Summary
의 항체 염색법
Abstract
Drosophila pupal의 복부는 상피 morphogenesis와 1-3 성적으로 동종 이형의 morphologies의 개발 연구를 위해 설립된 모델 시스템입니다. (25 ° C) 약 96시간에 걸쳐 pupation, 동안, imaginal 세포의 proliferating 인구는 성인 복부 세그먼트를 생성하는 애벌레 표피를 교체하십시오. 이러한 imaginal 세포는, embryogenesis 동안에 태어난 유충의 각 복부 세그먼트에서 histoblast의 둥지의 측면 쌍으로 존재합니다. histoblast의 둥지의 네 쌍은 성인 지느러미 표피 (앞쪽에 및 사후 지느러미 둥지), 복부 표피 (복부 둥지)와 각 세그먼트 (공기 구멍 둥지) 4과 관련된 spiracles을 일으키다. puparation되면 이러한 diploid 세포는 (큰 polyploid 애벌레 표피 세포 - LECs의 크기로 구별) 증식, 이주 및 LECs 교환의 틀에 박힌 절차를 시작합니다. 다양한 분자와 유전자 도구는 성인 복부의 morphogenesis에 관련된 유전자 경로의 기여를 조사하기 위해 고용 수 있습니다. 최고의 성인 phenotypes는 일반적으로 성인 복부 손톱의 아래의 절개를 분석하고 있습니다. 그러나, 근본적인 분자 과정의 조사 독특한 도전을 제시 pupal 상피의 immunohistochemical 분석을 필요로합니다. Temporally 동적 morphogenesis와 별개의 두 상피 인구 (애벌레와 imaginal)의 상호 작용은 절개와 후속 처리되는 동안 과도한 세포 손실하는 경향이 연약한 조직을 생성합니다. 우리는 해부, 고정, 장착 및 공촛점 또는 표준 형광 현미경에 적합한 일관성있는 고품질의 샘플을 생성 immunohistochemical 연구 Drosophila pupal의 abdominem의 상피의 이미지의 방법을 개발했습니다.
Protocol
1. 1 일
전에 시작 :
파리의 건강한 인구는 표준 culturing 프로토콜을 사용하여 유지되어야합니다 달걀 누워 개발 제 3 instar의 애벌레가 pupariation를 시작 방황 때까지 일정한 온도에서 진행하는 허용의 3~4일 후 병 또는 튜브에서 성인을 제거하십시오. 애벌레 / pupal 전환은 prepupae (0시간 번데기 형성 - APF 이후로 간주)의 형성에 의해 표시됩니다. 고정되어 pupae들은 흰색 착색에 의한 구형 pupae에서 아직 자신의 직사각형, 둥근 모양과 앞쪽에 spiracles의 돌출부에 의해 pupariation을 시작하지 않은 애벌레 구분할 수 있습니다.
당신이 필요합니다 :
- pupae를 수집하기 위해 페인트 브러시
- culturing의 pupae에 대한 습기 챔버 : 페트리 접시는 침수 종이 타월로 줄지어 있고 pupae의 수집, 유전자형이나 섹스의 다양한 시간 포인트 표시된 필터 종이로 덮여
- 1X 인산이 pupae를 세척을위한 식염수 (PBS)를 버퍼
수집, culturing 및 스테이징 pupae
- 침수 붓을를 사용하면 부드럽게 문화 병 / 유리병에서 0hr APF pupae를 제거하고 습기 챔버의 뚜껑에 배치합니다.
- 화필 및 1X PBS를 사용하면 부드럽게 번데기 케이스에서 파편을 제거하는 pupae을 씻어
- 필요한 정렬 섹스 pupae 경우. pupae의 생식선 primordia는 남녀를 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 남성 생식선의 primordia 쉽게 약 삼분의이 본문 5 길이 아래 pupal 표피를 통해 본 반투명 디스크 측면 쌍의 수 있습니다. 여성 생식선의 primordia 작은되며 쉽게 식별하지 않습니다.
- 습한 챔버에 적절하게 표시된 위치에 pupae을 놓고 일정 온도로 돌아갑니다. 적절한 발달 시점에 문화.
