4分間72℃ | 510 bpの |
| プライマーI（R）* | TAGCCATCTTTACCAGTTCCC | 2μlの | |||
| プライマーG、M（F）* | GCAGCAGCACCGGATAAAG | 2μlの | 310 bpの | ||
| プライマーG、M（R）* | CATTAACATCCGTCGCGCTAG | 2μlの | |||
| DMSO | 5μlの | ||||
| のdNTP | 10 mMの | 2μlの | |||
| Taqポリメラーゼ | 5単位/μlの | 2μlの | |||
| 90μlの | |||||
| H1 R / Z 10 | |||||
| のdH 2 O | 55μlの | プログラム1 | 94℃で1分間 | ||
| 10 × PCRバッファー | 30mMのMgCl 2の | 10μlの | プログラム2 | 1秒94 ° C | |
| 500 mMTris PH8 | 1秒、55 ° C | ||||
| 2.5 mg / mlのBSA | 20秒72 ° C | ||||
| 5パーセントフィコール400 | 40サイクル | ||||
| 10 mMTartrazine | 傾き= 2.0 | ||||
| プライマーR（F）* | CCTGCTATTACTGGTGATC | 4μl | プログラム3 | 4分間72℃ | 170 bpの |
| プライマーR（R）* | GTTGAAGGGAAGCCAGCAG | 4μl | |||
| プライマーZ 10（F）* | GCACTGGCGTTACTCAATCTC | 4μl | 360 bpの | ||
| プライマーZ 10（R）* | GCATCAGCAATACCACTCGC | 4μl | |||
| DMSO | 5μlの | ||||
| のdNTP | 10 mMの | 2μlの | |||
| Taqポリメラーゼ | 5単位/μlの | 2μlの | |||
| 90μlの | |||||
| PCRマスターミックス | サーモ（Rapidcycler） | ||||
| 試薬 | コンポジション/濃度 | 量は | パラメータ | 予想されるサイズ | |
| H2 1,2 / E、N、X | |||||
| のdH 2 O | 63.6μL | プログラム1 | 94℃で1分間 | ||
| 10 × PCRバッファー | 20mMのMgCl 2の | 10μlの | プログラム2 | 1秒94 ° C | |
| 500 mMTris PH8 | 1秒、55 ° C | ||||
| 2.5 mg / mlのBSA | 20秒72 ° C | ||||
| 5パーセントフィコール400 | 40サイクル | ||||
| 10 mMTartrazine | 傾き= 2.0 | ||||
| プライマー1,2（F）* | AGAAAGCGTATGATGTGAAA | 2μlの | プログラム3 | 4分間72℃ | 290 bpの |
| プライマー1,2（R）* | ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC | 2μlの | |||
| プライマーE、N、X（F）* | TAACTGGCGATACATTGACTG | 2μlの | 150 bpの | ||
| プライマーE、N、X（R）1 | TAGCACCGAATGATACAGCC | 2μlの | |||
| DMSO | 5μlの | ||||
| のdNTP | 10 mMの | 2μlの | |||
| Taqポリメラーゼ | 5単位/μlの | 2μlの | |||
| 90μlの | |||||
| 一般的なH2 | |||||
| のdH 2 O | 72μlの | プログラム1 | 94℃で1分間 | ||
| 10 × PCRバッファー | 30mMのMgCl 2の | 10μlの | プログラム2 | 10秒94 ° C | |
| 500 mMTris PH8 | 10秒45 ° C | ||||
| 2.5 mg / mlのBSA | 35 S 72 ° C | ||||
| 5パーセントフィコール400 | 40サイクル | ||||
| 10 mMTartrazine | 傾き= 2.0 | ||||
| プライマーfljB（F）* | CAAGTAATCAACACTAACAGTC | 2μlの | プログラム3 | 4分間72℃ | 1500 bpの |
| プライマーfljB（R）* | TTAACGTAACAGAGACAGCAC | 2μlの | |||
| のdNTP | 10 mMの | 2μlの | |||
| Taqポリメラーゼ | 5単位/μlの | 2μlの | |||
| 90μlの | |||||
表1。 サルモネラ flagellinallelotyping PCR用プロトコール：合成、条件、および期待される結果。
* PCRオリゴヌクレオチドプライマーの作業用ストック濃度は25μMです。
| 隔離する | Oのアレル | H1のアレル | H2のアレル | 血清型 | |||||||||
| B | C1 | C2 | D1 | E | 私 | G、M | R | Z10 | 1,2、1,5、1,6、1,7 | E、N、X、E、N、Z15 | 汎用の1 | ||
