Summary
の抗体染色
Abstract
ショウジョウバエの蛹の腹部には、上皮形態形成と1-3性的二形性形態の開発の研究のための確立されたモデルシステムです。 （25℃）で約96時間にわたって蛹化、中に、成虫の細胞の増殖集団は、大人の腹部のセグメントを生成するために幼虫の表皮を交換してください。これらの成虫の細胞は、胚形成の間に生まれ、幼虫の各腹部セグメントにおける組織原細胞の巣の外側のペアとして存在する。組織原細胞の巣の4つのペアは、大人の背側クチクラ（前部と後部の背巣）、腹側クチクラ（腹側の巣）と、各セグメント（気門巣）4に関連付けられている気門を生じさせる。 puparation時には、これらの二倍体細胞は、（より大きい倍数体幼生表皮細胞- LECSからサイズによって区別できる）の増殖、遊走およびLECの交換のステレオタイプのプロセスを開始します。様々な分子と遺伝学的ツールは、成人の腹部の形態形成に関与する遺伝的経路の寄与を調査するために用いることができる。究極の大人の表現型は、通常、成人の腹部キューティクルの以下の解剖を分析している。しかし、基盤となる分子過程の研究は、固有の課題を提示蛹上皮の免疫組織化学的分析を、必要とする。時間的に動的な形態形成と二つの異なる上皮集団（幼虫と成虫）の相互作用は、解剖やその後の処理中に、過剰な細胞の損失を受けやすい脆弱な組織を生成する。我々は解剖、固定、マウントと共焦点または標準的な蛍光顕微鏡に適した一貫性のある高品質のサンプルを生成する免疫組織化学的研究のためのショウジョウバエ蛹のabdominem上皮のイメージングの方法を開発した。
Protocol
1。日1
始める前に：
ハエの健全な人口は、標準的な培養のプロトコルを使用して維持する必要があります：卵レイと開発は第3齢幼虫がpupariationを開始放浪するまで一定温度での続行を許可するの3-4日後にボトルやバイアルから大人を削除します。幼虫/蛹の遷移がprepupae（0時間蛹殻形成- APFの後に考えられる）の形成によってマークされています。不動の蛹はその白の着色により、以前の蛹から、まだ彼らの細長い、丸みを帯びた形状と前部気門の突起によってpupariationを開始していない幼虫から区別される。
次のものが必要です。
- 蛹を収集するためのペイントブラシ
- 培養蛹のための湿気のあるチャンバー：ペトリ皿は、接液ペーパータオルで並んでと蛹の収集、遺伝子型または性別の種々の時点のマークが付けられたフィルターの紙で覆われ
- 1Xリン酸は、サナギを洗浄するための緩衝食塩水（PBS）
収集、培養およびステージング蛹
- 接液絵筆を使用すると、静かに培養ボトル/バイアルから0hr APFのサナギを削除し、湿気のあるチャンバーの蓋に置いてください。
- 絵筆と1X PBSを使用すると、そっと蛹のケースから破片を除去するためにサナギを洗う
- 必要に応じてソート性別によるサナギの場合。蛹の生殖巣原基は、男女をソートするために使用することができます。男性の生殖腺原基は容易に蛹クチクラを通して約2 / 3体5の長さがダウンして見られる半透明のディスクの横方向のペアです。女性の生殖腺原基は小さく、同じように簡単に識別されません。
- 湿度の高い室で適切にラベルの位置にサナギを置き、一定温度に戻ります。適切な発達時点まで文化。
2。 2日目：解剖、固定し、一次抗体のインキュベーション
始める前に：
次のものが必要です。
- 解剖顕微鏡
- 手術用鉗子
- 11番ブレードを外科用メス
- 二九もガラスのうつ病の皿（コーニングの製品＃7220〜85）
- 1X PBSで一皿の井戸を埋める：これは、切除した蛹を洗浄するための洗浄皿です。
- 固定バッファで2皿の井戸を埋める
- 抗体のインキュベーションのための湿気のある部屋。我々は、接液ペーパータオルを敷いたプラスチック製の密閉式サンドイッチボックスを使用してください。
- 固定バッファ：1X PBS、4％パラホルムアルデヒド、0.2％デオキシコール酸（透過化用）
- 解剖プラットフォーム：片側に接着した両面テープの切れ端でクリア顕微鏡用スライド
- 1X PBS
- P100やP200ピペッター
解剖
- 鉗子を使用すると、静かに一度蛹つを削除し、テープの広い幅が直面している蛹の前端と解剖のプラットフォーム上に置きます。蛹は過度にぬれた場合は、最初にそれらはペーパータオルを使用して乾燥さ汚点。
- 蛹が完全にテープに付着した前に、それらを配置するために絵筆を使用。
- 空気乾燥にサナギを許可し、テープ（5-10分）に準拠して
- 外科用メスで二国間でそれぞれの蛹を解剖。これは最高の前から蛹の後端に、単一の急速なカットで達成されます。適切に行われれば、カットは前部と後部の両方気門のペアを二分されます。サンプルを洗浄し、洗浄液として一度に10以上の蛹を解剖するには、迅速に組織のタンパク質分解の損傷を防止するために必要です。
- 絵筆を使って、テープからそれらを緩めるために、各解剖サナギに1X PBSを少量転送する。
クリーニング、固定および一次抗体のインキュベーション
- 手術用鉗子のペアで前方に個々のさなぎの半分をつかんで、すぐに洗浄皿のウェルに、それを浸す。解剖のプラットフォームは、顕微鏡ステージ上で洗浄皿に置き換える必要があります。処理が完了し、サンプルがマウントするための準備が整うまでは蛹のケースは、サンプルのままにしておく必要があります。
- まだ蛹の半分をつかんで軽く腹部の内部組織を洗い流すためにピペッターを使用してください。洗浄中に過剰な圧力は、上皮細胞の喪失につながることができます。
- 直ちに、室温で固定バッファにきれいな蛹の半分を譲渡し、同様に残りの蛹の半分を処理。練習すれば、20の解剖と洗濯蛹の半分は5分未満を取る必要があります。
- 蛹が1（1）時間室温で固定バッファでインキュベートすることができます。
- 1X PBSで固定サナギ3倍、5分を洗い流す
