Drosophila Puppenstadium Abdomen Immunhistochemie

Summary

Antikörper-Färbung der

Abstract

Die Drosophila Puppenstadium Bauch ist ein etabliertes Modellsystem für die Untersuchung von epithelialen Morphogenese und die Entwicklung von sexuell dimorphen Morphologien ^1-3. Während der Verpuppung, die etwa 96 Stunden umfasst (bei 25 ° C), ersetzen proliferierenden Populationen von imaginalen Zellen der larvalen Epidermis der Erwachsenen Abdominalsegmente zu generieren. Diese imaginäre Zellen, geboren während der Embryogenese, als seitliche Paar histoblast Nester in jedem Abdominalsegment der Larven vorhanden sind. Vier Paare von histoblast Nestern führen zu den Erwachsenen dorsalen Kutikula (vordere und hintere dorsale Nester), das ventrale Kutikula (ventral Nester) und die Luftlöcher, wobei jedes Segment (Luftloch Nester) ⁴ verbunden. Nach puparation, beginnen diese diploiden Zellen (unterscheidbar nach Größe von den größeren polyploiden larvalen Epidermiszellen-LECs) eine stereotype Prozess der Proliferation, Migration und Austausch der LECs. Verschiedene molekulare und genetische Werkzeuge können eingesetzt werden, um die Beiträge der genetischen Ursachen der Morphogenese der erwachsenen Bauch beteiligt zu untersuchen. Ultimative Erwachsenen Phänotypen sind in der Regel folgende Zerlegung der erwachsenen abdominale Nagelhaut analysiert. Allerdings erfordert Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Prozesse immunhistochemischen Analysen der Puppenstadium Epithel, das einzigartige Herausforderungen. Zeitlich dynamische Morphogenese und die Interaktionen von zwei verschiedenen epithelialen Populationen (Larven-und imaginären) erzeugen eine fragile Gewebe anfällig für übermäßige Zellverlust während der Präparation und die anschließende Verarbeitung. Wir haben Methoden zur Präparation, Fixierung, Montage-und Imaging-der Drosophila-Puppen abdominem Epithel für immunhistochemische Studien, die eine gleichbleibend hohe Qualität Proben geeignet für die konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie oder Standard generieren entwickelt.

Protocol

1. Tag 1

Bevor Sie beginnen:

Eine gesunde Bevölkerung von Fliegen sollte beibehalten unter Verwendung von Standard-Protokollen Kultivierung werden: remove Erwachsene aus Flaschen oder Ampullen nach 3-4 Tagen von Ei-legen und damit die Entwicklung auf eine konstante Temperatur bis wandernde 3 ^rd Larvenstadium initiieren pupariation gehen. Die Larven / Puppen Übergang wird durch die Bildung der prepupae (als 0 Stunden nach Puparium Bildung-APF) markiert. Immobile Puppen sind aus älteren Puppen durch ihre weiße Färbung und von Larven, die noch nicht pupariation durch ihre längliche, runde Form und Vorwölbung der vorderen Stigmen begonnen unterschieden.

Sie benötigen:

• Ein Pinsel für das Sammeln Puppen
• Eine feuchte Kammer zur Kultivierung von Puppen: Eine Petrischale mit benetzt Papiertuch ausgekleidet und mit Filterpapier für die verschiedenen Zeitpunkte der Erhebung, Genotyp und Geschlecht der Puppen markiert
• 1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zum Waschen Puppen

Sammlung, Kultivierung und Inszenierung Puppen

1. Mit einem benetzten Pinsel entfernen sanft 0HR APF Puppen aus der Kultur-Flaschen / Vials und legen Sie sie in den Deckel der feuchten Kammer.
2. Mit dem Pinsel und 1X PBS vorsichtig waschen die Puppen, um Schmutz aus der Puppe Fall entfernen
3. Gegebenenfalls Art der Puppen nach Geschlecht. Die Gonade Primordien der Puppen können verwendet werden, um den Geschlechtern zu sortieren. Die männlichen Keimdrüsen Primordien sind eine seitliche Paar transluzenten Scheiben leicht durch die Puppenstadium Nagelhaut ca. 2 / 3 über die gesamte Länge des Körpers ^{5 zu} sehen. Die weibliche Gonade Primordien sind kleiner und nicht so leicht zu erkennen.
4. Legen Sie die Puppen in die entsprechend gekennzeichneten Position in der feuchten Kammer und zurück auf eine konstante Temperatur. Kultur an den entsprechenden Entwicklungs-Zeitpunkt.