| 1 | - | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | 腸炎 |
| 2 | - | - | + | - | - | - | - | - | + | - | + | + | ハダル/イスタンブール3 |
| 3 | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | + | ケンタッキー州 |
| 4 | - | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - | + | 未知 |
| 5 | - | + | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - | モンテビデオ |
| 6 | - | + | - | - | - | - | - | + | - | + | - | + | Infantisまたはウィルヒョウ2 |
| 7 | - | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | + | ムバンダカ |
| 8 | + | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | + | ネズミチフス菌 |
| 9 | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | - + | ハイデルベルク | |
| 10 | + | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | + | ハイファ |
表2。アレロタイプ化PCRの結果（図1）とサルモネラ血清型の指定は、O、H1、およびH2の対立遺伝子の同定に基づいて
> 1 H2 PCRは関係なく、H2の対立遺伝子（1）の、H2フラジェリンを有するすべてのサルモネラは1.5 kbのターゲットを生成します。このPCRは、二相性のサルモネラの単相性を区別するために使用されます。
1,5; 1,6、1,7抗原複合体（3）2 H2マルチプレックスPCRは、H2 1,2の異なる対立遺伝子を区別できません。
S. 3ファージ変換血清型イスタンブールを生成するためにenterica血清型ハダルを変化させるLPS O抗原。 Oアレロタイプ化PCRは、これらの微妙な遺伝子/抗原性の変化を見分けることができません。
| 血清型1 | Oのアレル | H1のアレル | H2のアレル | |||||||||
| B | C1 | C2 | D1 | E | 私 | G、M | R | Z10 | 1,2、1,5、1,6、1,7 | E、N、X、E、N、Z15 | 一般的な2 | |
| カリフォルニア州 | + | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - |
| ネズミチフス菌 | + | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | + |
| ハイデルベルク | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | - | + |
| ハイファ | + | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | + |
| モンテビデオ | - | + | - | - | - | - | + | - | - | + | - | + |
| Othmarschen | - | + | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - |
| アシナイ | - | + | - | - | - | + | - | - | - | - | + | + |
| Papuana | - | + | - | - | - | - | - | + | - | - | + | + |
| ムバンダカ | - | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | + |
| Chincol | - | - | + | - | - | - | + | - | - | - | + | + |
| ケンタッキー州 | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | + |
| ハダル/イスタンブール3 | - | - | + | - | - | - | - | - | + | - | + | + |
| 腸炎 | - | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - |
| スレンバン | - | - | - | + | - | + | - | - | - | + | - | + |
| Campinense | - | - | - | + | - | - | - | + | - | - | + | + |
| ロメ | - | - | - | + | - | - | - | + | - | - | - | + |
| ポートランド | - | - | - | + | - | - | - | - | + | + | - | + |
| ルアンダ | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - | + | + |
| トレギエ | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - | - | + |
| シミ | - | - | - | - | + | - | - | + | - | - | + | + |
| ヴェルテフレーデン | - | - | - | - | + | - | - | + | - | - | - | + |
| クリスチャンスタッド | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | + | + |
| ビアフラ共和国 | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | - | + |
アレロタイプ化PCRにより同定された表3。 サルモネラの血清型
1太字で強調表示された血清型は、より一般的な診断や食品微生物学研究室で遭遇するものです。
2 H2 PCRは関係なく、H2の対立遺伝子（1）の、H2フラジェリンを有するすべてのサルモネラは1.5 kbのターゲットを生成します。このPCRは、二相性のサルモネラの単相性を区別するために使用されます。
S. 3ファージ変換血清型イスタンブールを生成するためにenterica血清型ハダルを変化させるLPS O抗原。 Oアレロタイプ化PCRは、これらの微妙な遺伝子/抗原性の変化を見分けることができません。
Discussion
属（例：invA）に固有のサルモネラの標的遺伝子を検出するための最も市販のPCRテスト。ただし、すべてのサルモネラは動物の個体数の人間や有病率で病気を引き起こす能力に等しいです。 サルモネラ LPS O -抗原とflagellinH1とH2抗原の抗原性の違いの早期発見は、これらの抗原性の違いに基づいて、2,500以上の血清型にサルモネラの分化にリードしている。 サルモネラ属に同定された46の異なるO抗原と86の異なるフラジェリン（H）抗原があります。 サルモネラ一 （H1）または2つの異なる（H1＆H2）flagellinsを持っている可能性があります。今日認識さ2500 サルモネラの血清型の異なるOの組み合わせ、H1、およびH2抗原のアカウント。血清型は、個々のOとH抗原の同定から得られた抗原式に基づいて割り当てられます。式はOのように書かれている抗原：H1：H2、および" - "、O -抗原に対して陰性サルモネラ用H1またはH2フラジェリンと"NT"（非入力可能）の不在を指します。例えば、血清型ネズミチフス菌はS.に割り当てられます。 G、M：：-. Enteritidisが、数式D1と分離するために与えている間に1,2：I：entericaは抗原式Bで分離するサルモネラ集団におけるこの抗原変異は、したがって、容易にPCRによって悪用される可能性ヌクレオチドレベルでの相違点の外側に現れています。
我々は識別S.ためアレロタイプ化PCRを開発するために特定のOとHの対立遺伝子に関連付けられている遺伝的差異を同定したenterica血清型：サルモネラ、ハダル、ハイデルベルク、及びネズミチフス菌（3）。ハイデルベルク（B、ハダル（E、N、X C2：：Z10）、 - （D1：：G、M）サルモネラのためにH2抗原式：H1： サルモネラ血清型の正しい割り当ておよびレポートは、Oに関連付けられているすべての対立遺伝子のためにテストする必要があります：R：1,2）、及びネズミチフス菌（B：I：1,2）。 Oの対立遺伝子または抗原、H1 gの発見に関する知識がなくても、単独でm個の対立遺伝子は、必ずしもサルモネラは他のサルモネラの血清型としてEnteritidisのように分離識別するものではありません：Agona、カリフォルニア州、そしてモンテビデオ、またこの同じ対立遺伝子を持っている。アレロタイプ化PCRは、もともとサルモネラの血清型を説明した前面を検出するために設計されていますが、このテストではさらに19血清型（表3）を識別することができます。私たちのアレロタイプ化PCRは、もともとOとHの対立遺伝子を検出するように設計された。私たちはO -特異的抗血清を使用して、ではなく、isolated サルモネラの培養で作業するときOアレロタイプ化PCRを行うこと、スライド凝集試験によってO -抗原を識別するための練習では、それはより実用的かつ効果的なコストとなっています。しかし、我々は、ラボの画面（2）として、またはサルモネラが FTAカード（6）に提出された分離株と入力し、このPCRを使用している場合はOアレロタイプ化PCRを使用することをお勧めします、そしてサンプルの最初の画面でサルモネラ特異的PCR（4が含まれていますか）。 PCRまたは抗原/生化学検査でサルモネラと識別されたサンプルだけにアレロタイプ化PCRを制限する。