2. 주 2 : 해부, 고정 및 기본 항체 인큐베이션
전에 시작 :
당신이 필요합니다 :
- 해부의 stereomicroscope
- 외과 포셉
- 11 번 블레이드로 외과 메스
- 두 아홉 잘 유리 우울증 요리 (코닝 제품 # 7220-85)
- 1X PBS 한 접시의 우물을 채우기 : 이것은 해부 pupae 청소 rinsing 요리
- 고정 버퍼와 두번째 접시의 우물을 작성
- 항체 보육에 대한 습기 챔버. 우리는 침수 종이 타올로 늘어선 플라스틱 sealable 샌드위치 상자를 사용합니다.
- 고정 버퍼 : 1X PBS, 4 % paraformaldehyde, 0.2 % deoxycholic 산성 (permeabilization에 대한)
- 해부 플랫폼 : 한쪽으로 준수 양면 테이프 조각 맑은 현미경 슬라이드
- 1X PBS
- p100 또는 p200 pipettor
해부
- 포셉을 사용하면 부드럽게 한 번에 pupae 하나를 제거하고 테이프의 광범위한 너비를 직면하고있는 pupae의 앞쪽에 끝이 해부 플랫폼에서 그들을 놓으십시오. pupae이 지나치게 서부 유럽 표준시있다면, 먼저 그들을 종이 타월을 사용하여 건조 얼룩.
- pupae 완전히 테이프 준수 전에 그들을 위치로 붓을을 사용합니다.
- 공기 건조에 pupae 허용하고 테이프 (5-10 분)을 준수
- 수술 메스 양자 각 pupae을 해부하다. 이것은 가장 앞쪽에에서 pupae의 뒷부분 끝까지 하나의 신속한 상처로 수행됩니다. 정상적으로 완료하면, 상처는 앞쪽에 및 사후 모두 spiracles 쌍을 이등분합니다. 세정 빠르게 조직 proteolytic 손상을 방지하기 위해 필요한 샘플을 청소로 한 번에 10 개 이상 pupae을 해부하다.
- 붓을 사용하여 테이프에서 그들을 느슨하게 각 해부 pupae에 1X PBS의 작은 금액을 전송합니다.
청소, 고정 및 기본 항체 인큐베이션
- 외과 포셉 한 쌍이 anteriorly 개별 번데기의 절반을 파악하고 즉시 rinsing 요리의 잘에 젖어 함께. 해부 플랫폼은 현미경 무대에 rinsing 음식으로 대체해야합니다. 처리가 완료되고 샘플 장착을위한 준비가 될 때까지 pupae 케이스는 표본에 남아 있어야합니다.
- 아직 붙잡는 동안 번데기의 절반 부드럽게 복부의 내부 조직을 떠나 씻어 pipettor을 사용합니다. 세척하는 동안 너무 많은 압력이 상피 세포의 손실로 이어질 수 있습니다.
- 즉시 상온에서 고정 버퍼에 깨끗한 번데기의 절반을 전송 마찬가지로 남아있는 번데기의 절반을 처리합니다. 연습, 해부 20 번데기의 반쪽의 세척은 5 분도 채 안 걸릴한다로.
- pupae 1 (하나) 시간 실온에서 고정 버퍼에 품어 수 있습니다.
- 1X PBS에서 수정 pupae 배 오분을 씻어
- 샘플은 즉시 immunohistochemistry를 위해 처리될 수 있습니다 또는 최대 3 개월까지 셀 또는 에피토프 반응의 손실없이 -20 ° C에서 100 % 에탄올에 저장되어있을 수 있습니다.
- 샘플을 저장하려면, 희석을 통해 샘플을 평형PBS의 시리즈 : 전 100 % EtOH로 전송하기 위해 각 희석에 20 분 실온에서 EtOH (3시 1분, 1시 1분, 1시 3분).
- 샘플 immunohistochemistry에 대한 처리하기 전에 반대 시리즈를 통해 PBS에 다시 equilibrated해야합니다.
- 차 항체를 추가하기 전에 1 (하나) 시간 1X PBS (2 % 소 혈청 알부민과 보충)에서 샘플을 차단합니다.
- 4 박 이상의 1X PBS 적절한 농도로 희석 차 항체 ° 락을하지 않고도 C와 부화.