2. Tag 2: Dissection, Fixierung und primäre Antikörper-Inkubation

Bevor Sie beginnen:

Sie benötigen:

• Dissection Stereomikroskop
• Chirurgische Pinzette
• Chirurgische Skalpell mit der Nummer 11 Klingen
• Zwei neun und Glas Depression Gerichte (Corning Produkt # 7220-85)
  • Fill Brunnen von einem Gericht mit 1X PBS: Dies ist die Spülung Gericht zur Reinigung zerlegt Puppen
  • Fill Bohrungen der zweiten Schale mit Fixierung Puffer
• Feuchten Kammer für die Antikörper-Inkubation. Wir verwenden Kunststoff verschließbaren Sandwich-Boxen mit benetzt Papierhandtücher ausgekleidet.
• Fixation Puffer: 1x PBS, 4% Paraformaldehyd, 0,2% Desoxycholsäure (zur Permeabilisierung)
• Dissection Plattform: Clear Objektträger mit einem Stück doppelseitigem Klebeband verklebt auf einer Seite
• 1X PBS
• p100 oder p200 Pipette

Zergliederung

1. Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen Puppen eine nach der anderen und sie auf die Zerlegung Plattform mit dem vorderen Ende der Puppen mit Blick auf den breitesten Breite des Bandes. Wenn Puppen übermäßig nass sind, zuerst blot sie trocken mit einem Papiertuch.
2. Bevor die Puppen ganz auf das Band geklebt haben, verwenden Sie einen Pinsel zu positionieren.
3. Lassen Sie die Puppen an der Luft trocknen und halten, um das Band (5-10 Minuten)
4. Mit dem chirurgischen Skalpell sezieren jeden Puppen bilateral. Dies geschieht am besten mit einer einzigen schnellen Schnitt von der vorderen bis zum hinteren Ende der Puppen erreicht. Wenn richtig gemacht, wird der Schnitt halbieren beiden vorderen und hinteren Luftlöcher Paaren. Dissect nicht mehr als 10 Puppen in einer Zeit, als Wasch-und Reinigungsmitteln die Proben schnell ist notwendig, um proteolytische Schädigung des Gewebes zu verhindern.
5. Mit einem Pinsel, Übertragung einer kleinen Menge 1X PBS in jedes seziert Puppen, um sie von dem Band zu lösen.

Reinigung, Fixierung und primäre Antikörper-Inkubation

6. Mit einem Paar chirurgische Pinzette fassen eine individuelle Puppe ein halb nach vorn und sofort eintauchen in eine Vertiefung der Spül-Schüssel. Die Dissektion Plattform soll durch die Spülung Schüssel auf dem Mikroskoptisch ersetzt werden. Die Puppen Fall sollte auf die Probe belassen werden, bis die Bearbeitung abgeschlossen ist und die Proben sind bereit zur Montage.
7. Während noch Ergreifen der Puppe die Hälfte verwendet eines Pipettierautomaten vorsichtig abwaschen das innere Gewebe des Bauches. Zu viel Druck beim Waschen kann zum Verlust von Epithelzellen führen.
8. Sofortüberweisung das saubere Puppe Hälfte Fixierung Puffer bei Raumtemperatur und Verfahren die restlichen Puppe Hälften ähnlich. Mit ein wenig Übung, Dissektion und Waschen von 20 Puppe Hälften sollte weniger als 5 Minuten.
9. Lassen Sie Puppen in Fixierung Puffer bei Raumtemperatur inkubieren für 1 (eine) Stunde.
10. Spülen festen Puppen 3x 5 Minuten in 1X PBS
11. Die Proben können sofort für die Immunhistochemie verarbeitet werden oder in 100% Ethanol bei -20 ° C gelagert werden für bis zu 3 Monaten ohne Verlust von Zellen oder Epitop Reaktivität.
12. Zum Speichern von Proben, äquilibrieren Proben durch eine VerdünnungSerie von PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) bei Raumtemperatur für 20 Minuten in jeder Verdünnung vor der Übertragung zu 100% EtOH.
13. Proben müssen erneut in PBS äquilibriert durch die Reverse-Serie vor der Verarbeitung für die Immunhistochemie.
14. Block-Proben in 1x PBS (ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin) für 1 (eine) Stunde vor der Zugabe des primären Antikörpers.
15. Inkubieren mit dem primären Antikörper verdünnt, um geeignete Konzentration in 1X PBS über Nacht bei 4 ° C, ohne Schaukeln.