この資料に記載されているプロトコルは、アイダホテクノロジーRapidcycler、1つは反応容量を縮小することを可能にし、多くの加熱ブロックサーモよりも短い時間での反応条件を実行して熱風クラーで使用するために最適化されています。プライマー濃度を調整する;またはMgCl 2の濃度を調整し、加熱ブロックサイクラーで使用するためにこのプロトコルを適応するには、アニーリング温度を下げる/上げることによって経験的に反応条件の最適化が必要になる場合があります。例えば、我々は、PTC - 200サーマルサイクラーは以下のようにMJリサーチのためのプロトコルを適応しなければならなかった。表1で説明したのと同じ反応ボリュームでの作業、作業用ストックconcentrationof私のプライマーセットを2.5μMに希釈し、アニーリング温度は、アニーリングと伸長反応ステップ、変性は55℃から45℃、およびインキュベーション時間を低下させたI / G、Mアレロタイプ化PCRのために20秒に延長されました。適切な陽性および陰性コントロールを持つことは、公開プロトコルを含むあらゆるPCRの初期のスタートアップと最適化、に不可欠です。 、ハダル（C2：Z10：E、N、X）、ハイデルベルク（B：R - 、サルモネラ（D1：：G、M）我々は特にAnatum（：：E、H 1,6 E1）、知られているサルモネラの血清型を取得することをお勧め：1,2）、モンテビデオ（C1：G、M、S：1,2,7）とネズミチフス菌（B：I：1,2）、および実験室大腸菌 K12株（DH5α、LE393、JM109など）はそれぞれこの資料に記載されているアレロタイプ化PCR検査の陽性コントロールと陰性コントロールとして。これらのサルモネラの血清型のいくつかはテストされている対立遺伝子に応じて、正または負のコントロールとして機能します。
特定の予防措置とガイドラインは、これと他の診断PCRを行いながら、続いする必要があります。最初に、物理的な分離テンプレートの準備から、PCRは、セットアップ、およびゲル電気泳動では、汚染と偽陽性の誤った報告可能なPCRのキャリーオーバーを防止するのに重要です。これらのコントロールは、彼らが発生したときに問題を特定し、その結果（5）の解釈を助けるように加えて、適切なコントロールを含めることは、あらゆるルーチンPCRに必要です。最も重要なことは、一貫性は、特にアンプリコンの大きさのアンプリコン（PCR産物）の検出andestimationのための電気泳動条件に関しては、必要不可欠です。この点を説明するために、我々は故意に、図1Aに意図したよりも早く電気を一時停止。分子量標準（レーン1及び13）及び陽性対照（レーン2）が十分に正確なサイズを見積もるやサイズのわずかな違い（〜50塩基）が存在するDNA断片の分離を観察するために分離されていません。 DNA断片の十分な分離、特に分子量の基準は、陽性を報告すると、アンプリコンの大きさと時々あらゆるPCRの毎日ランニング（5で観察される非特異的アンプリコンから区別する"真の陽性"の正確な推定に依存するように不可欠である）。例えば、図1B、レーン7（サイズは〜700塩基対）の非特異的アンプリコンがあります。色素フロントがアガロースゲル中の半分の方法ポイントでのみだったとき、あまりにも早く電気泳動を中止していた、500 bpと700bpのDNA断片の間にはほとんど区別があるでしょう。従って、レーン7のサンプルが誤って両方のiとg、m個の対立遺伝子陽性と報告されているでしょう。
最後に、1つは、任意のテストに関連付けられている限界を認識する必要があります。 1,5; 1,6、1,7抗原複合体、E、N、X / E H1/H2アレロタイプ化PCRのいくつかは、H2 1,2に属する遺伝子の微妙な遺伝子の違いを識別するために差別的な力を持っていない、N、G、m個の対立遺伝子を含むZ15抗原複合体とH1 Gの抗原複合体、。つまたは2つのアミノ酸の変化は、これらの鞭毛抗原に存在する異なるエピトープを占めている。私たちはフラジェリン遺伝子配列（3）でこれらの時々、単一の塩基対の違いを悪用する可能性プライマーを設計することは困難であった。例えば、 サルモネラ血清型ダブリン（D1：G、P： - ）とベルタは（D1：F、G、T： - ）プライマーをmallelotyping、私たちのgでもPCR陽性である。 H2のアレロタイプ化プライマーは、ネズミチフス菌を区別することはできない（B：I：1,2）ラゴスから（B：I：1,5）、ハイデルベルク（B：1,2：R）ブラッドフォード（：R：B 1,5）から、グロストラップから（C2：Z10：E、N、Z15）ウィネバ（B：R：1,6）、またはサンレモ（B：R：1,7）、またはハダル（E、N、X C2：：Z10）。これらの血清型のいくつかが発生する可能性が：ラゴス、ブラッドフォード、ウィネバ、サンレモまたはGlustrupがリモートである、それは可能であり、どちらかのテスト"の制限または別の確認検査に免責事項を提供する必要があります。
結論として、このPCRベースの血清型別では、急速にS.を識別します。 enterica血清型Enteritidisは、ハダル、ハイデルベルクとネズミチフス菌、及びO、H1、およびH2の対立遺伝子は、19追加の血清型に関連付けられている。このアッセイは、血清型のサルモネラに従来の微生物学的ア プローチへの迅速、費用対効果の高い選択肢です。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、米国農務省の助成1999-35212-8680、2005から01378まで、および2010-04288-01、USDAフォーミュラファンドとグルジアの獣医学農業研究助成の状態によってサポートされています。ジョージア大学で米博4900L、GENE 4960H、BCMB 4960L、およびBIOL 4960HとMaurer氏にいくつかの分子疫学の研究プロジェクトに学生が使用する：この文書に記載されているプロトコルは、指示の研究コースの一環として、学部生が使用するために開発された実験室。我々は、研究と学部教育を統合するための努力を支援するためのマウラーとリー研究室における研究、そして私たちの学科長、ジョングリッソンを実行している多くの学部学生に感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Bertani | Fisher Scientific | (or any comparable source) | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 1.5 ml capacity | (or any comparable source) |