- サンプルはすぐに、免疫組織化学のために処理されるか、または3ヶ月間の細胞またはエピトープ反応性を失うことなく-20℃で100％エタノールに格納されることがあります。
- サンプルを保存するために、希釈からサンプルを平衡化PBSのシリーズ：前に100％エタノールに移し、各希釈で20分間室温でエタノール（3:1、1:1、1:3）。
- サンプルは、免疫組織化学のために処理する前に、逆一連のPBSで再平衡にする必要があります。
- 一次抗体を添加する前の1（1）時間のために1 × PBS（2％ウシ血清アルブミンを補充）でサンプルをブロックする。
- 4℃で一晩1X PBSで適当な濃度に希釈した一次抗体°揺動することなくCでインキュベートする。
3。 3日目：二次抗体のインキュベーション、取り付けとイメージング
始める前に：
次のものが必要です。
- 2つの手術鉗子
- マウントメディア（グリセロール、Vectashield [ベクター研究所]、またはSlowfadeゴールド[インビトロジェン]）
- うつ病も顕微鏡スライド（0.8 mm）の
- カバーグラス（24 × 40 mm）を
二次抗体のインキュベーションおよび取付け：
- 1 × PBSで各サンプルを3倍の10分を洗う
- 二次抗体を添加する前の1（1）時間のために1 × PBS（2％ウシ血清アルブミンを補充）でサンプルをブロックする。
- 3（3）時間のためにロッキングすることなく、暗所で室温で1 × PBSで適当な濃度に希釈した二次抗体とインキュベートする。
- 1 × PBSで各サンプルを3倍の10分を洗う
- 該当する場合は、対比蛹（我々はDAPIで核を染色例[4'、6 - ジアミジノ-2 - フェニル] 10分間PBSで希釈）。
- マウントする前に適切なメディアでのサンプル（30分の最小値）を平衡化させます。
- サンプルのスライドを準備します。蛹の形態は、平滑な取付を防ぎます。サンプルは、イメージングのためのうつ病のスライド（ドロップスライド）のウェルにマウントされます。場所もうつ病の取り付けメディアの75 - 100ul。いくつかのサンプルは、単一のスライドにマウントすることができます。
- 蛹の場合は、マウントする前にサンプルから除去する必要があります。前方に内部蛹の膜を把握しないようにしている個々の蛹のケースをつかみます。
- 鉗子の2番目のペアで軽く頭で内部蛹の膜を把握し、蛹のケースから取り外します。
- すぐにもうつ病にサンプルを転送し、追加のサンプルの処理を続行する。
- うつ病でも外側面を上に向けてサンプルに均一プローブまたは鉗子の位置を使用する。時折気泡がプローブを削除することができます。
- ゆっくりと気泡を導入しないように注意しながら試料の上にカバースリップを下げる
4。代表的な結果：
サンプルは、このプロトコルは、成人の腹部の総形態を保持用いて調製。画像のスタックは、腹部のトポロジを調査するために適用することができる二次元画像または3 - Dレンダリングを生成すると予想されることがあります。
図1。 。 ショウジョウバエ蛹翼のない蛋白質と縁をギザギザにした発現（EN - GAL4：UAS - GFP） におけるセグメンテーションの遺伝子産物は、：と抗GFPマウス抗- WG（アイオワハイブリドーマバンク4D4）と（APF）蛹殻の形成後26時間で可視化した。 10倍の倍率は、前方は左だと背が最高です。 NucleiiはDAPIで対比染色した。
約50枚（スライス間のΔZは 2.5μmである）のスタックが予測された。
Discussion
このビデオで紹介するテクニックは、発達時のポイントの様々なショウジョウバエ蛹を準備するために使用することができます。 32時間に24時間の期間APF中に処理サナギは、APF上皮からの細胞の損失に最もなりやすいです。拡張インキュベーションステップの間に界面活性剤の使用は、（そのようなトリトンX - 100とTween - 20）細胞の損失の可能性が高く、したがって、推奨されません。むしろ、デオキシコール酸は、最初の固定ステップの間に洗浄剤として使用されます。後続のすべての手順は、洗剤なしで1X PBSで実行されます。さらに、拡張されたインキュベーションステップの間に試料を揺動する細胞の損失を増加させ、回避する必要があります。
サンプルは共焦点顕微鏡技術を用いて画像化することができます。しかし、説明したように処理されたショウジョウバエ蛹はまた共焦点技術に匹敵する画質をもたらす構造化照明顕微鏡システムを用いて画像化することができます。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、全米科学財団からの助成金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection stereomicroscope | |||
| Surgical forceps | |||
| Surgical scalpel with number 11 blades | |||
| Nine-well glass depression dishes | Corning | 7220-85 | |
| Humid chamber for culturing pupae | |||
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| #11 surgical scalpel | |||
| double-sided tape | |||
| Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization) | |||
| p100 or p200 pipettor | |||
| Depression well microscope slides (0.8 mm) |
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