3. Tag 3: Sekundäre Antikörper-Inkubation, Montage-und Imaging-

Bevor Sie beginnen:

Sie benötigen:

• Zwei chirurgische Zange
• Montage Medien (Glycerin, Vectashield [Vector Labs] oder Slowfade Gold [Invitrogen])
• Depression und Objektträger (0,8 mm)
• Deckgläser (24 x 40 mm)

Sekundäre Antikörper-Inkubation und Montage:

1. Wash-Proben 3x 10 Minuten mit jeweils 1x PBS
2. Block-Proben in 1x PBS (ergänzt mit 2% Rinderserumalbumin) für 1 (eine) Stunde vor der Zugabe des sekundären Antikörpers.
3. Inkubieren mit sekundärem Antikörper verdünnt, um geeignete Konzentration in 1X PBS bei Raumtemperatur im Dunkeln, ohne Schaukeln für 3 (drei) Stunden.
4. Wash-Proben 3x 10 Minuten mit jeweils 1x PBS
5. Gegebenenfalls Gegenfärbung Puppen (Beispiel haben wir Flecken Kerne mit DAPI [4 ',6-Diamino-2-phenylindole] in PBS für 10 Minuten verdünnt).
6. Äquilibrieren Proben (mindestens 30 Minuten) in geeigneten Medien vor der Montage.
7. Bereiten Sie eine Probe gleiten. Die Morphologie der Puppen verhindert flache Montage. Die Proben werden in die Vertiefung einer Depression slide (tropfen) für die Bildgebung montiert. Legen Sie 75-100 ul der Montage Medien in die Depression gut. Mehrere Proben können auf einer einzelnen Folie angebracht werden.
8. Die Puppe Fall muss aus den Proben vor der Montage entfernt werden. Fassen Sie eine individuelle Puppe Fall anterior Dabei bitte nicht auf den internen Puppenstadium Membran zu erfassen.
9. Mit einer zweiten Pinzette vorsichtig greifen die internen Puppenstadium Membran durch den Kopf und entfernen Sie sie aus der Puppenhülle.
10. Unmittelbar Übertragung der Probe auf die Depression gut und die Verarbeitung fortzusetzen zusätzliche Proben.
11. Mit einer Sonde oder Pinzette Position der Proben gleichmäßig in die Depression auch mit den seitlichen Oberfläche nach oben zeigt. Gelegentliche Luftblasen können mit einer Sonde entfernt werden.
12. Senken Sie das Deckglas auf den Proben dabei nicht um Luftblasen zu präsentieren

4. Repräsentative Ergebnisse:

Die Proben unter Verwendung dieses Protokoll erhalten die grobe Morphologie der erwachsenen Bauch. Bild Stapel können projiziert, um eine zweidimensionale Bild-oder 3-D Rendering angewendet werden, um Bauch-Topologie untersuchen zu generieren.

Abbildung 1. Segmentation Genprodukte in Drosophila Puppen Wingless Protein und Engrailed Ausdruck (En-Gal4: UAS-GFP). Wurden 26 Stunden nach Puparium Bildung (APF) visualisiert mit Maus anti-Wg (4D4: Iowa Hybridoma Bank) und anti-GFP. 10-facher Vergrößerung ist vorderen linken und dorsal wird. Zellkerne wurden mit DAPI gegengefärbt.

Stacks von ca. 50 Bilder (DELTA Z zwischen den Schichten ist 2.5μm) projiziert wurden.

Discussion

Die Techniken in diesem Video präsentiert werden verwendet, um Drosophila Puppen aus einer Vielzahl von Entwicklungs-Zeitpunkten vorzubereiten. Puppen in der Zeit von 24 Stunden APF zu 32 Stunden bearbeitet APF sind besonders anfällig für Zell-Verlust aus dem Epithel. Die Verwendung von Waschmitteln (wie z. B. Triton X-100 und Tween-20) während der erweiterten Inkubationsschritte erhöht die Wahrscheinlichkeit von Zell-Verlust und wird daher nicht empfohlen. Vielmehr ist Desoxycholsäure als Reinigungsmittel in der ersten Fixierung Schritt verwendet. Alle weiteren Schritte sind in 1X PBS ohne Waschmittel durchgeführt. Außerdem rocken Proben während längerer Inkubationsschritte erhöht Zellverlust und sollte vermieden werden.

Die Proben können abgebildet mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie-Techniken sein. Allerdings verarbeitet Drosophila Puppen wie beschrieben kann auch abgebildet mit einem Structured Illumination Microscopy System Nachgeben Bildqualität vergleichbar mit der konfokalen Techniken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection stereomicroscope
Surgical forceps
Surgical scalpel with number 11 blades
Nine-well glass depression dishes	Corning	7220-85
Humid chamber for culturing pupae
1X Phosphate buffered saline (PBS)
#11 surgical scalpel
double-sided tape
Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization)
p100 or p200 pipettor
Depression well microscope slides (0.8 mm)