3. 3 일 : 보조 항체 보육, 장착 및 이미징
전에 시작 :
당신이 필요합니다 :
- 두 외과 포셉
- 마운트 미디어 (글리세롤, Vectashield [벡터 연구소] 또는 Slowfade 골드 [Invitrogen])
- 우울증 잘 현미경 슬라이드 (0.8 ㎜)
- Coverslips (24 X 40mm)
차 항체 보육 및 장착 :
- 샘플에게 배 십분 1X PBS로 각각 씻으십시오
- 이차 항체를 추가하기 전에 1 (하나) 시간 1X PBS (2 % 소 혈청 알부민과 보충)에서 샘플을 차단합니다.
- 3 (세) 시간 락을없이 어둠 속에서 실온에서 1X PBS 적절한 농도로 희석 차 항체와 부화.
- 샘플에게 배 십분 1X PBS로 각각 씻으십시오
- 적절한 경우, counterstain pupae (우리는 DAPI로 핵을 얼룩 예제 [4 ', 6 diamidino - 2 - phenylindole] 10 분 동안 PBS에 희석).
- 장착하기 전에 적절한 미디어에 샘플을 (30 분 최소) 평형.
- 샘플 슬라이드를 준비합니다. pupae의 형태 플랫 장착을 방지합니다. 샘플은 이미지에 대한 우울증 슬라이드 (드롭 슬라이드)의 우물에 탑재하고 있습니다. 장소 잘 우울증에 장착 미디어 75 100ul. 여러 샘플은 단일 슬라이드에 장착할 수 있습니다.
- 번데기의 경우는 설치하기 전에 샘플에서 제거되어야합니다. anteriorly 내부 pupal 멤브레인 파악하지 않도록하는 개인 번데기 케이스를 파악.
- 포셉의 두 번째 쌍의로 부드럽게 머리에 의해 내부 pupal 멤브레인을 파악하고 pupal 케이스에서 제거합니다.
- 즉시 잘 우울증에 샘플을 전송 및 추가 샘플 처리를 계속합니다.
- 우울증에 잘 측면 표면이 위로 향하게와 샘플 균일 프로브 또는 포셉 위치를 사용합니다. 가끔 공기 방울은 프로브와 함께 제거할 수 있습니다.
- 부드럽게 공기 방울을 소개 않도록주의하면서 시료로 coverslip을 낮출
4. 대표 결과 :
샘플이 프로토콜은 성인 복부의 매출 형태를 유지를 사용하여 준비 하였다. 이미지 스택은 복부 토폴로지를 조사하기 위해 적용될 수 2 차원 이미지를 3 - D 렌더링을 생성할 것으로 예상됩니다.
그림 1. Drosophila pupae의 세그먼트 유전자 제품 날지 못하는 단백질과 Engrailed 표현 (EN - gal4 : uas - GFP)은. : 및 안티 GFP 마우스 방지 WG (아이오와 하이 브리 도마 은행 4D4)와 번데기 형성 후 26시간 (APF)에 시각되었습니다. 10X 배율은 앞쪽에 남아 있으며, 지느러미가있다. Nucleii는 DAPI로 counterstained되었습니다.
약 50 이미지 (슬라이스 사이 ΔZ는 2.5μm이다)의 스택은 예상했다.
Discussion
이 비디오에 제시된 기술은 발달 시간 포인트의 다양한 Drosophila pupae를 준비하는 데 사용할 수 있습니다. 32시간 24 시간의 기간 동안 APF 처리 Pupae는 APF 상피에서 세포의 손실을 가장 쉽습니다. 확장 부화 단계 동안 세제의 사용 (예 : 트리톤 X - 100과 십대 초반 - 20 등) 셀 손실의 가능성을 증가하기 때문에 권장하지 않습니다. 오히려, deoxycholic 산성은 초기 고정 단계에서 세제로 사용됩니다. 모든 후속 단계는 세제없이 1X PBS에서 수행됩니다. 또한, 확장 부화 단계 중에 샘플을 출렁 이는 것은 셀 손실을 증가하고 피해야한다.
샘플은 공촛점 현미경 기술을 이용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 그러나, Drosophila pupae과 같이 설명 처리도 공촛점 기술에 비해 이미지 품질을 항복 구조 조명 현미경 시스템을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection stereomicroscope | |||
| Surgical forceps | |||
| Surgical scalpel with number 11 blades | |||
| Nine-well glass depression dishes | Corning | 7220-85 | |
| Humid chamber for culturing pupae | |||
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| #11 surgical scalpel | |||
| double-sided tape | |||
| Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization) | |||
| p100 or p200 pipettor | |||
| Depression well microscope slides (0.8 mm) |
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