| Ethanol | Fisher Scientific | 200 proof | (or any comparable source) |
| dH2O | Sigma-Aldrich | Molecular Biology Grade | (or any comparable source; PCR only) |
| 10 x PCR Buffer: | Idaho Technologies | 20 mM MgCl2 | (buffer comes with BSA, Ficoll and Tartrazine) |
| 30 mM MgCl2 | |||
| 40 mM MgCl2 | |||
| PCR primers | |||
| DMSO | |||
| dNTP | Roche Group | (or any comparable source) | |
| Taq DNA Polymerase | Denville Scientific | (or any comparable source) | |
| Capillary pipettes | Idaho Technologies | 10 µl volume | |
| Rapid Cycler | Idaho Technologies | ||
| Agarose | Bio-Rad | Low EEO; Molecular Biology Grade | (or any comparable source) |
| 50 X TAE Buffer or 5X TBE Buffer | Fisher Scientific | (or any comparable source) | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | (or any comparable source) | |
| Horizontal, submersible gel electrophoresis chamber with gel mold | Bio-Rad | (or any comparable source) | |
| Power supply | Bio-Rad | (or any comparable source) | |
| Molecular Imager Gel Doc System | Bio-Rad | (or any comparable source) | |
| Table 4. Materials | |||
References
- Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica. J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 Forthcoming.
- Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles. J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).
- Hong, Y., Liu, T., Lee, H. ofacre, Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. aurer J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles. BMC Microbiol. , (2008).
- Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments. J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).
- Maurer, J. J. Rapid detection and limitation of molecular techniques. Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).
- Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper. Avian Dis. 50, 391-396 (2006).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989).
- Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air. Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).
